TY - JOUR A1 - Kunz, Tobias C. A1 - Götz, Ralph A1 - Sauer, Markus A1 - Rudel, Thomas T1 - Detection of chlamydia developmental forms and secreted effectors by expansion microscopy JF - Frontiers in Cellular and Infection Microbiology N2 - Expansion microscopy (ExM) is a novel tool to improve the resolution of fluorescence-based microscopy that has not yet been used to visualize intracellular pathogens. Here we show the expansion of the intracellular pathogen Chlamydia trachomatis, enabling to differentiate its two distinct forms, catabolic active reticulate bodies (RB) and infectious elementary bodies (EB), on a conventional confocal microscope. We show that ExM enables the possibility to precisely locate chlamydial effector proteins, such as CPAF or Cdu1, within and outside of the chlamydial inclusion. Thus, we claim that ExM offers the possibility to address a broad range of questions and may be useful for further research on various intracellular pathogens. KW - expansion microscopy KW - chlamydia KW - secreted effectors KW - developmental forms KW - superresolution KW - imaging Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-195716 SN - 2235-2988 VL - 9 IS - 276 ER - TY - THES A1 - Yu, Sung-Huan T1 - Development and application of computational tools for RNA-Seq based transcriptome annotations T1 - Entwicklung und Anwendung bioinformatischer Werkzeuge für RNA-Seq-basierte Transkriptom-Annotationen N2 - In order to understand the regulation of gene expression in organisms, precise genome annotation is essential. In recent years, RNA-Seq has become a potent method for generating and improving genome annotations. However, this Approach is time consuming and often inconsistently performed when done manually. In particular, the discovery of non-coding RNAs benefits strongly from the application of RNA-Seq data but requires significant amounts of expert knowledge and is labor-intensive. As a part of my doctoral study, I developed a modular tool called ANNOgesic that can detect numerous transcribed genomic features, including non-coding RNAs, based on RNA-Seq data in a precise and automatic fashion with a focus on bacterial and achaeal species. The software performs numerous analyses and generates several visualizations. It can generate annotations of high-Resolution that are hard to produce using traditional annotation tools that are based only on genome sequences. ANNOgesic can detect numerous novel genomic Features like UTR-derived small non-coding RNAs for which no other tool has been developed before. ANNOgesic is available under an open source license (ISCL) at https://github.com/Sung-Huan/ANNOgesic. My doctoral work not only includes the development of ANNOgesic but also its application to annotate the transcriptome of Staphylococcus aureus HG003 - a strain which has been a insightful model in infection biology. Despite its potential as a model, a complete genome sequence and annotations have been lacking for HG003. In order to fill this gap, the annotations of this strain, including sRNAs and their functions, were generated using ANNOgesic by analyzing differential RNA-Seq data from 14 different samples (two media conditions with seven time points), as well as RNA-Seq data generated after transcript fragmentation. ANNOgesic was also applied to annotate several bacterial and archaeal genomes, and as part of this its high performance was demonstrated. In summary, ANNOgesic is a powerful computational tool for RNA-Seq based annotations and has been successfully applied to several species. N2 - Exakte Genomannotationen sind essentiell für das Verständnis Genexpressionsregulation in verschiedenen Organismen. In den letzten Jahren entwickelte sich RNA-Seq zu einer äußerst wirksamen Methode, um solche Genomannotationen zu erstellen und zu verbessern. Allerdings ist das Erstellen von Genomannotationen bei manueller Durchführung noch immer ein zeitaufwändiger und inkonsistenter Prozess. Die Verwendung von RNA-Seq-Daten begünstigt besonders die Identifizierung von nichtkodierenden RNAs, was allerdings arbeitsintensiv ist und fundiertes Expertenwissen erfordert. Ein Teil meiner Promotion bestand aus der Entwicklung eines modularen Tools namens ANNOgesic, das basierend auf RNA-Seq-Daten in der Lage ist, eine Vielzahl von Genombestandteilen, einschließlich nicht-kodierender RNAs, automatisch und präzise zu ermitteln. Das Hauptaugenmerk lag dabei auf der Anwendbarkeit für bakterielle und archaeale Genome. Die Software führt eine Vielzahl von Analysen durch und stellt die verschiedenen Ergebnisse grafisch dar. Sie generiert hochpräzise Annotationen, die nicht unter Verwendung herkömmlicher Annotations-Tools auf Basis von Genomsequenzen erzeugt werden könnten. Es kann eine Vielzahl neuer Genombestandteile, wie kleine nicht-kodierende RNAs in UTRs, ermitteln, welche von bisherigen Programme nicht vorhergesagt werden können. ANNOgesic ist unter einer Open-Source-Lizenz (ISCL) auf https://github.com/Sung-Huan/ANNOgesic verfügbar. Meine Forschungsarbeit beinhaltet nicht nur die Entwicklung von ANNOgesic, sondern auch dessen Anwendung um das Transkriptom des Staphylococcus aureus-Stamms HG003 zu annotieren. Dieser ist einem Derivat von S. aureus NCTC8325 - ein Stamm, Dear ein bedeutendes Modell in der Infektionsbiologie darstellt. Zum Beispiel wurde er für die Untersuchung von Antibiotikaresistenzen genutzt, da er anfällig für alle bekannten Antibiotika ist. Der Elternstamm NCTC8325 besitzt zwei Mutationen im regulatorischen Genen (rsbU und tcaR), die Veränderungen der Virulenz zur Folge haben und die in Stamm HG003 auf die Wildtypsequenz zurückmutiert wurden. Dadurch besitzt S. aureus HG003 das vollständige, ursprüngliche Regulationsnetzwerk und stellt deshalb ein besseres Modell zur Untersuchung von sowohl Virulenz als auch Antibiotikaresistenz dar. Trotz seines Modellcharakters fehlten für HG003 bisher eine vollständige Genomsequenz und deren Annotationen. Um diese Lücke zu schließen habe ich als Teil meiner Promotion mit Hilfe von ANNOgesic Annotationen für diesen Stamm, einschließlich sRNAs und ihrer Funktionen, generiert. Dafür habe ich Differential RNA-Seq-Daten von 14 verschiedenen Proben (zwei Mediumsbedingungen mit sieben Zeitpunkten) sowie RNA-Seq-Daten, die von fragmentierten Transkripten generiert wurden, analysiert. Neben S. aureus HG003 wurde ANNOgesic auf eine Vielzahl von Bakterien- und Archaeengenome angewendet und dabei wurde eine hohe Performanz demonstriert. Zusammenfassend kann gesagt werden, dass ANNOgesic ein mächtiges bioinformatisches Werkzeug für die RNA-Seq-basierte Annotationen ist und für verschiedene Spezies erfolgreich angewandt wurde. KW - RNA-Seq KW - Genome Annotation KW - small RNA KW - Genom KW - Annotation KW - Small RNA KW - Bioinformatik Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-176468 ER - TY - THES A1 - Kreß, Sebastian T1 - Development and proof of concept of a biological vascularized cell‐based drug delivery system T1 - Entwicklung und Proof of Concept eines biologischen, vaskularisierten, zellbasierten Drug‐Delivery‐Systems N2 - A major therapeutic challenge is the increasing incidence of chronic disorders. The persistent impairment or loss of tissue function requires constitutive on‐demand drug availability optimally achieved by a drug delivery system ideally directly connected to the blood circulation of the patient. However, despite the efforts and achievements in cell‐based therapies and the generation of complex and customized cell‐specific microenvironments, the generation of functional tissue is still unaccomplished. This study demonstrates the capability to generate a vascularized platform technology to potentially overcome the supply restraints for graft development and clinical application with immediate anastomosis to the blood circulation. The ability to decellularize segments of the rat intestine while preserving the ECM for subsequent reendothelialization was proven. The reestablishment of a functional arteriovenous perfusion circuit enabled the supply of co‐cultured cells capable to replace the function of damaged tissue or to serve as a drug delivery system. During in vitro studies, the applicability of the developed miniaturized biological vascularized scaffold (mBioVaSc‐TERM®) was demonstrated. While indicating promising results in short term in vivo studies, long term implantations revealed current limitations for the translation into clinical application. The gained insights will impact further improvements of quality and performance of this promising platform technology for future regenerative therapies. N2 - Eine kontinuierlich steigende Inzidenz chronischer Krankheiten stellt eine immer größer werdende therapeutische Herausforderung dar. Der anhaltende Funktionsverlust von Geweben erfordert die bedarfsgerechte Verfügbarkeit von Wirkstoffen, deren kontinuierliche Bereitstellung und Verteilung über die Blutzirkulation von implantierbaren Pharmakotherapie‐Produkten gelöst werden kann. Trotz der Fortschritte und Erfolge mit Zelltherapien sowie der Nachbildung der Zell‐eigenen Nischen konnten bisher noch keine funktionellen Gewebe für die medizinische Anwendbarkeit hergestellt werden. Diese Studie zeigt die Möglichkeit zur Herstellung einer vaskularisierten Plattform‐ Technologie um die Beschränkung der Nährstoff‐Versorgung zu überwinden für die Entwicklung von Transplantaten für die klinische Anwendung und deren sofortige Anastomose an die Blutzirkulation. Die Möglichkeit Rattendarmsegmente zu dezellularisieren, die Extrazellulärmatrix und das interne Gefäßsystem dabei jedoch zu erhalten um diese Strukturen wiederzubesiedeln wurde bewiesen. Das Wiederherstellen des funktionellen arteriovenösen Perfusionskreislaufs ermöglichte die Versorgung von Ko‐kultivierten Zellen um damit funktionalen Gewebeersatz bzw. ‐modelle aufzubauen oder als Medizin‐ Produkt Einsatz zu finden. In vitro‐Studien zeigten eindrucksvoll Reife und Anwendbarkeit des hier entwickelten miniaturisierten, biologischen, vaskularisierten Scaffold (mBioVaSc‐TERM®). Während in in vivo‐Studien zunächst vielversprechende Ergebnisse erzielt wurden, zeigten Langzeit Implantationen die aktuellen Grenzen zur Translation in die klinische Anwendung. Die gewonnenen Erkenntnisse werden dazu dienen Qualität und Funktionalität dieser vielversprechenden Plattform‐Technologie zu verbessern um zukünftige regenerative Therapien zu ermöglichen. KW - Vaskularisation KW - Dezellularisierung KW - Tissue Engineering KW - Therapeutisches System KW - Implantat KW - Vascularized KW - drug delivery Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-178650 ER - TY - THES A1 - Rücker, Christoph T1 - Development of a prevascularized bone implant T1 - Entwicklung eines prävaskularisierten Knochenimplantats N2 - The skeletal system forms the mechanical structure of the body and consists of bone, which is hard connective tissue. The tasks the skeleton and bones take over are of mechanical, metabolic and synthetic nature. Lastly, bones enable the production of blood cells by housing the bone marrow. Bone has a scarless self-healing capacity to a certain degree. Injuries exceeding this capacity caused by trauma, surgical removal of infected or tumoral bone or as a result from treatment-related osteonecrosis, will not heal. Critical size bone defects that will not heal by themselves are still object of comprehensive clinical investigation. The conventional treatments often result in therapies including burdening methods as for example the harvesting of autologous bone material. The aim of this thesis was the creation of a prevascularized bone implant employing minimally invasive methods in order to minimize inconvenience for patients and surgical site morbidity. The basis for the implant was a decellularized, naturally derived vascular scaffold (BioVaSc-TERM®) providing functional vessel structures after reseeding with autologous endothelial cells. The bone compartment was built by the combination of the aforementioned scaffold with synthetic β-tricalcium phosphate. In vitro culture for tissue maturation was performed using bioreactor technology before the testing of the regenerative potential of the implant in large animal experiments in sheep. A tibia defect was treated without the anastomosis of the implant’s innate vasculature to the host’s circulatory system and in a second study, with anastomosis of the vessel system in a mandibular defect. While the non-anastomosed implant revealed a mostly osteoconductive effect, the implants that were anastomosed achieved formation of bony islands evenly distributed over the defect. In order to prepare preconditions for a rapid approval of an implant making use of this vascularization strategy, the manufacturing of the BioVaSc-TERM® as vascularizing scaffold was adjusted to GMP requirements. N2 - Das Skelett bildet die mechanische Struktur des Körpers und besteht aus Knochen, einem harten Bindegewebe. Knochen übernehmen mechanische, metabolische und synthetische Aufgaben. Schlussendlich ermöglichen Knochen die Synthese von Blutzellen durch die Beherbergung des Knochenmarks. Wird die Heilungskapazität von Knochen durch Trauma, operative Entfernung von infiziertem oder tumorösem Knochen oder als Ergebnis behandlungsbedingter Osteonekrose, überschritten, findet keine vollständige Heilung statt. Knochendefekte, die eine kritische Größe überschreiten, sind daher immer noch Gegenstand umfangreicher, klinischer Forschung. Bei herkömmlichen Behandlungsmethoden können Eingriffe notwendig werden, die den Patienten belasten, wie bei der Gewinnung von autologem Knochenmaterial. Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Herstellung eines prävaskularisierten Implantats unter Verwendung minimalinvasiver Methoden, um die Belastung von Patienten und die Morbidität an der Entnahmestelle, zu verringern. Zur Herstellung eines vaskularisierten Implantats bildete ein dezellularisiertes Darmsegment (Jejunum) porcinen Ursprungs die Grundlage (BioVasc-TERM®). Diese Trägerstruktur stellte ein funktionales Blutgefäßsystem nach Wiederbesiedelung mit autologen Endothelzellen bereit. Der Knochenanteil des Implantats wurde durch die Kombination der genannten Trägerstruktur mit dem synthetischen Knochenersatzmaterial β-Tricalciumphosphat gebildet. In-vitro-Kultivierung in einem Bioreaktor führte zur Reifung des Implantats vor der Testung seines Potenzials zur Knochenregeneration in Großtierversuchen bei Schafen. Ein Tibiadefekt wurde behandelt ohne die Anastomose des implantateigenen Gefäßsystems an den Blutkreislauf und ein Mandibeldefekt wurde mit Gefäßanschluss behandelt. Das Implantat ohne Gefäßanschluss hatte einen osteokonduktiven Effekt, während das anastomosierte Implantat zur Bildung zahlreicher Knocheninseln, gleichmäßig über den Defekt verteilt, führte. Um eine zügige Zulassung eines Implantats, das diese Strategie zur Vaskularisierung von Knochen nutzt, zu ermöglichen, wurde die Herstellung der BioVaSc-TERM® an die Vorgaben der Guten Herstellungspraxis angepasst. KW - Tissue Engineering KW - Knochenregeneration KW - Regenerative Medizin KW - Angiogenese KW - Implantat KW - bone KW - implant KW - Knochenimplantat KW - Vaskularisierung Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-178869 ER - TY - THES A1 - Hell, Dennis T1 - Development of self-adjusting cytokine neutralizer cells as a closed-loop delivery system of anti-inflammatory biologicals T1 - Entwicklung von selbstregulierenden Zytokin-Neutralisierer-Zellen als Closed-Loop Abgabesystem von anti-inflammatorischen Biologikals N2 - The current treatment strategies for diseases are assessed on the basis of diagnosed phenotypic changes due to an accumulation of asymptomatic events in physiological processes. Since a diagnosis can only be established at advanced stages of the disease, mainly due to insufficient early detection possibilities of physiological disorders, doctors are forced to treat diseases rather than prevent them. Therefore, it is desirable to link future therapeutic interventions to the early detection of physiological changes. So-called sensor-effector systems are designed to recognise disease-specific biomarkers and coordinate the production and delivery of therapeutic factors in an autonomous and automated manner. Such approaches and their development are being researched and promoted by the discipline of synthetic biology, among others. Against this background, this paper focuses on the in vitro design of cytokine-neutralizing sensor-effector cells designed for the potential treatment of recurrent autoimmune diseases, especially rheumatoid arthritis. The precise control of inducible gene expression was successfully generated in human cells. At first, a NF-κB-dependent promoter was developed, based on HIV-1 derived DNA-binding motives. The activation of this triggerable promoter was investigated using several inducers including the physiologically important NF-κB inducers tumor necrosis factor alpha (TNFα) and interleukin 1 beta (IL-1β). The activation strength of the NF-κB-triggered promoter was doubled by integrating a non-coding RNA. The latter combined expressed RNA structures, which mimic DNA by double stranded RNAs and have been demonstrated to bind to p50 or p65 by previous publications. The sensitivity was investigated for TNFα and IL-1β. The detection limit and the EC50 values were in in the lower picomolar range. Besides the sensitivity, the reversibility and dynamic of the inducible system were characterized. Hereby a close correlation between pulse times and expression profile was shown. The optimized NF-κB-dependent promoter was then coupled to established TNFα- and IL-1-blocking biologicals to develop sensor-effector systems with anti-inflammatory activity, and thus potential use against autoimmune diseases such as rheumatoid arthritis. The biologicals were differentiated between ligand-blocking and receptor-blocking biologicals and different variants were selected: Adalimumab, etanercept and anakinra. The non-coding RNA improved again the activation strength of NF-κB-dependent expressed biologicals, indicating its universal benefit. Furthermore, it was shown that the TNFα-induced expression of NF-κB-regulated TNFα-blocking biologics led to an extracellular negative feedback loop. Interestingly, the integration of the non-coding RNA and this negative feedback loop has increased the dynamics and reversibility of the NF-κB-regulated gene expression. The controllability of drug release can also be extended by the use of inhibitors of classical NF-κB signalling such as TPCA-1. The efficacy of the expressed biologicals was detected through neutralization of the cytokines using different experiments. For future in vivo trials, first alginate encapsulations of the cells were performed. Furthermore, the activation of NF-κB-dependent promoter was demonstrated using co-cultures with human plasma samples or using synovial liquids. With this generated sensor-effector system we have developed self-adjusting cytokine neutralizer cells as a closed-loop delivery system for anit-inflammatory biologics. N2 - Die derzeitig üblichen Behandlungsstrategien von Krankheiten werden auf Basis diagnostizierter phänotypischer Veränderungen erhoben, die auf eine Ansammlung asymptomatischer Ereignisse in physiologischen Vorgängen zurückzuführen sind. Da die Feststellung einer Diagnose bislang erst in fortgeschrittenen Krankheitsstadien, vor allem aufgrund unzureichender Früherkennungsmöglichkeiten von physiologischen Störungen, erfolgen kann, sehen sich Ärzte gezwungen, Krankheiten vornehmlich zu behandeln anstatt ihnen vorzubeugen. Daher ist es erstrebenswert, wenn zukünftige therapeutische Interventionen bereits an die Früherkennung von physiologischen Veränderungen gekoppelt werden könnten. Sogenannte Sensor-Effektor Systeme sollen krankheitsspezifische Biomarker erkennen und die Produktion und Bereitstellung von therapeutischen Faktoren in einer selbstständigen und automatisierten Art und Weise koordinieren. Solche Ansätze und deren Entwicklung werden unter anderem durch die Disziplin der synthetischen Biologie erforscht und vorangetrieben. Die vorliegende Arbeit konzentriert sich vor diesem Hintergrund auf das in vitro Design von Zytokin-neutralisierenden Sensor-Effektor Zellen, die für die potentielle Behandlung wiederkehrender Autoimmunerkrankungen, insbesondere der rheumatoiden Arthritis, konstruiert wurden. Die gezielte Ansteuerung zur induzierbaren Genexpression konnte in humanen Zellen erfolgreich generiert werden. In der vorliegenden Arbeit wurde zunächst ein NF-κB abhängiger Promoter zur induzierbaren Genexpression auf der Grundlage von HIV-1 abgleitenden DNA-Bindemotiven entwickelt. Die Aktivierbarkeit dieses Promoters wurde durch verschiedene Induktoren, insbesondere auch durch die physiologisch wichtigen NF-κB Aktivatoren Tumornekrosefaktor alpha (TNFα) und Interleukin 1 beta (IL-1β) überprüft. Die Aktivierungsstärke des NF-κB abhängigen Promoters wurde durch die Integration einer nicht-kodierenden RNA verdoppelt. Diese RNA kombiniert Strukturelemente, die im RNA-Doppelstrang DNA-Strukturen imitieren, und für die in Vorarbeiten die Bindung an p50 oder p65 nachgewiesen werden konnten. Für TNFα und IL-1β lagen das Detektionslimit und die EC50 Werte der NF-κB getriggerten Genexpression im unteren pikomolaren Bereich. Neben der Sensitivität wurde das induzierbare System bezüglich seiner Reversibilität und Dynamik charakterisiert. Dabei konnte eine enge Korrelation zwischen Pulszeiten und Expressionsmustern aufgezeigt werden. Ferner wurde der NF-κB abhängige Promoter an etablierte TNFα- und IL-1-blockierende Biologicals gekoppelt, um Sensor-Effektor Systeme mit anti-entzündlicher Aktivität zu erhalten, die potentiell zur Behandlung von Autoimmunerkrankungen, wie beispielsweise der rheumatoiden Arthritis, eingesetzt werden könnten. Bei den Biologicals wurde zwischen Ligand-blockierenden und Rezeptor-blockierenden Biologicals differenziert und unterschiedliche Varianten ausgewählt: Adalimumab, Etanercept und Anakinra. Erneut verbesserte die zusätzliche Integration der nicht-kodierenden RNA die Aktivierungsstärke der NF-κB abhängig exprimierten Biologicals, das die universelle Nutzbarkeit des hier entwickelten optimierten NF-κB-Promoters unterstreicht. Ferner wurde gezeigt, dass die TNFα-induzierte Expression von NF-κB-regulierten TNFα-blockierenden Biologika zu einem extrazellulären negativen Feedback Loop führte. Interessanterweise hat die Integration der nicht-kodierender RNA und dieser negative Feedback Loop die Dynamik und Reversibilität der NF-κB-regulierten Genexpression erhöht. Die Kontrollierbarkeit der Wirkstoffabgabe kann zudem durch den Einsatz von Inhibitoren der klassischen NF-κB-Signalisierung wie z.B. TPCA-1 erweitert werden. Die Wirksamkeit der exprimierten Biologicals wurde durch Neutralisation der Zytokine in verschiedenen Experimenten nachgewiesen. Für zukünftige in vivo Versuche konnten erste Alginat-Verkapselungen der Zellen durchgeführt werden. Die Aktivierbarkeit des NF-κB abhängigen Promoters wurde ferner durch Ko-Kultivierung mit humanen Plasmaproben und Synovialflüssigkeiten nachgewiesen. Mit diesem generierten Sensor-Effektor-System haben wir selbstregulierende Zytokin-Neutralisierer-Zellen als Closed-Loop Abgabesystem von anit-inflammatorischen Biologikals entwickelt. KW - cell therapy KW - synthetic biology KW - designer cell KW - suppressor cells KW - closed-loop systems KW - autoimmune disease KW - rheumatoid arthritis KW - gene network KW - adalimumab KW - enbrel KW - etanercept KW - anakinra KW - Biologika KW - Autoaggressionskrankheit KW - Cytokine KW - in vitro Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-175381 ER - TY - THES A1 - Sauer, Markus T1 - DHX36 function in RNA G-quadruplex-mediated posttranscriptional gene regulation T1 - Funktion von DHX36 in RNA G-Quadruplex-vermittelter posttranskriptioneller Genregulierung N2 - The expression of genetic information into proteins is a key aspect of life. The efficient and exact regulation of this process is essential for the cell to produce the correct amounts of these effector molecules to a given situation. For this purpose, eukaryotic cells have developed many different levels of transcriptional and posttranscriptional gene regulation. These mechanisms themselves heavily rely on interactions of proteins with associated nucleic acids. In the case of posttranscriptional gene regulation an orchestrated interplay between RNA-binding proteins, messenger RNAs (mRNA), and non-coding RNAs is compulsory to achieve this important function. A pivotal factor hereby are RNA secondary structures. One of the most stable and diverse representatives is the G-quadruplex structure (G4) implicated in many cellular mechanisms, such as mRNA processing and translation. In protein biosynthesis, G4s often act as obstacles but can also assist in this process. However, their presence has to be tightly regulated, a task which is often fulfilled by helicases. One of the best characterized G4-resolving factors is the DEAH-box protein DHX36. The in vitro function of this helicase is extensively described and individual reports aimed to address diverse cellular functions as well. Nevertheless, a comprehensive and systems-wide study on the function of this specific helicase was missing, so far. The here-presented doctoral thesis provides a detailed view on the global cellular function of DHX36. The binding sites of this helicase were defined in a transcriptome-wide manner, a consensus binding motif was deviated, and RNA targets as well as the effect this helicase exerts on them were examined. In human embryonic kidney cells, DHX36 is a mainly cytoplasmic protein preferentially binding to G-rich and G4-forming sequence motifs on more than 4,500 mRNAs. Loss of DHX36 leads to increased target mRNA levels whereas ribosome occupancy on and protein output of these transcripts are reduced. Furthermore, DHX36 knockout leads to higher RNA G4 levels and concomitant stress reactions in the cell. I hypothesize that, upon loss of this helicase, translationally-incompetent structured DHX36 target mRNAs, prone to localize in stress granules, accumulate in the cell. The cell reacts with basal stress to avoid cytotoxic effects produced by these mis-regulated and structured transcripts. N2 - Die Umsetzung genetischer Information in Proteine stellt einen Schlüsselaspekt des Lebens dar. Dabei ist die effiziente und exakte Regulierung dieses Prozesses für die Zelle essentiell, um die korrekte Menge dieser Effektormoleküle in einer gegebenen Situation zu produzieren. Zu diesem Zweck haben eukaryotische Zellen viele verschiedene Ebenen der transkriptionellen und posttranskriptionellen Genregulation entwickelt. Diese Mechanismen wiederum beruhen insbesondere auf den Interaktionen von Proteinen mit assoziierten Nukleinsäuren. Im Fall der posttranskriptionellen Genregulation ist ein abgestimmtes Wechselspiel zwischen RNA-bindenden Proteinen, Boten-RNAs und nicht-kodierenden RNAs zwingend erforderlich um diese wichtige Funktion zu erfüllen. Ein zentrales Element hierbei bilden RNA-Sekundärstrukturen. Einer der stabilsten und variantenreichsten Vertreter dieser Strukturen ist die G-Quadruplexstruktur (G4), die in vielen zellulären Mechanismen, wie zum Beispiel Prozessierung und Translation der Boten-RNA, involviert ist. Während der Proteinbiosynthese agieren G4s häufig als Hindernisse, können diesen Prozess allerdings auch unterstützen. In beiden Fällen muss deren Präsenz genau reguliert werden, was häufig durch Helikasen erfolgt. Einer der bestcharakterisiertesten, G4-entwindenden Faktoren ist das DEAH-Box Protein DHX36. Die in vitro Funktion dieser Helikase wurde bereits ausführlich beschrieben und einzelne Berichte haben darüber hinaus versucht, ihr verschiedene Funktionen in der Zelle zuzuweisen. Nichtsdestotrotz fehlt bislang eine umfassende und systemweite Studie zur Funktion dieser speziellen Helikase. Die hier präsentierte Doktorarbeit liefert einen detaillierten Blick auf die globale Funktion von DHX36 in der Zelle. Bindestellen dieser Helikase im Transkriptom wurden definiert, ein allgemeines Bindemotiv abgeleitet und RNA-Bindeziele sowie der Effekt, den diese Helikase auf jene ausübt, untersucht. In humanen embryonalen Nierenzellen ist DHX36 ein vorwiegend zytoplasmatisches Protein, das bevorzugt G-reiche und G4-bildende Sequenzmotive auf über 4.500 Boten-RNAs bindet. Verlust von DHX36 führt zu einem erhöhten Level dieser Boten-RNAs in der Zelle, wobei deren Besetzung mit Ribosomen und die damit verbundene Proteinproduktion reduziert ist. Weiterhin führt der Verlust von DHX36 zu einem höheren RNA G4 Level und zu gleichzeitigen Stressreaktionen in der Zelle. Meine Vermutung ist, dass sich bei einem Verlust von DHX36 translationsinkompetente, strukturierte und leicht akkumulierende Ziel-Boten-RNAs in der Zelle anreichern. Die Zelle reagiert darauf mit basalem Stress um zytotoxische Effekte dieser miss-regulierten und strukturierten Transkripte zu vermeiden. KW - RNS KW - Helicasen KW - Genexpression KW - RNA secondary structures KW - G-quadruplex KW - RNA protein interactions Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-183954 ER - TY - JOUR A1 - Sauer, Markus A1 - Juranek, Stefan A. A1 - Marks, James A1 - De Magis, Alessio A1 - Kazemier, Hinke G A1 - Hilbig, Daniel A1 - Benhalevy, Daniel A1 - Wang, Xiantao A1 - Hafner, Markus A1 - Paeschke, Katrin T1 - DHX36 prevents the accumulation of translationally inactive mRNAs with G4-structures in untranslated regions JF - Nature Communications N2 - Translation efficiency can be affected by mRNA stability and secondary structures, including G-quadruplex structures (G4s). The highly conserved DEAH-box helicase DHX36/RHAU resolves G4s on DNA and RNA in vitro, however a systems-wide analysis of DHX36 targets and function is lacking. We map globally DHX36 binding to RNA in human cell lines and find it preferentially interacting with G-rich and G4-forming sequences on more than 4500 mRNAs. While DHX36 knockout (KO) results in a significant increase in target mRNA abundance, ribosome occupancy and protein output from these targets decrease, suggesting that they were rendered translationally incompetent. Considering that DHX36 targets, harboring G4s, preferentially localize in stress granules, and that DHX36 KO results in increased SG formation and protein kinase R (PKR/EIF2AK2) phosphorylation, we speculate that DHX36 is involved in resolution of rG4 induced cellular stress. KW - RNA metabolism KW - Translation Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-227486 VL - 10 IS - 2421 ER - TY - THES A1 - Füllsack, Simone Alexandra T1 - Die Bedeutung von Todesdomäne Adapterproteinen für die Signaltransduktion des TNFR1 und der TRAIL Todesrezeptoren T1 - The meaning of death domain adaptor proteins in the signal transduction of TNFR1 and TRAIL death receptors N2 - Die NFκB-Signalwege, Apoptose und Nekroptose sind essentielle Prozesse in der Immunantwort. Außerdem sind diese Signalwege Teil der Regulation von Zelldifferenzierung, -proliferation, -tod und Entzündungsreaktionen. Dabei wird zuerst der Rezeptor (TNFR1 oder TRAILR 1/2) aktiviert, die rekrutierten DD-Adapterproteine TRADD, FADD und RIPK1 leiten dann die entsprechende Signalkaskade weiter und bestimmen durch ihre Zusammenwirkung, ob der NFκB-Signalweg, Apoptose oder Nekroptose induziert wird. TNFR1 und TRAILR 1/2 benötigen die DD-Adapterproteine TRADD, FADD und RIPK1 für die Zelltodinduktion, deren konkrete Bedeutung in Bezug auf Rezeptor-Spezifität, Zusammenwirken und Relevanz allerdings noch unklar ist. Um das Zusammenspiel dieser Proteine besser zu verstehen, wurden in dieser Arbeit Nekroptose-kompetente RIPK3-exprimierende HeLa-Zellen verwendet, bei denen die DD-Adapterproteine FADD, TRADD und RIPK1 einzeln oder in Kombination von zweien ausgeknockt wurden. Es stellte sich heraus, dass RIPK1 essentiell für die TNFR1- und TRAILR 1/2-vermittelte Nekroptose-Induktion ist, doch RIPK1 alleine, d.h. ohne FADD- oder TRADD-Mitbeteiligung, nur bei der TNFR1-Nekroptose-Induktion ausreicht. Wiederum inhibiert TRADD die TNFR1- und TRAILR 1/2-induzierte Nekroptose. RIPK1 und TRADD sind aber unverzichtbar für die NFκB-Aktivierung durch TNFR1 oder TRAILR 1/2 und spielen eine wichtige Rolle bei TNFR1-induzierter Apoptose. Andererseits ist FADD alleine ausreichend für die TRAILR 1/2-bezogene Caspase-8 Aktivierung. Zudem ist FADD notwendig für die TRAIL-induzierte NFκB-Signalaktivierung. In Abwesenheit von FADD und TRADD vermittelt RIPK1 die TNF-induzierte Caspase-8 Aktivierung. FADD wird für die TRAIL-induzierte Nekroptose benötigt, aber gegenläufig wirkt die TNF-induzierte Nektroptose in einer Caspase-8 abhängigen und unabhängigen Weise. Zudem sensitiviert TWEAK die TNF- und TRAIL-induzierte Nekroptose. Zusammenfassend wurde in dieser Arbeit die Auswirkung von TNFR1 und TRAILR 1/2 auf die Aktivierung der unterschiedlichen Signalkaskaden untersucht. Des Weiteren wurde gezeigt, in welcher Weise sich das Zusammenspiel von TRADD, FADD und RIPK1 auf die Induktion von NFκB, Apoptose und Nekroptose auswirkt. N2 - The NFκB-pathways, apoptosis and necroptosis are basic components of the immune response. Furthermore, they are involved in the regulation of cell differentiation, proliferation, cell death and inflammation. After the receptor (TNFR1 or TRAILR1/2) is activated, the recruited DD-adapter proteins TRADD, FADD and RIPK1 transmit the signal thereby determining whether NFκB-pathways, apoptosis and necroptosis are induced. TNFR1 and TRAIL 1/2 depend on the DD-adapter proteins TRADD, FADD and RIPK1 for cell death induction and inflammatory signaling. However, the precise role of these molecules is poorly understood, especially with respect to receptor-specific, cooperative and redundant activities. In order to elucidate the interdependencies of these proteins, variants of the necroptosis competent RIPK3-expressing HeLa transfectant lacking expression of TRADD, RIPK1 and FADD or any combination of two of these molecules were generated and evaluated with respect to TNF- and TRAIL-induced signaling. It turned out that RIPK1 is essential for necroptosis induction by TNFR1 and TRAILR 1/2, RIPK1 alone, in the absence of FADD and TRADD, is only sufficient for the induction of TNFR1 dependent necroptosis. Otherwise, TRADD inhibits TNFR1- and TRAILR 1/2-induced necroptosis. RIPK1 and TRADD are indispensable for TNFR1- and TRAILR 1/2-induced NFκB activation and play a decisive role in TNFR1-induced apoptosis. On the contrary, FADD alone is enough for TRAILR 1/2-induced caspase-8 activation. Furthermore, FADD is required for TRAIL-induced NFκB activation. In absence of FADD and TRADD, RIPK1 alone mediates TNF-induced caspase-8 activation. FADD is necessary for TRAIL-induced necroptosis, but antagonizes TNF-induced necroptosis in a caspase-8 dependent and independent manner. Besides TWEAK sensitizes for both a TNF- and TRAIL-induced necroptosis. To summarize, in the scope of this work, we were able to analyze the effects of TNFR1 and TRAIL 1/2 on the activation of the respective signaling cascades. Moreover, we showed how the interaction of TRADD, FADD and RIPK1 influence the activation of NFκB, apoptosis and necroptosis. KW - Signaltransduktion KW - TNFR1 KW - adapterprotein KW - TRAIL KW - Todesdomäne KW - Rezeptoren Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-184518 ER - TY - THES A1 - Sauer, Mark T1 - Die microRNA-26 Familie kontrolliert über den REST-Komplex ein für die Neurogenese essentielles regulatorisches RNA Netzwerk T1 - The microRNA-26 family controls a regulatory RNA network which is essential for neurogenesis via the REST-complex N2 - In einem sich entwickelnden multizellulären Organismus ist die räumlich-zeitliche Regulation der Genexpression von entscheidender Bedeutung für die Bildung, Identität und Funktion von Zellen. Der REST (repressor element silencing transcription factor) Komplex spielt bei der neuronalen Differenzierung und bei der Aufrechterhaltung des neuronalen Status eine essentielle Rolle, indem er in nicht neuronalen Zellen und neuralen Vorläufern die Expression neuronaler Gene unterdrückt, in deren Promotorregion eine RE1 (repressor element 1) Erkennungssequenz vorhanden ist. Während der neuronalen Differenzierung wird der REST-Komplex schrittweise inaktiviert, was zur Einleitung eines neuronalen Genexpression-Programms führt. Es wird daher angenommen, dass die Inhibierung des REST-Komplexes ein essentieller Vorgang der Neurogenese ist. Wichtige Bestandteile für die transkriptionell repressive Funktion des REST-Komplexes sind kleine Phosphatasen (CTDSP = C-terminal domain small phosphatases), welche die Polymerase-II-Aktivität an Zielgenen inhibieren. Im Zebrafisch wurde gezeigt, dass ctdsp2 durch die miR-26b negativ reguliert wird. Alle miR-26 Familienmitglieder sind in Vertebraten evolutionär konserviert und in Introns von Ctdsp Genen kodiert. Sie sind in der Lage, die Expression ihres eigenen Wirtsgens mittels einer autoregulatorischen Rückkopplungsschleife zu regulieren. Im Rahmen dieser Dissertation wurde als Modellsystem für die Neurogenese ein neurales Differenzierungssystem, welches auf murinen, embryonalen Stammzellen (ESCs) aufbaut, eingesetzt. Zur funktionellen Analyse der miR-26 Familie wurden mit Hilfe der CRISPR/Cas9-Methode verschiedene miR-26 Knockout (KO) ESC-Linien hergestellt. Hierbei wurden die Sequenzen der einzelnen Familienmitglieder und der gesamten miR-26 Familie im Genom von Wildtyp (Wt) ESCs deletiert. Diese miR-26-defizienten ESCLinien behielten ihre Pluripotenz und zeigten keinen Phänotyp hinsichtlich Proliferation, Morphologie und Identität der Zellen während der Differenzierung bis zum neuralen Vorläuferzellstadium (NPCs, engl.: neural progenitor cells). Jedoch führte die Deletion sowohl der gesamten miR-26 Familie als auch einzelner Mitglieder bei der terminalen Differenzierung zu einem spezifischen Entwicklungsstillstand im NPC Stadium und infolgedessen zu einer starken Reduktion der Anzahl von Neuronen und Astroglia. Die Transkriptom-Analyse der differenzierten miR-26-KO ESCs mittels RNA-Seq zeigte, dass die Expression von Genen die mit der Neurogenese und der neuronalen Differenzierung, aber auch der Gliogenese assoziert sind, herunterreguliert war. Die Abwesenheit der miR-26 Familie führte außerdem zu einer selektiven Reduzierung bestimmter miRNAs (REST-miRs), die einerseits die Expression von REST-Komplex Komponenten unterdrücken können, und andererseits selbst unter dessen transkriptioneller Kontrolle stehen. Zu diesem REST-miR Netzwerk gehören einige miRNAs (miR-9, miR-124, miR-132 und miR-218), die wichtige Funktionen bei verschiedenen Prozessen der neuronalen Entwicklung haben. Weiterhin führte der miR-26-KO zu einer Derepression der Proteinlevel von REST und CTDSP2 während der terminalen Differenzierung. Funktionelle Analysen mit miRNA mimics zeigten, dass erhöhte miR-26 Level zu einer Hochregulation von REST-miRs führen. Weitere Experimente, die darauf zielten, die Hierarchie des REST-miR Netwerks aufzuklären zeigten, dass die miR-26 Familie stromaufwärts die REST-miR Expression reguliert. Zusammengefasst weisen die in dieser Arbeit gezeigten Daten darauf hin, dass die miR-26 Familie als Initiator der schrittweisen Inaktivierung des REST-Komplexes eine zentrale Rolle bei der Differenzierung von neuralen Vorläuferzellen zu postmitotischen Neuronen spielt. N2 - The spatio-temporal control of gene expression in a developing multicellular organism is a key determinant for the formation, cellular identity and function of cells. The REST (repressor element silencing transcription factor) complex plays a crucial role in the process of neuronal differentiation and the maintenance of the neuronal status by suppressing neuronal genes which contain a RE1 (repressor element 1) recognition sequence within their promotor region in non-neuronal cells or in neural progenitors. During neuronal differentiation, the REST complex is gradually inactivated, leading to the initiation of a neuronal gene expression program. It is therefore assumed that the regulation of the REST complex is an essential component for the initiation of neurogenesis. Critical effector proteins of the REST complex are small phosphatases (CTDSPs = C-terminal domain small phosphatases), which reduces the polymerase II activity on target genes. In zebrafish it was shown that the REST complex-associated phosphatase ctdsp2 is negatively regulated by miR-26b. All miR-26 family members are evolutionarily conserved in vertebrates and located in introns of Ctdsp genes. Furthermore the miR-26 family members repress their own host genes through an intrinsic autoregulatory negative feedback loop. In this study, a murine embryonic stem cell (ESC) -based neural differentiation paradigm was used as a model system for neurogenesis. To analyze the function of the miR-26 family, the CRISPR/Cas9 technology was employed to generate various miR-26 knockout (KO) ESC lines, with deletions of individual family members and the entire miR-26 family in the genome of ESCs. These miR-26-deficient ESCs retained their pluripotency and did not show altered proliferation, morphology, or cell identity during neural differentiation up to the neural progenitor cell (NPC) stage. However, deletion of the entire miR-26 family as well as of single members disrupted the terminal differentiation and led to a specific developmental arrest at the NPC stage and consequently a strong reduction of neuron and astroglia cell frequencies. Global gene expression analyses in differentiated miR-26-KO ESCs further revealed that genes, which are associated with neurogenesis, neuronal differentiation, but also gliogenesis, were downregulated. The absence of the miR-26 familiy resulted in the selective reduction of a specific set of miRNAs (REST-miRs), which on the one hand suppress the expression of REST complex components and on the other hand are themselves under the transcriptional control of the REST complex. Among others, several miRNAs (miR-9, miR-124, miR-132 and miR-218), which play an important role in various processes of neuronal development, belong to this REST-miR network. Moreover, the miR-26-KO led to the derepression of REST and CTDSP2 protein levels during terminal differentiation. Functional analyses with miRNA mimics showed that increased miR-26 levels resulted in an upregulation of REST-miRs. Further experiments aimed at elucidating the hierarchy of REST-miR regulation revealed that the miR-26 family act upstream to regulate RESTmiR expression and presumably has an initial function in the regulation of this network. Taken together, the data presented in this work suggest that the miR-26 family act as an initiator for the stepwise inactivation of the REST complex during neural differentiation. Therefore, these findings are consistent with the notion that the miR-26 family represents a central regulator for neural progenitor cell differentiation into postmitotic neurons. KW - Neurogenese KW - miR-26 Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-184008 ER - TY - THES A1 - Glenz, René T1 - Die Rolle von Sphingobasen in der pflanzlichen Zelltodreaktion T1 - The role of sphingobases in plant cell death reaction N2 - Sphingobasen bilden das Grundgerüst und die Ausgangsbausteine für die Biosynthese von Sphingolipiden. Während komplexere Sphingolipide einen wichtigen Bestandteil von eukaryotischen Membranen bilden, sind Sphingobasen, die auch als long-chain bases (LCBs) bezeichnet werden, als Signalmoleküle bei zellulären Prozessen in Eukaryoten bekannt. Im tierischen System wurden antagonistische Effekte von nicht-phosphorylierten Sphingobasen (LCBs) und ihren phosphorylierten Gegenstücken (LCB-Ps) bei vielen Zellfunktionen, insbesondere der Apoptose, nachgewiesen und die zugrundeliegenden Signalwege umfassend aufgeklärt. Im Gegensatz dazu sind in Pflanzen weniger Belege für einen antagonistischen Effekt und mögliche Signaltransduktionsmechanismen bekannt. Für eine regulatorische Funktion von Sphingobasen beim programmierten Zelltod (PCD) in Pflanzen existieren mehrere Hinweise: (I) Mutationen in Genen, die den Sphingobasen-Metabolismus betreffen, führen zum Teil zu spontanem PCD und veränderten Zelltodreaktionen. (II) Die Gehalte von LCBs sind bei verschiedenen Zelltod-auslösenden Bedingungen erhöht. (III) Nekrotrophe Pathogene produzieren Toxine, wie Fumonisin B1 (FB1), die mit dem Sphingolipid-Metabolismus der Wirtspflanze interferieren, was wiederum die Ursache für den dadurch ausgelösten PCD darstellt. (IV) Die Behandlung von Pflanzen mit LCBs, nicht aber mit LCB-Ps, führt zu Zelltod. In dieser Arbeit wurde die Rolle von Sphingobasen in der pflanzlichen Zelltodreaktion untersucht, wobei der Fokus auf der Überprüfung der Hypothese eines antagonistischen, Zelltod-hemmenden Effekts von LCB-Ps lag. Anhand von Leitfähigkeit-basierten Messungen bei Blattscheiben von Arabidopsis thaliana wurde der durch Behandlung mit LCBs und separater oder gleichzeitiger Zugabe von LCB-Ps auftretende Zelltod bestimmt. Mit dieser Art der Quantifizierung wurde der an anderer Stelle publizierte inhibierende Effekt von LCB-Ps auf den LCB-induzierten Zelltod nachgewiesen. Durch parallele Messung der Spiegel der applizierten Sphingobasen im Gewebe mittels HPLC-MS/MS konnte dieser Antagonismus allerdings auf eine reduzierte Aufnahme der LCB bei Anwesenheit der LCB-P zurückgeführt werden, was auch durch eine zeitlich getrennte Behandlung mit den Sphingobasen bestätigt wurde. Darüber hinaus wurde der Einfluss einer exogenen Zugabe von LCBs und LCB-Ps auf den durch Pseudomonas syringae induzierten Zelltod von A. thaliana untersucht. Für LCB-Ps wurde dabei kein Zelltod-hemmender Effekt beobachtet, ebenso wenig wie ein Einfluss von LCB-Ps auf den PCD, der durch rekombinante Expression und Erkennung eines Avirulenzproteins in Arabidopsis ausgelöst wurde. Für LCBs wurde dagegen eine direkte antibakterielle Wirkung im Zuge der Experimente mit P. syringae gezeigt, die den in einer anderen Publikation beschriebenen inhibierenden Effekt von LCBs auf den Pathogen-induzierten Zelltod in Pflanzen relativiert. In weiteren Ansätzen wurden Arabidopsis-Mutanten von Enzymen des Sphingobasen-Metabolismus (LCB-Kinase, LCB-P-Phosphatase, LCB-P-Lyase) hinsichtlich veränderter in-situ-Spiegel von LCBs/LCB-Ps funktionell charakterisiert. Der Phänotyp der Mutanten gegenüber Fumonisin B1 wurde zum einen anhand eines Wachstumstests mit Keimlingen und zum anderen anhand des Zelltods von Blattscheiben bestimmt und die dabei akkumulierenden Sphingobasen quantifiziert. Die Sensitivität der verschiedenen Linien gegenüber FB1 korrelierte eng mit den Spiegeln der LCBs, während hohe Gehalte von LCB-Ps alleine nicht in der Lage waren den Zelltod zu verringern. In einzelnen Mutanten konnte sogar eine Korrelation von stark erhöhten LCB-P-Spiegeln mit einer besonderen Sensitivität gegenüber FB1 festgestellt werden. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit stellen die Hypothese eines antagonistischen Effekts von phosphorylierten Sphingobasen beim pflanzlichen Zelltod in Frage. Stattdessen konnte in detaillierten Analysen der Sphingobasen-Spiegel die positive Korrelation der Gehalte von LCBs mit dem Zelltod gezeigt werden. Die hier durchgeführten Experimente liefern damit nicht nur weitere Belege für die Zelltod-fördernde Wirkung von nicht-phosphorylierten Sphingobasen, sondern tragen zum Verständnis der Sphingobasen-Homöostase und des Sphingobasen-induzierten PCD in Pflanzen bei. N2 - Sphingobases are the building blocks for the biosynthesis of sphingolipids. While complex sphingolipids form a major part of eukaryotic membranes, sphingobases, which are also called long-chain bases (LCBs), are well-known signaling molecules of cellular processes in eukaryotes. In the animal system, antagonistic effects of nonphosphorylated sphingobases (LCBs) and their phosphorylated counterparts (LCB-Ps) have been reported in many cell functions, with a particular focus on apoptosis, and the underlying signaling pathways have been elucidated in detail. In contrast, few records of an antagonistic effect and the potential signal transduction mechanisms have been established in plants. Several lines of evidence point to a regulatory function of sphingobases in plant programmed cell death (PCD): (i) Mutations in genes related to sphingobase metabolism may cause spontaneous PCD and altered cell death reactions. (ii) Levels of LCBs are increased under different cell death conditions. (iii) Necrotrophic pathogens produce toxins, like fumonisin B1 (FB1), interfering with sphingolipid metabolism of the host plant and, thus, causing PCD. (iv) Treatment of plants with LCBs, but not LCB-Ps, induces cell death. In the present study the role of sphingobases in plant cell death reactions, with a focus on the examination of the hypothesis of an antagonistic cell death-inhibitory effect of LCB-Ps, has been investigated. Using conductivity-based measurements of Arabidopsis thaliana leaf discs, cell death induced by treatment with LCBs and separated or combined feeding of LCB-Ps was determined. That kind of quantification allowed the verification of an inhibitory effect of LCB-Ps on LCB-induced cell death, which was published elsewhere. However, by simultaneous measurement of the applied sphingobase levels in the tissue with HPLC-MS/MS, this antagonism could be explained by a reduced uptake of the LCB in the presence of the LCB-P, which was also confirmed by a separated treatment with the sphingobases. In addition to that an impact of exogenous applied LCBs and LCB-Ps on cell death in A. thaliana induced by Pseudomonas syringae has been investigated. For LCB-Ps no cell death inhibitory effect was observed. Similarly, there was no impact for LCB-Ps on the cell death induced by recombinant expression of an avirulence protein in Arabidopsis. For LCBs, a direct antibacterial effect against P. syringae was shown in this work. This puts previous findings of an inhibitory effect of LCBs on pathogen-induced cell death in plants into a new perspective. In further approaches, Arabidopsis mutants of enzymes of the sphingobase metabolism (LCB kinase, LCB-P phosphatase, LCB-P lyase) were functionally characterized with regard to altered in situ levels of LCBs/LCB-Ps. The phenotype of the mutants in response to fumonisin B1 was determined in a growth assay with seedlings, and by cell death measurements in leaf discs, which were accompanied by quantification of sphingobase levels. The sensitivity of different lines to FB1 was closely correlated with the levels of LCBs, while high contents of LCB-Ps alone were not able to reduce cell death. Some mutants even showed a correlation of highly enhanced LCB-P levels with a pronounced sensitivity to FB1. The results of the present study challenge the hypothesis of an antagonistic effect of phosphorylated sphingobases on plant cell death. Instead, a detailed analysis of sphingobase levels revealed a positive correlation of LCB contents with cell death. The conducted experiments not only provide further evidence for a cell death-promoting effect of nonphosphorylated sphingobases, but also contribute to the comprehension of sphingobase homeostasis, as well as of the sphingobase-induced PCD in plants. KW - Sphingolipide KW - Phytosphingosine KW - Ackerschmalwand KW - Pseudomonas syringae KW - Zelltod KW - Sphingobasen (LCB, LCB-P) KW - Ackerschmalwand KW - programmierter Zelltod KW - Sphingobases KW - Arabidopsis KW - programmed cell death Y1 - 2019 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-187903 ER -