TY - THES A1 - Rotzer, Diana T1 - Biologische Charakterisierung der Rezeptoren für Transforming Growth Faktor-ß T1 - Biological charakterization of the receptors for Transforming Growth Factor-ß N2 - Transforming growth factor-ß (TGF-ß) reguliert eine Vielzahl zellulärer Funktionen, wie Proliferation, Differenzierung und Apoptose. Über membrangebundene Serin/Threonin-Kinase-Rezeptoren werden TGF-ß Signale durch Phosphorylierung an Smad-Proteine, die intrazellulären Signaltransduktoren, weitergeleitet, die im Kern die Transkription spezifischer Gene modulieren. Obwohl die drei TGF-ß Isoformen, TGF-ß1, -ß2 und -ß3, äußerst homologe Proteine sind, unterscheiden sich die Phänotypen ihrer Genknockouts stark. Variabilität und Spezifität können auf vielerlei Arten und Ebenen der TGF-ß Signalübertragung erreicht werden. In der vorliegenden Arbeit wird eine alternativ gespleißte Variante des TGF-ß Typ II Rezeptors (TßRII), TßRII-B, charakterisiert. Dieser Rezeptor ist, im Gegensatz zum bisher bekannten TßRII, in der Lage alle drei TGF-ß Isoformen hochaffin zu binden und in Abwesenheit eines unterstützenden Typ III Rezeptors (TßRIII) Signale über den Smad-Pathway weiterzuleiten. TßRII-B ist außerdem fähig ligandenabhängig mit den verschiedenen TGF-ß Rezeptortypen zu Oligomerisieren. Erste Hinweise auf Besonderheiten der TGF-ß2 Bindung an TßRII-B wurden mittels verschiedener zellbiologischer Ansätzen gewonnen. Aus Untersuchungen zur gewebespezifischen Expression des Rezeptors geht hervor, daß TßRII-B, im Vergleich zu TßRII, ein distinktes Expressionsmuster aufweist und v.a. in TGF-ß2-beeinflußten Geweben nachgewiesen werden kann. In diesen Erkenntnissen spiegelt sich die Bedeutung dieses Rezeptors für eine TGF-ß Isoform-spezifische Signalübertragung wider. Der zweite Teil der vorliegenden Arbeit beschäftigt sich mit der Rolle von TGF-ß und seinen Rezeptoren bei der Entstehung von Tumoren. B-Zellen einiger Patienten mit chronischer lymphatischer Leukämie (B-CLL), der häufigsten Form adulter Leukämie in westlichen Ländern, zeigen Resistenz gegenüber TGF-ß-vermittelter Wachstumsinhibierung und ein verändertes Expressionsmuster der TGF-ß Rezeptoren an ihrer Zelloberfläche. In dieser Arbeit wird die Identifizierung und Charakterisierung zweier Mutationen innerhalb der putativen Signalpeptidsequenz des TGF-ß Typ I Rezeptors (TßRI) in B-Zellen TGF-ß resistenter CLL-Patienten beschrieben. Hierbei handelt es sich um einen Aminosäure-Austausch (L12Q) und eine ‚in-frame‘ Alanin-Deletion (A8) innerhalb einer aus 9 Alaninen bestehenden Sequenz. Es konnte gezeigt werden, daß diese Mutationen zwar keinen Einfluß auf Oberflächenexpression und Komplexbildungseigenschaften des TßRI haben, jedoch TGF-ß stimulierte Reportergeninduktion verringern, was eine kausale Beziehung bei der Entwicklung TGF-ß resistenter B-CLL-Zellen vermuten läßt. Ein Auftreten von Mutationen innerhalb der 9-Alanin-Sequenz des TßRI korreliert mit TGF-ß Insensitivität von B-CLL Zellen. Obwohl noch weitere Studien benötigt werden, um den präzisen molekularen Mechanismus zu verstehen, der zu TGF-ß Resistenz in B-CLL Zellen führt, kann spekuliert werden, daß TßRI Mutationen das Voranschreiten von B-CLL und evtl. anderen Tumorarten unterstützen. Gezieltes Screenen nach TßRI Signalpeptidsequenz Mutationen könnte demnach als prognostischer Indikator für Tumorprogression eingesetzt werden. N2 - Transforming growth factor-ß (TGF-ß) regulates a variety of cellular functions like proliferation, differentiation and apoptosis. It signals through membrane-bound serine/threonine kinase receptors, which upon stimulation phosphorylate Smad proteins, the intracellular signaltransducers, and thereby trigger their nuclear translocation and transcriptional activity. Although the three mammalian TGF-ß isoforms, TGF-ß1, -ß2 and –ß3, are highly homologous proteins, the phenotypes of their genknockouts reveal striking differences. Variability and specificity can be achieved on different levels of the TGF-ß signaltransduction. In this work an alternatively spliced variant of the TGF-ß type II receptor (TßRII), TßRII-B, is characterized, which in contrast to TßRII binds and mediates signaling of all TGF-ß isoforms. This signaling occurs via the Smad pathway and is independent of any supporting type III receptor (TßRIII). Therefore interaction and oligomerization of TßRII-B with the TGF-ß isoforms as well as the different TGF-ß receptor types was analyzed in detail. Furthermore we defined the characteristics of TGF-ß2 binding to TßRII-B. Expression studies demonstrate that TßRII-B expression is restricted to cells originating from tissues where the TGF-ß2 isoform has a predominant role. All that reflects the importance of this receptor splice-variant in TGF-ß isoform-specific signaling. The second part of this work focuses on the role of TGF-ß and its receptors in tumor development. B cell chronic lymphocytic leukemia (B-CLL) is the most common lymphoid cancer in Western societies, and is also currently incurable. B-cells from some B-CLL patients are resistant to the growth inhibitory effects of TGF-ß and show a different expression pattern of TGF-ß receptors at their cell surface. In this work the identification and characterization of two mutations within the putative signal sequence of the tßrI gene in B-cells from TGF-ß resistant B-CLL patients is described. Thereby a single aminoacid substitution (L12Q) is accompanied by an ‘in frame’ single alanine deletion within an 9-alanine stretch. It could be shown that this mutations do not mediate the apparent loss of functional TßRI in TGF-ß resistant B-CLL, but they attenuate reporter gene induction stimulated by TGF-ß, suggesting a causal relationship in the development of TGF-ß resistant B-CLL. The appearance of mutations within the 9-alanine stretch of the TßRI correlated with and predicted for B-CLL patient insensitivity to TGF-ß. Although more studies are needed to ascertain the precise molecular mechanism leading to TGF-ß resistance in B-CLL cells, it is tempting to speculate that these TßRI mutations may promote the progression of B-CLL and other cancers from their indolent to active states. This suggests that screening for TßRI signal sequence mutations can be employed as a prognostic indicator of B-CLL patient sensitivity to TGF-ß. KW - Transforming growth factor beta KW - Rezeptor KW - TGF-ß Rezeptoren KW - TßRII-B KW - chronische lymphatische Leukämie KW - Tumorgenese KW - TGF-ß receptors KW - TßRII-B KW - chronic lymphocytic Leukemia KW - tumorigenesis Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-1180907 ER - TY - THES A1 - Hansen, Immo A. T1 - Hexamerine und Neuropeptide in der postembryonalen Entwicklung der Insekten T1 - Hexamerins and Neuropeptides during the postembryonic development of insects N2 - Das Ziel der vorliegenden Dissertation war die Entwicklung neuartige Ansätze zur Identifizierung von biologisch aktiven Wirkstoffen, die in die Metamorphose von holometabolen Insekten eingreifen. Hexamerine und Neuropeptide besitzen sehr unterschiedliche Funktionen. Während Neuropeptide zusammen mit anderen Gewebshormonen auf einer übergeordneten regulatorischen Ebene wirken, sind Hexamerine als Speicher- und Verteidigungsproteine ein Endglied dieser hormonellen Regulationskaskade. In der vorliegenden Arbeit wurden zwei Fragestellungen bearbeitet: 1) Im ersten Projekt sollten allatotrope Substanzen im Gehirn der großen Wachsmotte Galleria mellonella durch Screening einer Expressionsbibliothek mit polyklonalen Antiseren identifiziert werden. Dabei wurde das Neuropeptid Corazonin identifiziert. Die vollständige Corazonin-mRNA wurde kloniert und sequenziert. Das Expressionsmuster der Corazonin-mRNA und des Peptids wurde mittels Northern-Analyse und in-situ-Hybridisierung charakterisiert. Corazonin wird in vier Zellpaaren, die zu den lateralen neurosekretorischen Zellen gehören, exprimiert. Die Axone dieser Zellen verlaufen ipsilateral zu den Nervi corpori cardiaci I+II, feine Fasern verzweigen sich in die am Ösophagus angrenzende Hirnregion hinein. Corazonin wird offensichtlich an den Axon- Endigungen in den Corpora cardiaca in die Hämolymphe freigesetzt. Einige feine Fasern enden in den Corpora allata bzw. am Vorderdarm. Der Nachweis, dass Corazonin tatsächlich eine allatotrope Wirkung hat, konnte nicht erbracht werden. 2) Die Protein/Protein-Interaktion zwischen Hexamerinen und dem Hexamerinrezeptor der Schmeißfliege Calliphora vicina wurde durch Two-Hybrid-Experimenten analysiert. Durch Interaktionstest mit trunkierten Proteinfragmenten wurden die Bindungsdomänen beider Proteine kartiert. Als rezeptorbindende Domäne des Arylphorins wurde ein 49 AS großes Peptid in der Domäne-3 des Arylphorin- Monomers identifiziert. Die Ligandenbindungsdomäne des Hexamerinrezeptors wurde in den ersten 24 AS des N-Terminus kartiert. Ausgehend von diesen Ergebnissen wurde ein HTS-Protokoll entwickelt, das zur Identifizierung von Substanzen verwendet werden kann, welche die Bindung dieser beiden Proteine beeinflussen. Eine Two-Hybrid-Bibliothek wurde ausgehend von 7dL-Fettkörper-RNA konstruiert und mit "Hexamerinrezeptor-Ködern" gescreent. Dabei wurden zwei neue Interaktionspartner des Hexamerinrezeptors gefunden und genauer charakterisiert. Der erste identifizierte Interaktionspartner - d-AP-3 - ist Teil eines Adaptin- Komplexes, der als Adapter zwischen membranständigen Rezeptoren und Clathrin oder ähnlichen Proteinen an der rezeptorvermittelten Endozytose beteiligt ist. Die Adaptin-Interaktionsdomäne liegt innerhalb des ABP64-Spaltprodukts des Hexamerinrezeptors. Die Funktion des zweiten Interaktionspartners - AFP - ist unbekannt. AFP wird im anterioren Teil des Fettkörpers und in Hämozyten exprimiert. Die Interaktion zwischen dem Hexamerinrezeptor und AFP ist demnach auf diesen Teil des Fettkörpers beschränkt. Die mit AFP interagierende Domäne des Hexamerinrezeptors liegt innerhalb des P30-Spaltprodukts. N2 - The goal of this project was to develop innovative approaches to identify biologically active substances which interfere with the metamorphosis of holometabolous insects. Hexamerins and neuropeptides clearly have different functions. While neuropeptides are involved in initial regulatory steps hexamerins have important functions as storage and defense proteins during the final steps of the regulatory cascade. Two projects are part of this dissertation: 1) The aim of the first project was the identification of allatotropic substances in the brain of the greater waxmoth Galleria mellonella by means of screening an expression-library with polyclonal antisera. This approach led to the identification the neuropeptide corazonin. The corazonin-mRNA was cloned and sequenced. The expression profile of the mRNA and the peptide was examined with northern-blotting and in-situ-hybridization. Corazonin is produced in four neurosecretory cells localized laterally in each brain hemisphere. Axons of these cells follow the ipsilateral tract to the nervi corpori cardiaci I+II, finer fibers seem to terminate in the brain region adjacent to the oesophagus. Corazonin seems to be released in axon terminals within the corpora cardiaca. Axon endings are even regularly seen in the foregut wall and in the corpora allata. However it could not be established that corazonin in fact is an allatotropic substance. 2) The protein/protein-interaction between hexamerins and the hexamerin-receptor of the blowfly Calliphora vicina was analysed using the yeast-two-hybrid- system. By interaction tests with truncated protein fragments the binding domains of both proteins were mapped. The receptor binding domain of arylphorin was located within a peptide of 49 aa in domain-3 of the arylphorin monomer. The ligand binding domain of the hexamerin-receptor was mapped within the first 24 aa of the N-terminus. Proceeding from this results a protocol for a high-throughput-screening was developed which can be used to identify substances that interfere with the binding of these two proteins. A two-hybrid-library was constructed from 7dL-fat body RNA and screened with a hexamerin-receptor-bait. Two novel interactors of the hexamerin-receptor were identified and characterized within this project. The first identified interactor - d-AP-3 - is part of an adaptin complex which serves as an adapter between membrane-bound receptors and clathrin or related proteins and is part of the receptor-mediated endocytosis process. The adaptin-interacting domain lies within the ABP64 cleavage product of the receptor. The function of the second interactor - AFP - is unknown. AFP is produced specifically in the anterior part of the fat body and in hemocytes. Hence the interaction between the hexamerin-receptor and AFP is limited to this part of the fat body. The AFP-interacting domain is located within the P30 cleavage product of the hexamerin-receptor. KW - Blaue Fleischfliege KW - Hexamerine KW - Rezeptor KW - Arylphorine KW - Wechselwirkung KW - Große Wachsmotte KW - Jugendentwicklung KW - Corazonin KW - Genexpression KW - Biologische Schädlingsbekämpfung KW - Hexamerin KW - Neuropeptid KW - Corazonin KW - Arylphorin AFP KW - hexamerin KW - neuropeptide KW - corazonin KW - arylphorin AFP Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-1180084 ER - TY - THES A1 - Brede, Marc T1 - Kardiovaskuläre Phänotypisierung von Angiotensin II AT2-Rezeptor- und adrenergen Rezeptor-"Knockout"-Mäusen T1 - Cardiovascular characterization of Angiotensin II AT2-receptor- and adrenergic receptor-knockout-mice N2 - Die Deletion des AT2-Rezeptors (AT2-KO) führt zu erhöhter Blutdruckempfindlichkeit und vaskulärer Hypertrophie durch Aktivitätszunahhme der P70S6-Kinase. Die Vasodilatation von Blutgefäßen wird maßgeblich durch beta1-adrenerge Rezeptoren vermittelt. Die Deletion von alpha2-adrenergen Rezeptoren (alpha2-KO) führt zur Entwicklung einer Herzinsuffizienz nach Aortenstenose. Der Mortalitätanstieg ist mit erhöhten Plasmanoradrenalin-Spiegeln (a2A-KO), bzw. Plasmaadrenalin-Spiegeln (a2C-KO) assoziiert. N2 - The deletion of AT2-receptors causes increased blood-pressure sensitivity and vascular hypertrophy by increased P70S6-Kinase activity. Vasodilation is mainly mediated by beta1-adrenoceptors. The deletion of alpha2-adrenoceptors leads to heart failure after aortic banding. The increased mortality is associated with elevated plasma levels of norepinephrine (a2A-KO) or epinephrine (a2C-KO). KW - transgen KW - Maus KW - Angiotensin KW - Rezeptor KW - adrenerg KW - Katecholamine KW - Blutgefäß KW - Hypertrophie KW - Herzinsuffizienz KW - Nebenniere KW - Angiotensin KW - receptor KW - adrenergic KW - catecholamines KW - vessel KW - hypertrophy KW - heart failure KW - adrenal gland Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-1179726 ER - TY - THES A1 - Große-Wilde, Anne T1 - Klonierung, molekulare Charakterisierung und konditionale Inaktivierung eines murinen Todesrezeptors für TRAIL (mTRAIL-R) T1 - Cloning, molecular characterization and konditional inactivation of a murine death receptor for TRAIL (mTRAIL-R) N2 - TRAIL/APO-2L (Tumor necrosis factor (TNF)-related apoptosis-inducing ligand) ist ein Apoptose-induzierendes Mitglied der TNF-Superfamilie (TNF-SF). Bislang sind zwei humane TRAIL-Todesrezeptoren, TRAIL-R1 und TRAIL-R2, bekannt, die zur TNF-Rezeptor-Superfamilie gehören. TRAIL induziert Apoptose in einer Vielzahl von Tumorzelllinien, wohingegen die meisten primären Zellen resistent gegenüber TRAIL sind. In präklinischen Studien mit Mäusen und nichthumanen Primaten wurde keine systemische Toxizität von TRAIL nachgewiesen. Diese Beobachtungen haben beträchtliches Interesse an dem Einsatz von TRAIL zur Tumortherapie geweckt. Über die physiologische Rolle von TRAIL ist jedoch noch wenig bekannt. Das Ziel dieser Arbeit war, Werkzeuge zum Studium des Apoptose-induzierenden TRAIL-Systems in Mäusen zu etablieren. Zunächst mussten das oder die murinen Homologe der beiden Apoptose-induzierenden TRAIL-Rezeptoren identifiziert werden. Dazu wurden murine TRAIL-bindende Proteine biochemisch über 2D-Gelanalysen identifiziert. Anhand einer Sequenzinformation aus einer Datenbank wurde ein muriner TRAIL-Rezeptor kloniert, der aufgrund seines biochemisch bestimmten Molekulargewichts p54_mTRAIL-R genannt wurde. Der Sequenzvergleich sowie die Funktionsanalyse von p54_mTRAIL-R ergab, dass dieser Rezeptor das funktionelle murine Homolog zu den humanen TRAIL-Todesrezeptoren TRAIL-R1 und TRAIL-R2 ist. So war p54_mTRAIL-R ebenfalls in der Lage, nach Überexpression Caspase-abhängig Apoptose zu induzieren. Wie die Transkripte der humanen TRAIL-Todesrezeptoren wurden die Transkripte von p54_mTRAIL-R in allen untersuchten Geweben detektiert. Es wurde ein lösliches p54_mTRAIL-R:Fc-Fusionsprotein hergestellt, welches zur TRAIL-Inaktivierung in vivo und in vitro verwendet werden kann. Um die physiologische Rolle des p54_mTRAIL-Rs in vivo studieren zu können, sollten mTRAIL-R-defiziente Mäuse generiert werden. Zur Modifikation des für p54_mTRAIL-R kodierenden tar-Locus wurde das Gen kloniert und charakterisiert. Um eine durch die Gendefizienz hervorgerufene eventuelle Letalität oder sekundäre kompensierende Effekte zu vermeiden, wurden mit Hilfe des Cre/loxP-Systems und des Flp/FRT-Systems konditionale p54_mTRAIL-R defiziente Mäuse hergestellt. Die Werkzeuge, die in dieser Arbeit generiert wurden, wie lösliches p54_mTRAIL-R:Fc Fusionsprotein und konditionale p54_mTRAIL-R defiziente Mäuse, können nun in vivo für die Erforschung der physiologischen Rolle des TRAIL-Systems sowie seines Potentials und dessen Grenzen bei der Tumortherapie benutzt werden. N2 - TRAIL/APO-2L (Tumor necrosis factor (TNF)-related apoptosis-inducing ligand) is an apoptosis-inducing member of the tumor necrosis factor superfamily (TNF-SF). Currently two human death receptors, namely TRAIL-R1 and TRAIL-2, belonging to the TNF receptor superfamily (TNFR-SF) are known to bind TRAIL. Interestingly, TRAIL has been shown to induce apoptosis in a variety of tumor cell lines whereas most primary cells were resistant. In addition, preclinical studies with mice and nonhuman primates have indicated that TRAIL does not induce substantial systemic toxicity. These observations have raised considerable interest in the use of TRAIL in tumor therapy. Yet little is known about the physiological function of TRAIL. In order to examine the physiological function of TRAIL in vivo, the aim of this work was to establish tools to study the apoptosis-inducing TRAIL system in mice. First the murine homologue/s of the two death-inducing TRAIL receptors needed to be identified. Therefore the first aim was to biochemically identify murine TRAIL-binding proteins via 2D-gel analysis. With the help of the information from an EST sequence contained in a public database a murine TRAIL receptor was cloned, which was termed p54_mTRAIL-R due to its molecular weight as determined by biochemical analysis. Sequence comparison and functional analysis of p54_mTRAIL-R revealed that mTRAIL-R is homologous to both human TRAIL death receptors. Like its human counterparts p54_mTRAIL-R was capable of inducing apoptosis in a caspase-dependent fashion upon overexpression. As transcripts of the human TRAIL death receptors, also transcripts of p54_mTRAIL-R could be detected in all tissues examined. A soluble p54_mTRAIL-R:Fc-protein was generated, which could be used to block TRAIL-induced apoptosis in vitro and in vivo. To be able to study the physiological role of the p54_mTRAIL-R in vivo TRAIL-R deficient mice were generated. For modification of the tar-locus coding for p54_mTRAIL the gene was cloned and characterized. In order to avoid lethality or secondary complementing effects the Cre/loxP system and Flp/FRT system was used to generate conditional p54_mTRAIL-R deficient mice. The tools generated in this work as soluble p54_mTRAIL-R:Fc fusion protein and conditional p54_mTRAIL-R deficient mice can now be used in vivo to deduce the physiological role of the TRAIL system and to determine its potential and limitations for cancer therapy. KW - Maus KW - Tumor-Nekrose-Faktor KW - Apoptosis KW - TRAIL KW - Rezeptor KW - Apoptose KW - Klonierung KW - 2D-Gel-Analyse KW - konditionale Knockout-Maus KW - TRAIL KW - receptor KW - apoptosis KW - cloning KW - 2D gel analysis KW - conditional knockout mouse Y1 - 2001 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-559 ER -