TY - THES A1 - Kotulková, Veronika T1 - Deutsche Determinativkomposita und ihre Entsprechungen im Tschechischen N2 - No abstract available KW - Deutsch KW - Determinativ KW - Kompositum KW - Tschechisch KW - Determinativkomposita KW - Deutsch KW - Tschechisch Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-14845 ER - TY - THES A1 - Edelmann, Karola T1 - Richtungshoeren bei Kindern mit bilateralen Cochlea-Implantaten im Vergleich zu Kindern mit unilateralem Cochlea-Implantat T1 - Directional Hearing in Children After Bilateral Cochlear Implantation N2 - Das Cochlea-Implantat oeffnet gehoerlos geborenen Kindern ein Tor in eine fuer sie neue Welt. CI ermoeglichen die Integration in eine akustisch orientierte Umwelt. Standardmaessig werden Patienten heutzutage unilateral mit CI versorgt. Mit modernen Geraeten laesst sich auch damit eine sehr gute Hoer- und Sprachentwicklung erreichen. Raeumliches Hoeren und eine Erleichterung, Sprache unter Stoerschalleinfluss zu verstehen, kommen vor allem durch binaurale Signalverarbeitungsprozesse zu Stande. Folglich geht der unilaterale Gebrauch eines CIs mit Einschraenkung einher: Sprache in laermerfuellter Umgebung wird weniger gut verstanden, und der Ort von Schallquellen kann nur unsicher, ueberhaupt nicht oder falsch wahrgenommen werden. Um binaurales Hoeren und die damit verbundenen Vorteile fuer das Hoeren und die Entwicklung der Lautsprache auch CI-Traegern zu ermoeglichen, werden seit 1996 an der Universitaet Wuerzburg Patienten bilateral versorgt. Anfaenglich wurden nur Erwachsene bilateral implantiert, mittlerweile erhalten ueberwiegend Kinder zwei Cochlea- Implantate. Verstaendlicherweise wollten die betroffenen Eltern ihren Kindern die besseren Entwicklungsmoeglichkeiten mit einem zweiten CI nicht vorenthalten. In der vorliegenden Studie wurde das Richtungshoervermoegen bei CI-Kindern untersucht. Die Leistungen von bilateral implantierten Kindern wurden mit denen von Normalhoerenden und unilateral implantierten Kindern verglichen. Das CI-Kollektiv bestand aus 25 Kindern, von denen 15 bilateral und zehn unilateral implantiert worden waren. Um Aspekte des Hoerverhaltens in Alltagssituationen zu beruecksichtigen, wurden die Kinder in einer entsprechenden Versuchsanordnung im Rehabilitationszentrum CIC Sued Wuerzburg getestet. Sie befanden sich dabei mit mehreren Personen in einem nicht weiter praeparierten Uebungsraum. In einer zweiten Testanordnung sollten Fehlermoeglichkeiten und Stoerfaktoren so weit wie moeglich minimiert werden. Diese Untersuchungen wurden in der Camera silenta der HNO-Klinik Wuerzburg durchgefuehrt. Ein weiterer Unterschied zum CIC bestand darin, dass sich waehrend der Untersuchung ausser dem Kind nur noch der Versuchsleiter und eine Bezugsperson, meist die Mutter, im Raum befanden. Sowohl im CIC als auch in der Klinik wurde den Kindern mehrmals ein akustischer Stimulus aus drei unterschiedlichen Richtungen (rechts, links und vorne) vorgespielt. Die Aufgabe der Kinder bestand darin, die wahrgenommene Schalleinfallsrichtung anzugeben. Die Tests wurden im Verlauf unseres Untersuchungszeitraumes von einem Jahr mehrmals wiederholt. Dadurch konnte auch gesehen werden, dass die Faehigkeit zum Richtungshoeren bei taub geborenen Kinder, wie andere Faehigkeiten auch, heranreift, wenn die Kinder heranwachsen. Für unsere Referenzgruppe von 23 normal hoerenden Kindern ergab sich bis auf eine Ausnahme hoch signifikantes Richtungshoeren in beiden Untersuchungsanordnungen. Von den zehn Kindern mit einem CI zeigte keines wiederholbar signifikantes Richtungshoeren, weder in der alltagsorientierten noch in der Laborsituation. Die Tragezeiten des CIs lagen bei den Kindern zwischen drei Monaten und vier Jahren. Bei der Durchfuehrung der Tests am CIC Sued zeigten nur drei der insgesamt 14 getesteten Kinder mit zwei CI Richtungshoeren. Wir schreiben das deutlich schlechtere Ergebnis im Vergleich zu den Testergebnissen in der Camera silenta der erschwerten Untersuchungssituation zu. Die Ergebnisse der Camera silenta zeigten ein signifikantes Richtungshoeren bei 13 der 14 untersuchten bilateral implantierten Kinder. Bei letzteren nahm im Verlauf des Messzeitraums von einem Jahr die Zahl der Kinder, bei denen Richtungshoeren in den einzelnen Untersuchungen im Verlauf der Studie sichtbar wurde, kontinuierlich zu. Parallel dazu wurde mit der Zeit auch immer sicherer geurteilt. Die Kinder, die praelingual ertaubt waren, lernten nach Implantation des zweiten CIs mit der Zeit Richtungshoeren, bzw. entwickelten diese Faehigkeit im Laufe der Zeit zu groesserer Vollkommenheit. Zusammengefasst laesst sich sagen, dass die bilaterale CI-Versorgung prae- und perilingual ertaubten Kindern ermoeglicht, Richtungshoeren auszubilden. Bilateral implantierte Kinder sind gegenueber den nur einseitig implantierten in dieser Beziehung klar im Vorteil. N2 - Adult benefit in different ways from bilateral cochlear implantation. Most also regain the ability of directional hearing. Stimulated by this experience the ability of directional hearing was also examined in bilaterally implanted children. During the year 1999 and 2000 directional hearing was investigated in 15 bilaterally implanted children. The results were compared to those of a control group of 10 unilaterally implanted children. Two children from this group used a hearing aid on the non-implanted side. Speech-like CCITT noise bursts (500 ms, 80 dB SPL) were presented from one out of three loudspeakers at -90 degree, =O degree and 90 degree azimuth at a distance of 1.8 meters. The loudspeakers were selected randomly, with the exception, that each speaker was activated 5 times. The child was seated in the middle of the half circle and was asked to indicate which speaker the noise was presented from. Because of the degree of scatter in the judgements, a significant correlation (alpha < 5 %) between the location of the loudspeakers and the judged direction was taken as indication for directional hearing. Significant directional hearing was found in 13 out of the 15 bilaterally implanted children. One of them did not show directional hearing within the time interval investigated, and one child was uncooperative. None of the eight unilaterally implanted children who did not use an additional hearing aid showed directional hearing. However, one of the two children with one cochlear implant and a hearing aid showed directional hearing according to definition. In conclusion, bilateral cochlear implantation proved to be a useful method to regain directional hearing in this group of children with SNHL. This will hopefully also improve their open set speech understanding under quiet listening conditions and in noise. KW - Richtungshoeren KW - Cochlea Implantaten KW - Binaural KW - Zeitdifferenz KW - Directional hearing KW - Cochlea Implantation KW - Binaural Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-14850 ER - TY - THES A1 - Merdanovic, Melisa T1 - Charakterisierung von NadR : das essentielle Enzym der NAD-Synthese bei Haemophilus influenzae T1 - Characterization of NadR: an essential enzyme of NAD synthesis in Haemophilus influenzae N2 - I Zusammenfassung Haemophilus influenzae, ein Gram-negatives, Bakterium der Familie Pasteurellaceae, kann beim Menschen eine Vielzahl an Erkrankungen auslösen: Die bekapselte Stämme, v. a. mit Typ b Kapsel können Cellulitis, septische Arthritis, Epiglottitis und Meningitis verursachen. Die nicht-bekapselte Stämme können Otitis media, Sinusitis, Pneumonie und in selteneren Fällen Bakterämie verursachen. Ein besonderes Merkmal des Metabolismus von H. influenzae ist dessen Unfähigkeit Nikotinamid-Adenin-Dinukleotid (NAD+) de novo zu synthetisieren. Daher sind die Enzyme bzw. Transporter, die an NAD+ Aufnahme und Resynthese beteiligt sind, als putative antimikrobielle Ziele von Interesse. In unserer Arbeitsgruppe konnte gezeigt werden, dass NAD+ zu Nikotinamidribosyl degradiert werden muss, bevor es in die Zelle aufgenommen werden kann. Auch Proteine, die an der Degradation des exogenen NAD+ zu Nikotinamidribosyl und dessen anschließender Aufnahme in die Zelle verantwortlich sind, konnten identifiziert und charakterisiert werden. Wie Nikotinamidribosyl im Cytoplasma wiederum zu NAD+ synthetisiert wird, ist auch erst kürzlich geklärt worden: für NadR konnte sowohl eine Ribosyl-Nukleotid-Kinase (RNK) Aktivität als auch eine Nikotinamid-Mononukleotid-Adenylyltransferase (NMNAT) Aktivität in vitro gezeigt werden. Die Kristallstruktur von hiNadR im Komplex mit NAD+ wurde auch aufgeklärt. In dieser Arbeit sollte NadR, insbesondere dessen RNK Domäne, in vivo und in vitro näher charakterisiert werden. Um zu untersuchen, ob beide Domänen in vivo essentiell sind, wurden Deletionsmutanten erzeugt, bei welchen die komplette bzw. der C-terminale Teil der RNK Domäne fehlten. Diese Deletionen konnten im nadV+ Hintergrund erzeugt werden. Die Deletionen konnten in H. influenzae nur zusammen mit dem nadV-Gen transferiert werden oder alternativ nur in die Zellen, die mit pNadRKan Plasmid transformiert wurden. Dies verdeutlicht, dass nicht nur die NMNAT Domäne sondern auch die RNK Domäne bzw. sogar nur wenige C-terminal fehlende Aminosäuren des NadR Proteins essentiell für die Lebensfähigkeit von H. influenzae sind. Gleichzeitig zeigen diese Experimente, dass die RNK-Domäne in Anwesenheit von NadV redundant ist. Ein weiterer Phänotyp der RNK-Deletionsmutante zeigte sich beim Nikotinamidribosyl-Transport. Im Gegensatz zum Wt, welcher ca. 60-80% des 14C-Nikotinamidribosyls aufnahm, konnte für die RNK-Deletionsmutante nur 2-5% Aufnahme gemessen werden. Dies konnte durch das pNadRKan Plasmid komplementiert werden. Weiterhin wurde festgestellt, dass spontan Aminopyridin-resistente H. influenzae Zellen Mutationen im nadR Gen haben, insbesondere im Walker A-Motif (P-Loop) der RNK Domäne. Zusätzlich konnte in dieser Arbeit gezeigt werden, dass NadR aus Aminopyridin und ATP Aminopyridin-Adenin-Dinukleotid synthetisieren kann. Somit konnte gezeigt werden, dass die wachstumshemmende Wirkung eigentlich durch das aus Aminopyridin synthetisierte Aminopyridin-Adenin-Dinukleotid entsteht, welches NAD+ in Redox-Reaktionen verdrängt, wodurch es letztendlich zum Stillstand des Metabolimus kommt. Durch Einführen von gezielten AS-Substitutionen im Walker A und B Motif und in der LID-Domäne von NadR, konnten einige Aminosäuren identifiziert werden, welche essentiell für die Aktivität der RNK Domäne sind. Alle Aminosäuren-Substitutionen führten zum Verlust der RNK Aktivität, die NMNAT Aktivität jedoch war nicht beeinträchtigt. Desweiteren wurden diese NadR Punktmutanten in vivo untersucht. Für alle konnte eine signifikante Defizienz in der Nikotinamidribosyl-Aufnahme beobachtet werden, die gemessene Aufnahme lag im Bereich der RNK-Deletionsmutante. Dadurch konnte eine direkte Korrelation zwischen der RNK Aktivität und der Nikotinamidribosyl-Aufnahme gezeigt werden. In weiteren in vitro Experimenten konnte für NadR eine Feedback-Inhibition durch das NAD+ gezeigt werden, wobei NAD+ in erster Linie die RNK Domäne von NadR inhibiert. Eine graduelle Erhöhung der NAD+ Konzentration führte in den in vitro Assays zu einer graduellen Abnahme der RNK. Bei der NMNAT Aktivität jedoch zeigte sich keine signifikante Inhibition in Anwesenheit von NAD+. Begleitende in vivo Experimente, zeigten eine 2/3 Reduktion der Nikotinamidribosyl-Aufnahme bei den Zellen, die mit NAD+ inkubiert wurden, d. h. höhere intrazelluläre NAD+ Konzentration hatten. Für die genauere Analyse der Feedback-Inhibition durch NAD+ wurden weitere Punktmutanen hergestellt. Bei zwei der Punktmutanten wurde eine Beeinträchtigung der NadR-Aktivität beobachtet, daher wurden diese Punktmutanten von weiteren Analysen im Bezug auf NAD+-Feedback Inhibition ausgeschlossen. Eine Mutante (NadRW256F) jedoch, zeigte ähnliche Aktivität wie das Wt-NadR. In Anwesenheit von NAD+ wurde die RNK Aktivität dieser Punktmutante, im Gegensatz zum Wt-Protein, kaum gehemmt. Dadurch konnte W256 als eine der Aminosäuren identifiziert werden, die an der Vermittlung der NAD+-bedingten Inhibition der RNK-Domäne beteiligt ist. N2 - I Summary Haemophilus influenzae, a gram-negative human pathogen belonging to a family of Pasteurellaceae is a causative agent of several distinct diseases. Whereas capsulated strains, particulary those with tybe b capsule can cause severe invasive infections such as cellulitis, septic arthrithis, epiglottitis and meningitis, non-capsulated strains generally tend to cause localized disease including otitis media, sinusitis, pneumonia and in rare cases bacteremia. The inability to synthesize NAD+ de novo is one of the hallmarks of H. influenzae metabolism, therefore proteins involved in NAD+ uptake and utilization respresent interesting putative targets for development of novel antimicrobial treatment. In our lab we were able to show, that prior to uptake, NAD+ has to be degraded to NR. Several proteins involved in NAD+ degradation and NR uptake were identified and characterized: OmpP2 (an outer-membrane porin), e(P4) (a membrane-bound acid phosphoesterase), NadN (a periplasmatic nucleotidase) and PnuC (a nicotinamidribosyl transporter localized in inner membrane). Enzyme responsible for resynthesis of nicotinamidribosyl to NAD+ was recently found to be NadR: A bifunctional protein containing a nicotinamidribosyl kinase (RNK) and a nicotinamid mononucleotide adenylyltransferase (NMNAT) activity, both of which were confirmed in vitro. Also, the crystal structure of NadR complexed with NAD+ was recently resolved. The aim of this work was to characterize the in vivo function of NadR, particular interest was laid on the characterization of the nicotinamidribosyl kinase domain. To test if both domains of NadR are essential for survival, deletion mutants lacking the entire RNK domain and the C-terminal 58 amino acids were constructed. Initially, these mutants were made in a H. influenzae strain which contains a chromosomal copy of H. ducreyi nadV gene. In following transformation experiments, transfer of the RNK deletion mutants to H. influenzae strain was always accompanied with an nadV transfer as well. Only in strain containing pNadRKan plasmid, no nadV transfer along with RNK-deletions took place. Indirectly, this shows that not only the entire RNK domain is essential for H. influenzae, but also the last 58 amino acids as well. It also shows that in presence of NadV the RNK domain is redundant. RNK deletion mutant displayed a significant deficiency in nicotinamidribosyl transport as well: whereas the Wt strain can accumulate up to 80% of 14C labeled nicotinamidribosyl, RNK mutant is able to accumulate only 2-5%. Introduction of pNadRKan plasmid to RNK mutant restored transport efficiency to Wt level. Studies using spontanous 3-aminopyridine (3-AmPR) resistant H. influenzae isolates, revealed that almost all 3-AmPR resistant isolates have mutations in the nadR gene. A clustering of mutations in Walker A motif of the RNK domain could be observed. Further studies represented in this work, show that 3-AmPR can act as a subtrate for NadR, therefore in ATP consuming reactions aminopyridine-adenindinucleotide can be synthesized. Intracellular aminopyridine-adenindinucleotide replaces NAD+ in redox reactions, which ultimately leads to inhibition of cell metabolism, thereby explaining the mechanism of 3-AmPR based growth inhibition. Using site-directed mutagenesis to introduce amino acid substitutions in distinct parts of the NadR-RNK domain, active sites of the RNK domain were revealed and amino acids essential for the RNK activity were identified. These defined amino acid exchanges resulted in loss of the RNK activity in vitro, but had no effect on the NMNAT activity, which remained intact in these mutant variants of NadR. Following in vivo studies revealed that all mutant NadR proteins caused a severe nicotinamidribosyl uptake deficiency, similar to the one observed in the RNK deletion mutant. Therefore, a direct correlation between the RNK activity and nicotinamidribosyl uptake was shown. Further in vitro studies revealed a feedback inhibition of NadR by NAD+, especially for the RNK domain. In case of RNK domain a gradual increase of NAD+ concentration led to gradual decrease in RNK activity. In contrast, for NMNAT domain no significant inhibition in the presence of NAD+ was observed. Also, in in vivo experiments a 3 fold reduction of nicotinamidribosyl uptake rate was observed when intracellular NAD+ concentrations were higher. To adress the mechanism of NAD+ feedback inhibition, once again, distinct amino acid exchanges were introduced. In vitro, two of the mutant proteins were impaired in their activity, especially if lower protein contrations were used. Therefore, further test concerning inhibtion were not preformed with these mutants. However, a W256F protein displayed activity similar to that of the native protein and furthermore was not inhibited in presence of NAD+. This indicates an involvement of the amino acid W256 in mediating the NAD+ dependent feedback inhibition on NadR activity. KW - Haemophilus influenzae KW - NAD KW - Synthese KW - NAD KW - Enzym KW - Synthese KW - Haemophilus KW - influenzae KW - NAD KW - enzyme KW - synthesis KW - Haemophilus KW - influenzae Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-14907 ER - TY - THES A1 - Obojes, Karola T1 - Untersuchung der Infizierbarkeit von Endothelzellen mit Masernviren und des Interferon-induzierten antiviral wirksamen Mechanismus T1 - Investigation of the infection of endothelial cells with measles viruses and the antiviral mechanism induced by interferon N2 - Das Masernvirus (MV) gehört zu den negativ-strängigen RNA-Viren der Familie der Paramyxoviridae und verursacht beim Menschen akute und subakute Enzephalitiden. Es wurde beschrieben, dass sich MV-RNA in den Endothelzellen von SSPE (subakute sklerosierende Panenzephalitis)-Gehirnen nachweisen lässt (Cosby & Brankin, 1995). In dieser Arbeit konnte ich eine CD46- und CD150-unabhängige Infektion von Endothelzellen durch Wildtyp-MV nachweisen. Ferner wurde beschrieben, dass das Typ II-Interferon (IFN-g) im Serum von Patienten mit akuten Masern und nach einer Masernimpfung erhöht ist (Okada et al., 2001; Ovsyannikova et al., 2003) und dieses Zytokin lässt sich auch in Gehirnläsionen von SSPE-Patienten detektieren (Nagano et al., 1994). Basierend auf diesen Erkenntnissen, konnte ich eine durch das Enzym Indolamin 2,3-Dioxygenase (IDO) vermittelte antivirale Aktivität von IFN-g gegen MV nachweisen. Endothelzellen (EZ) sind bei der akuten Masernerkrankung oder nachfolgenden Komplikationen, die auf einer persistierenden Infektion basieren, wichtige Zielzellen. CD46 und CD150 (signalling lymphocytic activation molecule, SLAM) wurden als zelluläre Rezeptoren für MV beschrieben (Dörig et al., 1993; Naniche et al., 1993; Tatsuo et al., 2000). Es konnte gezeigt werden, dass humane EZ aus dem Gehirn und aus der Nabelschnurvene (HBMECs und HUVECs) zwar CD46, aber auf RNA- und auf Proteinebene kein SLAM exprimieren. Diese Zellen konnten jedoch mit den Wildtyp-MV, die CD46 nicht als Rezeptor benutzen, infiziert werden. Diese Untersuchungen deuten auf die Präsenz eines zusätzlichen Rezeptors für die Aufnahme und Verbreitung von MV in humanen EZ hin. Der antivirale Effekt von Interferonen spielt bei der MV-Vermehrung eine entscheidende Rolle und variiert jedoch in Abhängigkeit von der Wirtszelle (Schnorr et al., 1993). Im Gegensatz zu den attenuierten MV-Impfstämmen können Wildtyp-MV den antiviralen Effekt von Typ I-IFN blockieren, indem sie die Induktion von IFNa/b hemmen und die Sensivität gegenüber dem antiviralen Effekt vermindern. Dabei spielen die V- und C-Proteine des MV eine Rolle (Naniche et al., 2000; Patterson et al., 2000; Shaffer et al., 2003), die mit zellulären STAT-Proteinen und IRF-9 interagieren (Palosaari et al., 2003; Takeuchi et al., 2003; Yokota et al., 2003). In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass IFN-g die Replikation aller MV-Stämme vorwiegend in Endo- und Epithelzellen hemmen kann und, dass diese durch IFN-g induzierte, antivirale Aktivität mit der Induktion der Indolamin 2,3-Dioxygenase (IDO) korreliert. IDO ist ein Enzym, welches in Anwesenheit von Sauerstoff den Abbau von Tryptophan zu Kynurenin katalysiert (Hirata et al., 1975) und hauptsächlich antiparasitäre, antibakterielle und antivirale (Bodaghi et al., 1999; Adams et al., 2004) Effekte vermittelt. Im Zusammenhang mit Masern wurde beschrieben, dass die Tryptophan Katabolite in SSPE-Patienten erhöht sind (Kurup & Kurup, 2002). Die Daten in dieser Arbeit zeigen, dass die durch IFN-g-induzierte antivirale Aktivität durch Zugabe von L-Tryptophan nahezu aufgehoben werden kann und daher IDO im Zuge der anti-MV Aktivität eine entscheidende Rolle spielt. N2 - Measles virus (MV) belongs to the negative-stranded RNA-viruses of the family Paramyxoviridae and causes acute and subacute encephalitis in humans. It has been described that MV-RNA can be detected in endothelial cells of SSPE (subacute sclerosing panencephalitis)-brains (Cosby & Brankin, 1995). In this work I could show a CD46- and CD150-independent endothelial cell infection with wild-type measles viruses. Furthermore it has been described that after acute infections and vaccinations, the type II-interferon (IFN-g) concentrations are increased (Okada et al., 2001; Ovsyannikova et al., 2003) and this cytokine can also be detected in brain lesions of patients suffering from SSPE (Nagano et al., 1994). Based upon this findings I could detect an indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO) mediated anti-MV activity of gamma interferon. Endothelial cells (ECs) are important target cells during acute measles and complications following the infection. CD46 and CD150 (signalling lymphocytic activation molecule, SLAM) have been described as cellular receptors for MV (Dörig et al., 1993; Naniche et al., 1993; Tatsuo et al., 2000). It has been shown that human ECs from brain and umbilical vein (HBMECs and HUVECs) were CD46-positive, but did not express SLAM neither at RNA- nor at protein level. However, these cells could be infected with the wild-type MV strains, which do not use CD46 as a receptor. These findings suggest the presence of an additional receptor for MV uptake and spread in human ECs. The antiviral effect of interferons plays an important role for the MV-replication. However, this effect depends from the host cell (Schnorr et al., 1993). Attenuated MV strains are more sensitive to type I-interferons than wild-type strains, because wild-type strains can block the induction of IFN-a/b. The V- and C-proteins of MV play a role in this process (Naniche et al., 2000; Patterson et al., 2000; Shaffer et al., 2003). They interact with STAT proteins and IRF-9 (Palosaari et al., 2003; Takeuchi et al., 2003; Yokota et al., 2003). In this work it could be shown, that IFN-g can inhibit the replication of all MV strains preferably in endo- and epithelial cells. Furthermore it could be demonstrated that the antiviral activity induced by IFN-g correlates with the induction of indoleamine 2,3-dioxygenase (IDO). IDO is an enzyme which in the presence of oxygen catalyses the degradation of tryptophan (Hirata et al., 1975) and is known to mediate antiparasitic as well as antibacterial and antiviral effects (Bodaghi et al., 1999; Adams et al., 2004). In the context with measles it has been described that the tryptophan catabolites were increased in SSPE-patients (Kurup & Kurup, 2002). The data in this work show that the IFN-g-induced antiviral activity can be overcome by the addition of L-tryptophan which indicates a decisive role of IDO in the anti-MV activity. KW - Masernvirus KW - Endothelzelle KW - Interferon KW - Masernvirus KW - Interferon KW - Indolamin 2 KW - 3-Dioxygenase KW - Endothelzellen KW - measles virus KW - interferon KW - indoleamine 2 KW - 3-dioxygenase KW - endothelial cells Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-14936 ER - TY - THES A1 - Vogelsang, Carsten T1 - Optimierung der bolusgetriggerten Spiral-Computertomographie der Leber und Vergleich zum empirischen Bolustiming T1 - Optimization of automatic bolus tracking for timing of the arterial phase of helical liver CT N2 - In der vorliegenden Arbeit wurde eine Eignung des Bolus Tracking beim 4-Phasen Spiral CT insbesondere zur Ermittlung einer optimalen Frühphase des hepatobiliären Systems nachgewiesen. Die optimale Frühphase wurde definiert bei 20%-30% Leberenhancement im Vergleich zur portalvenösen Phase. 250 Untersuchungen des Abdomens wurden an einem Spiral CT mit identischem Tischvorschub und Schichtdicke durchgeführt, wobei 200 Patienten mit Bolus Tracking und 50 Patienten mit Standardverfahren untersucht wurden. Die Startverzögerung der Frühphase beim Standardverfahren betrug 25 Sekunden und bei allen 250 Untersuchungen wurde für die portalvenöse Phase ein Delay von 60 Sekunden nach Start der arteriellen Phase gewählt. Zu Beginn der Studie wurden 150 Untersuchungen mit Bolus Tracking untersucht, dabei wurden die Patienten randomisiert auf 6 verschiedene Protokolle mit Schwellenwerten von 50 HE, 75 HE und 100 HE bei Startverzögerungen von 5 und 10 Sekunden aufgeteilt. Es ergab sich ein signifikanter Vorteil für das Protokoll mit einem Schwellenwert von 75 HE und 10 Sekunden Startverzögerung. Weitere 50 Untersuchungen bei einem Schwellenwert von 75 HE und einer Startverzögerung von 10 Sekunden wurden mit 50 Patienten mit Standardverfahren verglichen. Hier zeigte sich kein signifikanter Unterschied Bolus Tracking versus Standardverfahren bei jedoch einem tendenziellen Vorteil des Bolus Tracking. N2 - The aim of this study was to optimize bolus tracking for timing of the arterial phase of biphasic helical liver CT and to compare optimized bolus tracking to a standard delay. One hundred fifty patients were examined with six protocols: 5-or 10-s delay after triggering at a threshold of 50 or 75 or 100 HU enhancement in the aorta at the origin of the celiac arteries after injection of 120 ml contrast material at 3 ml/s. Optimal arterial enhancement was defined as 20-30% of the hepatic enhancement in portal venous phase. Another 50 patients were examined with the optimized protocol and compared to 50 gender- and age-matched patients who underwent a 25-s standard delay. A 10-s delay after the 75-HU threshold resulted in the most patients with an optimal arterial phase (p< 0,01). Thirty-one of 75 patients examined with this protocol showed optimal early liver enhancement. Bolus tracking compared with standard delay revealed only a trend for a difference (p=0,07). The outcome of automatic bolus tracking differs depending on the protocol used;however, optimal arterial phase imaging was seen in only 41% of patients, indicating only a trend for superior timing compared with a standard delay. KW - Spiral-Computertomographie KW - Leber KW - Bolustriggerung KW - Frühphase KW - Computed tomography KW - liver KW - contrast media KW - bolus tracking Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-18527 ER - TY - THES A1 - Müller, Birgit T1 - Induktion und Reparatur von DNS-Schäden im Comet-Assay, klonogene Überlebensrate und Mikrokernfrequenz von humanen Zellen unterschiedlicher Herkunft nach Röntgenbestrahlung in vitro T1 - Radiation induced DNA damage and damage repair in human tumor and fibroblast cell lines assessed by the Comet assay, micronucleus assay and colony-forming assay N2 - Die Entwicklung prädiktiver Testverfahren, mit denen vor einer Bestrahlung die Strahlenempfindlichkeit von Normalgeweben und Turmoren bestimmt werden kann, stellt einen wichtigen Forschungsbereich in der Strahlentherapie dar. Mit solchen Testverfahren würde eine individuelle Strahlentherapie möglich, die bei tolerierbarem Nebenwirkungslevel einen maximalen Effekt am Tumor erzielen könnte. Die vorliegende Arbeit beschäftigt sich mit drei etablierten Testmethoden zur Erkennung von Strahlenschäden an Zellkulturen in vitro. Der Kolonietest, der Mikrokern-Assay und der Comet-Assay wurden mit jeweils acht Zelllinien durchgeführt. Darunter befanden sich Fibroblasten von Patienten mit den hereditären Syndromen Ataxia teleangiektasia und Fanconi-Anämie, zwei Zelllinien von klinisch durchschnittlich strahlensensiblen Patienten und Zellen eines Patienten mit einem AT-ähnlichen Syndrom. Außerdem wurden drei Tumorzelllinien, ein malignes Melanom, ein Chorionkarzinom und ein Glioblastom, getestet. Bei jedem Testverfahren wurde zunächst das Verhalten der einzelnen Zelllinien untersucht und anschließend versucht, Korrelationen zwischen den Verfahren zu finden. Es zeigte sich, dass mit dem Kolonietest, der als Standard unter den prädiktiven Testverfahren gilt, die Zelllinien bezüglich ihrer Strahlensensibilität in einer Reihenfolge angeordnet werden konnten, die der klinischen Erwartung entsprach. Aufgrund bis zu drei Wochen dauernden Inkubationszeiten ist der Kolonietest jedoch für eine klinisch Anwendung ungeeignet. Bei einem Vergleich der Fraktion überlebender Zellen im Kolonietest und dem prozentualen Anteil mikrokernhaltiger Zellen im Mikrokern-Assay nach Bestrahlung mit 1, 2 und 3 Gy konnte für sechs der acht getesteten Zelllinien eine statistisch signifikante Korrelation jeweils innerhalb der einzelnen Zelllinie, nicht jedoch zwischen verschiedenen Zelllinien nachgewiesen werden. Offensichtlich besitzt jede Zelllinie eine unterschiedliche Neigung, Mikrokerne zu bilden, die wiederum dosisabhängig mit der Fraktion überlebender Zellen im Mikrokern-Assay korreliert. Eine sinnvolle Anordnung im Hinblick auf die Strahlensensibilität der einzelnen Zelllinien konnte mit dem Mikrokern-Assay jedoch nicht gezeigt werden. Der Comet-Assay stellt ein gut reproduzierbares mit wenigen Zellen in kurzer Zeit durchführbares Testverfahren dar. Mit Hilfe des Comet-Assays konnte eine signifikante Korrelation zwischen der Fraktion überlebender Zellen im Kolonietest und der Reparaturhalbwertszeit von DNS-Schäden im Comet-Assay für sechs von acht Zelllinien gefunden werden. Diese Ergebnisse wecken zusammen mit anderen aktuellen Studien die Hoffnung, dass mit dem Comet-Assay zumindest für definierte Indikationen in naher Zukunft ein prädiktiver Test für eine klinische Anwendung zur Verfügung stehen wird. N2 - Methods to predict the radioresponse of individual human cancers has long been a major goal of radiation research. The benefits of such a technique would be first to predict the outcome of standard radiotherapy, second, to adjust the prescribed radiation doses to minimize the adverse reaction of normal tissue while maximizing the response of tumor. Spontaneous and radiation-induced genetic instability of 8 cell lines was examined using the single-cell gel electrophoresis (Comet) assay and a micronucleus (MN) test and the results were compared with the clonogenic survival test. The cell lines studied were normal skin fibroblasts derived from 2 cancer patients with normal clinical radiation reaction of the skin, an ataxia telangiectasia (AT) patient, a Fanconi anemia patient and a patient with AT-like syndrome. In addition a malignant melanoma, a chorion carcinoma and a glioblastoma tumor cell lines were studied. As expected, using a colony-forming assay it was possible to rank the tested cell lines according their clinical radiation response. Comparison of the clonogenic survival with the rate of the MN induction revealed a significant correlation for the 6 out of 8 tested cell lines within every cell line. But there was no correlation between different ones. The Comet analysis of in vitro irradiated cells did not revealed any significant correlation between the initial DNA damage and a parameter of SF2 (survival fraction at 2 Gy), however, a significant correlation was found between the clonogenic survival and the DNA repair kinetics for the 6 out of 8 tested cell lines. These data suggest that the Comet assay in vitro could be a useful adjunct to predict clinical radiation reaction. KW - Strahlensensibilität KW - DNS-Reparatur KW - Kolonietest KW - Mikrokern-Assay KW - Comet-Assay KW - radiosensitivity KW - DNA repair KW - Comet assay KW - micronucleus assay KW - colony-forming assay Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-18492 ER - TY - THES A1 - Böhm, Christian T1 - Zytogenetische Untersuchungen an Pankreaskarzinom-Zelllinien transgener TGFalpha/p53+/-Mäuse T1 - Cytogenetic tests of pancreatic carcinoma cell lines of p53 deficient mice overexpressing TGFalpha N2 - Sechs verschiedene Tumorzelllinien aus duktalen Pankreaskarzinomen transgener TGFalpha/p53+/-M?se wurden molekular-zytogenetisch durch Spectral Karyotyping analysiert, um Hinweise auf sekund?e genetische Ver?derungen zu erhalten, die f? die Tumorgenese in diesem Mausmodell verantwortlich sind. Es wurden haupts?hlich numerische Abberationen mit hypertriploiden bis hypotetraploiden Karyotypen detektiert, wohingegen durchschnittlich nur 4,3 Strukturaberrationen pro Metaphase nachgewiesen werden konnten. Fast immer stellten sich einige kleine Markerchromosomen dar, die durch SKY nicht eindeutig identifiziert werden konnten. Auff?ligste Ver?derung der Zelllinie TD2 (MMUPaTu7 und 8=7B) war ein gro?s Markerchromosom, dessen proximaler Anteil mit drei charakteristischen dunklen Banden aus Material von Chromosom 11 bestand, w?rend der distale Abschnitt zu Chromosom 5 geh?te. Durch FISH-Analyse mit spezifischen BAC-Proben f? das Chromosom 11 konnte hierf? eine Amplifikation der Kandidatengene Egfr und c-Rel festgestellt werden. Auch in den anderen Zelllinien traten geh?ft Strukuraberrationen des Chromosoms 11 auf, f? die ebenfalls eine Beteiligung dieser Genloci postuliert werden kann. Weitere strukturelle Ver?derungen betrafen Chromosom 15 mit c-Myc-Amplifikationen in Form von extrachromosomalen "double minutes", welche in h?eren Passagen der Zelllinie TD2 als homogeneously stained regions (HSR) integriert an variablen Positionen des Chromosoms 6 sichtbar wurden. In den analysierten Metaphasen trat zus?zlich h?fig ein vergrößertes Chromosom 8 auf, allerdings im Bandenmuster mit unterschiedlichen Amplifikationseinheiten, wobei ein Gewinn des dort lokalisierten Transkriptionsfaktors Jun-B m?lich w?e. F? eine genauere Charakterisierung der in die verschiedenen Strukturaberrationen involvierten Kandidatengene sind gezielte FISH-Analysen mit lokusspezifischen BAC-Proben oder andere weiterf?rende molekular-genetische Untersuchungen erforderlich. KW - Pankreaskarzinom KW - Spectral Karyotyping KW - transgene TGFalpha-Mäuse KW - pancreatic carcinoma KW - spectral karyotyping KW - p53-deficient mice overexpressing TGFalpha Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-18623 ER - TY - THES A1 - Slobodskyy, Anatoliy T1 - Diluted magnetic semiconductor Resonant Tunneling Structures for spin manipulation T1 - Verdünnt magnetische Halbleiter Resonante Tunnel-Strukturen für Spin Manipulation N2 - In this work we investigate magnetic resonant tunneling diode (RTD) structures for spin manipulation. All-II-VI semiconductor RTD structures based on [Zn,Be]Se are grown by molecular beam epitaxy. We observe a strong, magnetic field induced, splitting of the resonance peaks in the I-V characteristics of RTDs with [Zn,Mn]Se diluted magnetic semiconductors (DMS) quantum well. The splitting saturates at high fields and has strong temperature dependence. A phonon replica of the resonance is also observed and has similar behaviour to the peak. We develop a model based on the giant Zeeman splitting of the spin levels in the DMS quantum well in order to explain the magnetic field induced behaviour of the resonance. N2 - In dieser Arbeit werden magnetische resonante Tunneldioden (RTD) hinsichtlich ihrer Eignung zur Spin-Manipulation untersucht. [Zn, Be]Se basierende II-VI RTD-Strukturen wurden mittels Molekularstrahlepitaxie gewachsen. Man beobachtet eine starke, vom Magnetfeld induzierte Aufspaltung der Resonanz in der U-I Kennlinie derjenigen RTDs, die über einen Quantentrog aus [Zn, Mn]Se verdünnt magnetischen Halbleiter (DMS) verfügen. Diese Aufspaltung hat eine starke Temperaturabhängigkeit und erreicht bei hohen Feldern eine Sättigung. Eine Phononen-Replika der Resonanz wird ebenfalls beobachtet und hat ähnliche Eigenschaften wie die Resonanz selbst. Es wird ein Modell entwickelt, welches auf der Giant-Zeeman-Aufspaltung der Spin-Aufgespalteten Niveaus des DMS-Quantentrogs basiert, um das magnetfeldabhängige Verhalten der Resonanz zu erklären. KW - Resonanz-Tunneldiode KW - Semimagnetischer Halbleiter KW - Magnetoelektronik KW - spintronik KW - spin Injektion KW - verdünnt magnetische Halbleiter KW - resonante Tunneldioden KW - spintronics KW - spin injection KW - diluted magnetic semiconductors KW - resonant tunneling diode Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-18263 ER - TY - THES A1 - Pahlen, Federico von der T1 - Polarization and Spin Effects in Production and Decay of Charginos and Neutralinos at a Muon Collider T1 - Polarisations- und Spineffekte in der Produktion und dem Zerfall von Charginos und Neutralinos am Myon-Beschleuniger N2 - The mechanism of spontaneous symmetry breaking is essential to provide masses to the W and Z gauge bosons and fermions of the SM. We hope to elucidate this mechanism at the next generation of colliders. While the SM has been tested with astonishing precision it is believed to be an effective theory of a more fundamental Great Unified Theory. SUSY is one of the most attractive extensions of the SM of particle physics. Therefore, the search for SUSY is a top priority at the next generation of colliders. Once Higgs bosons are discovered, a precise determination of their properties is necessary to differentiate between different models, in particular the MSSM. A muon collider, running at center of mass energies around the neutral Higgs boson resonances, would allow precise measurements of masses and widths, as well as the couplings to their decay products. In particular their couplings to supersymmetric particles are essential to probe SUSY. Therefore, we study the decays of the heavier CP-even and CP-odd Higgs bosons into lighter chargino or neutralino pairs. In this thesis we have analyzed the polarization effects of the beams and the charginos and neutralinos produced in mu+ mu- annihilation around the center of mass energies of the Higgs boson resonances H and A. For the production of equal charginos we have shown that the ratio of H-chargino and A-chargino couplings can be precisely determined independently of the chargino decay mechanism. This method avoids reference to other experiments and makes only a few model-dependent assumptions. Here we have analyzed the effect of the energy spread and of the error from the non-resonant channels, including an irreducible standard model background contribution. For small tan(beta) the process yields large cross sections of up to a pb. For the production of two different charginos we have shown that the H-A interference can be analyzed using asymmetries of the charge conjugated processes. The asymmetries depend on the muon longitudinal beam polarizations and vanish for unpolarized beams. For the chargino pair production with subsequent two-body decay of one of the charginos we have shown that charge and beam polarization asymmetries in the energy distributions of the decay particles are sensitive to the interference of scalar exchange channels with different CP quantum numbers. This process provides unique information on the interference of overlapping Higgs boson resonances. The effect is larger for regions of parameter space with intermediate values of tan(beta) and light sleptons or LSP neutralinos. For the chargino pair production with subsequent two-body decays of both charginos we have defined energy distribution and angular asymmetries in the final particles, in order to analyze the spin-spin correlations of the charginos. The transverse polarizations of the charginos are sensitive to the CP quantum number of the exchanged Higgs bosons and can thus be used to separate overlapping resonances, as well as to determine the CP quantum number of a single resonance. For equal charginos, these asymmetries are not sensitive to the interference of CP-even and CP-odd Higgs exchange channels. For the neutralino pair production in mu+ mu- annihilation we study similar processes as for chargino production. Line shape measurements of neutralino pair production allow to precisely determine the ratio of H-neutralino and A-neutralino couplings. Neutralino pair production with subsequent two-body decay of one of the neutralinos in the intermediate tan(beta) region is sensitive to the interference of H and A and may be measured with a large statistical significance. The Majorana nature of the neutralinos implies that the beam polarization asymmetries vanish for the remaining production channels. For neutralino pair production with subsequent two-body decays of both neutralinos we analyze similar observables as in chargino production. The main difference consists in the intrinsic relative CP quantum number of the neutralino pair, which depends on the chosen scenario. We have thus shown that the interaction of the Higgs bosons to the gaugino-higgsino sector can be probed at a muon collider in chargino and neutralino pair production, both analyzing the production line-shape around the resonances as well as studying the chargino and neutralino polarizations via their decays. N2 - Der Mechanismus der spontanen Symmetriebrechung ist notwendig, um den W-und Z-Eichbosonen sowie den Fermionen des Standardmodels Masse geben zu können. Wir hoffen, diesen Mechanismus in der nächsten Generation von Teilchenbeschleunigern nachweisen zu können. Obwohl die Vorhersagen des Standardmodels (SM) bisher mit sehr großer Präzision bestätigt werden konnten, glaubt man, dass es sich um einen effektiven Niederenergielimes einer fundamentaleren Großvereinheitlichten Theorie handelt. Supersymmetrie (SUSY) ist eine der attraktivsten Erweiterungen des Standardmodels der Teilchenphysik. Deswegen ist die Suche nach SUSY eine der Prioritäten der nächsten Generation von Beschleunigern. Werden Higgs-Bosonen entdeckt, ist eine präzise Bestimmung ihrer Eigenschaften nötig. Ein Myonenbeschleuniger mit einer Schwerpunktsenergie in der Nähe der Resonanzen der neutralen Higgs-Bosonen würde eine ideale ,,Higgs-Fabrik'' darstellen, die genaue Messungen der Massen und Breiten sowie der Kopplungen und Zerfallsprodukte der Higgsbosonen erlauben würde. Insbesondere deren Kopplungen an SUSY-Teilchen ist wichtig, um das in der Natur realisierte SUSY-Szenario zu ermitteln. Deswegen haben wir die Zerfälle der schwereren CP-geraden und CP-ungeraden Higgs-Bosonen in leichtere Chargino- oder Neutralino-Paare studiert. In dieser Arbeit wurden der Einfluss der Strahlpolarisation der Myonen sowie die Polarisation der Charginos bzw. Neutralinos erzeugt in Myon Annihilation untersucht. Für die Produktion gleicher Charginos wurde gezeigt, dass das Verhältnis der H-Chargino-und der A-Chargino Kopplungen unabhängig vom Chargino Zerfallsmechanismus mit hoher Präzision bestimmt werden kann. Diese Methode vermeidet Anleihen bei anderen Experimenten und macht nur wenige modelabhängige Annahmen. Hier wurde der Effekt der Energieverteilung der Myonenstrahlen und des Fehlers aus den nicht-resonanten Kanäle, mit Berücksichtigung des irreduziblen Standardmodel-Hintergrundbeitrags, untersucht. Für kleine Werte von tan(beta) werden bei diesem Prozess große Wirkungsquerschnitte von bis zu einem pb erzielt. Für die Produktion von zwei unterschiedlichen Charginos wurde gezeigt, dass die H-A-Interferenz mit der Asymmetrie der Wirkungsquerschnitte für ladungskonjugierten Prozesse analysiert werden kann. Diese Asymmetrie hängt von der longitudinalen Strahlpolarisation ab und verschwindet für unpolarisierten Myon-Strahlen. Für Chargino-Paarproduktion mit anschließendem Zweikörperzerfall eines der Charginos haben wir gezeigt, dass die Ladungs-und Polarisationsasymmetrien den Energieverteilungen der Zerfallsprodukte auf die Interferenz der skalaren Austausch-Kanäle mit unterschiedlichen CP-Quantenzahlen sensitiv sind. Dieser Prozess liefert eindeutige Informationen über die Interferenz überlappender Higgsboson-Austausch-Resonanzen. Der Effekt ist für Regionen des Parameterraums mit mittleren Werten von tan(beta) und für leichte Sleptonen oder LSP Neutralinos größer. Für Chargino-Paarproduktion mit anschließendem Zweikörperzerfall beider Charginos wurden Energie- und Winkelverteilungen der Zerfallsprodukte definiert, um damit die Chargino-Spin-Spin-Korrelationen analysieren zu können. Die transversalen Polarisationen der Charginos sind auf die CP-Quantenzahl des ausgetauschten Higgs-Bosons sensitiv. Dadurch kann man überlappende Resonanzen trennen, sowie auch die CP-Quantenzahl einer einzelnen Resonanz bestimmen. Für gleiche Charginos sind diese Asymmetrien auf die Interferenz CP-gerader und CP-ungerader Higgs-Kanäle nicht sensitiv. Es ist deswegen nicht möglich, mit ihrer Hilfe zwischen zwei überlappenden skalaren Resonanzen mit unterschiedlichen CP-Quantenzahlen und einer CP-verletzenden einzelnen Resonanz zu unterscheiden. Für Neutralino Paarproduktion in Myon Annihilation werden, analog zum Chargino Produktionsprozess, Lineshape sowie die anschließenden Zerfälle untersucht. Lineshape-Messungen der Neutralino-Paarproduktion erlauben eine präzise Bestimmung des Verhältnisses der H-Neutralino- und A-Neutralino-Kopplungen. Neutralino Paarproduktion mit anschließendem Zweikörperzerfall eines der Neutralinos für mittleren Werten von tan(beta) ist sensitiv auf Interferenz von H und A ist und kann möglicherweise mit ausreichender statistischer Signifikanz gemessen werden können. Für Neutralino-Paarproduktion mit anschließendem Zweikörperzerfall beider Neutralinos werden die analogen Observablen wie bei der Chargino Paarproduktion analysiert. Ein wesentlicher Unterschied besteht darin, dass die relative intrinsische CP-Quantenzahl des erzeugten Neutralinopaares vom Szenario abhängt. Es wurde somit gezeigt, dass die Wechselwirkung der Higgsbosonen an den Gaugino-Higgsino-Sektor an einem Myonbeschleuniger aus Analysen der Chargino bzw. Neutralino Paar-Produktions-Lineshape an den Resonanzen sowie auch aus der Strahlpolarisations-Abhängigkeit der anschließenden Zerfälle getestet werden können. KW - Neutralino KW - Paarerzeugung KW - Chargino KW - Zerfall KW - Supersymmetrie KW - Myon-Beschleuniger KW - Higgs KW - Supersymmetry KW - Muon Collider KW - Higgs Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-18421 ER - TY - THES A1 - Nikolaev, Viacheslav T1 - Development and application of fluorescent cAMP und cGMP biosensors T1 - Entwicklung und Anwendung fluoreszierender Biosensoren für cAMP und cGMP N2 - The cyclic nucleotides cAMP and cGMP are two ubiquitous important second messengers, which regulate diverse physiological responses from vision and memory to blood pressure and thrombus formation. They act in cells via cAMP- and cGMP-dependent protein kinases (PKA and GK), cyclic nucleotide-gated channels and Epac. Although the concept of cyclic nucleotide signalling is well developed based on classical biochemical studies, these techniques have not allowed to analyze cAMP and cGMP in live cells with high temporal and spatial resolution. In the present study fluorescence resonance energy transfer was used to develop a technique for visualization of cAMP and cGMP in live cells and in vitro by means of fluorescent biosensors. Ligand-induced conformational change in a single nucleotide-binding domain flanked with green fluorescent protein mutants was used for dynamic, highly sensitive measurements of cAMP and cGMP. Such biosensors retained binding properties and chemical specificity of unmodified domains, allowing to image cyclic nucleotides in a physiologically relevant range of concentrations. To develop cAMP-sensors, binding domains of PKA, Epac and cAMP-gated HCN-channel were used. cGMP-sensors were based on single domains of GK and phosphodiesterases (PDEs). Sensors based on Epac were used to analyze spatio-temporal dynamics of cAMP in neurons and macrophages, demonstrating that cAMP-gradients travel with a high speed (~ 40 μm/s) throughout the entire cytosol. To understand the mechanisms of cAMP-compartmentation, kinetics properties of phosphodi-esterase (PDE2) were, next, analyzed in aldosterone producing cells. PDE2 is able to rapidly hydrolyze extensive amounts of cAMP, so that the speed of cAMP-hydrolysis is much faster than that of its synthesis, which might serve as a basis of compartmentation. cAMP-sensors were also used to develop a clinically relevant diagnostic method for reliable detection of β1-adrenergic receptor autoantibodies in cardiac myopathy patients, which has allowed to significantly increase the sensitivity of previously developed diagnostic approaches. Conformational change in a single binding domain of GK and PDE was, next, used to create novel fluorescent biosensors for cGMP. These sensors demonstrated high spatio-temporal resolution and were applied to analyze rapid dynamics of cGMP production by soluble and particulate guanylyl cyclases as well as to image cGMP in mesangial cells. In summary, highly sensitive biosensors for cAMP and cGMP based on single cyclic nucleotide-binding domains have been developed and used in various biological and clinically relevant applications. N2 - Die zyklischen Nukleotide cAMP and cGMP sind zwei ubiquitäre Botenstoffe, die verschiedene physiologische Prozesse regulieren, vom Sehen und Gedächtnis bis zu Blutdruck und Thrombusbildung. Sie wirken über cAMP- und cGMP-abhängige Kinasen (PKA und GK), Kanäle und Epac. Obgleich die Funktionen von zyklischen Nukleotiden in klassischen biochemischen Studien gut untersucht sind, ermöglichen diese Methoden nicht, cAMP und cGMP in lebenden Zellen mit hoher zeitlicher und räumlicher Auflösung zu analysieren. In dieser Arbeit wurde Fluoreszenzresonanzenergietransfer benutzt, um eine Technik für die Visualisierung von cAMP and cGMP in lebenden Zellen und in vitro zu entwickeln. Ligand-induzierte Konformationsänderung in einer einzelnen, mit Grünfluoreszenzproteinmutanten fusionierten Bindungsdomäne diente als Grundlage für Biosensoren, die dynamische, hochsensitive Messungen von cAMP und cGMP ermöglichen. Bei solchen Sensoren wurden die chemischen und Bindungseigenschaften von unmodifizierten Domänen aufrechterhalten, was die cAMP- und cGMP-Messungen im physiologischen Konzentrationsbereich in lebenden Zellen ermöglicht. Für die Entwicklung der cAMP-Sensoren wurden die Domänen von PKA, Epac und von einem cAMP- gesteuerten HCN-Kanal benutzt. cGMP-Sensoren beruhen sich auf den Bindungsdomänen von GK und Phosphodiesterasen (PDEs). Mit Hilfe der auf Epac-basierten Sensoren wurde die cAMP-Dynamik in Neuronen und Makrophagen zeitlich und räumlich aufgelöst. In diesen Zellen diffundiert cAMP mit hoher Geschwindigkeit (~ 40 μm/s) frei durch das ganze Zytosol. Um die Mechanismen der cAMP-Kompartimentierung besser zu verstehen, wurden die kinetischen Eigenschaften der PDE2 in aldosteronproduzierenden Zellen analysiert. PDE2 ist imstande, große Mengen von cAMP äußerst schnell zu hydrolisieren, so dass die Geschwindigkeit der cAMP-Hydrolyse viel höher ist als von cAMP-Synthese, was eine Grundlage der cAMP-Kompartimentierung sein könnte. cAMP-Sensoren wurden auch benutzt, um eine klinisch relevante diagnostische Methode zu entwickeln, die Autoantikörper gegen β1-adrenergen Rezeptoren bei Herzinsuffizienzpatienten zuverlässig nachweist. Diese Methode hat ermöglicht, die Sensitivität der früher entwickelten Techniken zu verbessern. Konformationsänderung in einzelnen Bindungsdomänen von GK und PDE wurde als nächstes benutzt, um ein Reihe neuer fluoreszierender Biosensoren für cGMP zu entwickeln. Diese Sensoren zeigten hohe räumliche und zeitliche Auslösung und wurden zur Analyse schneller Dynamik von cGMP-Synthese und für cGMP-Imaging in Mesangialzellen angewandt. Zusammenfassend wurden hochsensitive Biosensoren für cAMP und cGMP auf Grund einzelner, mit Grünfluoreszenzproteinmutanten fusionierter Bindungs-domäne entwickelt und in verschiedenen biologischen und klinisch relevanten Applikationen eingesetzt. KW - Cyclo-AMP KW - Cyclo-GMP KW - Biosensor KW - Fluoreszenz KW - Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer KW - cAMP KW - cGMP KW - FRET KW - Fluoreszenz KW - Sensor KW - cAMP KW - cGMP KW - FRET KW - fluorescence KW - sensor Y1 - 2005 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-15673 ER -