TY  - THES
A1  - Hondke, Sylvia
T1  - Elucidation of WISP3 function in human mesenchymal stem cells and chondrocytes
T1  - Aufklärung der WISP3 Funktion in humanen mesenchymalen Stammzellen und Chondrozyten
N2  - WISP3 is a member of the CCN family which comprises six members found in the 1990’s: Cysteine-rich,angiogenic inducer 61 (CYR61, CCN1), Connective tissue growth factor (CTGF, CCN2), Nephroblastoma overexpressed (NOV, CNN3) and the Wnt1 inducible signalling pathway protein 1-3 (WISP1-3, CCN4-6).They are involved in the adhesion, migration, mitogenesis, chemotaxis, proliferation, cell survival, angiogenesis, tumorigenesis, and wound healing by the interaction with different integrins and heparan sulfate proteoglycans. Until now the only member correlated to the musculoskeletal autosomal disease Progressive Pseudorheumatoid Dysplasia (PPD) is WISP3. PPD is characterised by normal embryonic development followed by cartilage degradation over time starting around the age of three to eight years. Animal studies in mice exhibited no differences between knock out or overexpression compared to wild type litter mates, thus were not able to reproduce the symptoms observed in PPD patients. Studies in vitro and in vivo revealed a role for WISP3 in antagonising BMP, IGF and Wnt signalling pathways. Since most of the knowledge of WISP3 was gained in epithelial cells, cancer cells or chondrocyte cell lines, we investigated the roll of WISP3 in primary human mesenchymal stem cells (hMSCs) as well as primary chondrocytes.
WISP3 knock down was efficiently established with three short hairpin RNAs in both cell types, displaying a change of morphology followed by a reduction in cell number. Simultaneous treatment with recombinant WISP3 was not enough to rescue the observed phenotype nor increase the endogenous expression of WISP3. We concluded that WISP3 acts as an essential survival factor, where the loss resulted in the passing of cell cycle control points followed by apoptosis. Nevertheless, Annexin V-Cy3 staining and detection of active caspases by Western blot and immunofluorescence staining detected no clear evidence for apoptosis. Furthermore, the gene expression of the death receptors TRAILR1 and TRAILR2,important for the extrinsic activation of apoptosis, remained unchanged during WISP3 mRNA reduction. Autophagy as cause of cell death was also excluded, given that the autophagy marker LC3 A/B demonstrated to be uncleaved in WISP3-deficient hMSCs. To reveal correlated signalling pathways to WISP3 a whole genome expression analyses of WISP3-deficient hMSCs compared to a control (scramble) was performed. Microarray analyses exhibited differentially regulated genes involved in cell cycle control, adhesion, cytoskeleton and cell death. Cell death observed by WISP3 knock down in hMSCs and chondrocytes might be explained by the induction of necroptosis through the BMP/TAK1/RIPK1 signalling axis. Loss of WISP3 allows BMP to bind its receptor activating the Smad 2/3/4 complex which in turn can activate TAK1 as previously demonstrated in epithelial cells. TAK1 is able to block
caspase-dependent apoptosis thereby triggering the assembly of the necrosome resulting in cell death by necroptosis.
Together with its role in cell cycle control and extracellular matrix adhesion, as demonstrated in human mammary epithelial cells, the data supports the role of WISP3 as tumor suppressor and survival factor in cells of the musculoskeletal system as well as epithelial cells.
N2  - WISP3 ist ein Mitglied der CCN-Familie, die aus sechs Familienmitgliedern besteht und in den 1990er Jahren endeckt wurde: Cysteine-rich, angiogenic inducer 61 (CYR61, CCN1), Connective tissue growth factor (CTGF, CCN2), Nephroblastoma overexpressed (NOV, CNN3) und den Wnt1 inducible signalling pathway protein 1-3 (WISP1-3, CCN4-6). Die CCN-Proteine sind durch ihre Interaktion mit verschiede- nen Integrinen und Heparansulfaten involviert in die Regulation der Adhäsion, der Migration, der Mi- togenese, der Chemotaxis, der Proliferation, des Zellüberlebens, der Angiogenese, der Tumorgenese und der Wundheilung. WISP3 ist momentan das einzige Mitglied, das direkt mit einer muskuloskelettalen Erkrankung, der Progressiven Pseudorheumatoiden Dysplasie (PPD), assoziiert wird. PPD ist charakter- isiert durch eine normale embryonale Entwicklung mit fortschreitender Knorpeldegeneration beginnend im Alter von drei bis acht Jahren.
Tierversuche mit knock out oder Überexpression von WISP3 in Mäusen waren nicht in der Lage die Symptome der Erkrankung nachzustellen, da keine Unterschiede im Vergleich zu den Wurfgeschwistern beobachtbar waren.  In vitro  und in vivo  Studien offenbarten eine antagonisierende Rolle für WISP3 im BMP, IGF und Wnt Signalweg.  Da die meisten Informationen über WISP3 jedoch in Epithel- und Krebszellen sowie immortalisierten Chondrozytenzelllinien generiert wurden, untersuchten wir die Rolle von WISP3 in primären humanen mesenchymalen Stammzellen (hMSZs) und primären Chondrozyten. Der WISP3 knock down wurde mit drei short hairpin RNAs in beiden Zelltypen etabliert und wies eine veränderte Zellmorphologie sowie eine reduzierte Zellzahl auf. Knock down mit gleichzeitiger rekombi- nanter WISP3-Behandlung konnte den beobachteten Phänotyp sowie den Zellverlust nicht retten und auch eine Änderung der endogenen Genexpression von WISP3 war nicht zu detektieren. Schlussfolgernd muss WISP3 ein wichtiger Überlebensfaktor sein, dessen Verlust zur Überschreitung von Zellzyklus- Kontrollpunkten führt, was in Apoptose mündet.  Apoptosenachweise wie Annexin V-Cy3 Färbung, Immunfluoreszenzfärbung und Western blot für aktive Caspasen lieferten keine positiven Beweise für diese Form des Zelltodes.	Auch die Genexpression der Todesrezeptoren TRAILR1 und TRAILR2, wichtig für die extrinsische Aktivierung der Apoptose, zeigte kein verändertes Expressionsmuster in WISP3-defizienten hMSZs. Autophagie als Zelltod wurde ebenfalls ausgeschlossen, nachdem im West- ern Blot kein gespaltene Form des Autophagiemarkers LC3 A/B zu detektieren war. Um die Rolle von WISP3 beim Zelltod weiter zu entschlüsseln, wurden Genom-Expressionsanalysen von WISP3-defizienten hMSZs im Vergleich zu Kontroll-hMSZs angefertigt.  Die Analysen ergaben unterschiedlich regulierte Gene vor allem in den Bereichen Zellzyklus-Regulation, Adhäsion, Zytoskelett und Zelltod. Der durch WISP3-Verlust ausgelöste Zelltod kann möglicherweise durch die Aktivierung der Nektroptose über den BMP/TAK1/RIPK1 Signalweg erklärt werden. Es ist bekannt, dass WISP3 BMP4 bindet und so dessen Bindung an den Rezeptor verhindert. Bei WISP3 Verlust bindet BMP4 an seinen Rezeptor und aktiviert den Smad 2/3/4 Komplex der wiederum TAK1 phosphoryliert, wie zuvor in Epithelzellen demonstriert. TAK1 ist in der Lage die Caspase-induzierte Apoptose zu blockieren und auf diese Weise die Bildung des Nekrosomes auszulösen, welches zum Zelluntergang durch Nekroptose führt.
Zusammen mit seiner Rolle in der Zellzyklus-Kontrolle und der extrazellulären Matrixadhäsion, die in humanen Brustepithelialzellen nachgewiesen wurden, unterstützen diese Daten eine Rolle für WISP3 als Tumorsuppressor und Überlebensfaktor in Zellen des Epithel und des muskuloskelettalen Systems.
KW  - Knorpelzelle
KW  - PPD
KW  - mesenchymal stem cells
KW  - cell death
KW  - chondrocytes
KW  - Mesenchymzelle
KW  - Dysplasie
KW  - Genexpression
KW  - Werk
Y1  - 2014
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-109641
ER  - 
TY  - THES
A1  - Laug, Roderich
T1  - Funktionsaufklärung von CYR61 und CTGF in mesenchymalen Stammzellen und Lungenendothelzellen
T1  - Functional examination of CYR61 and CTGF in mesenchymal stem cells and endothelial lung cells
N2  - Cystein rich protein 61 (CYR61/CCN1) und Connective tissue growth factor (CTGF/CCN2) stellen aufgrund ihrer Multifunktionalität zwei sehr interessante Vertreter aus der derzeit sechs Mitglieder umfassenden Familie der CCN-Proteine (CCN- CYR61/CCN1, CTGF/CCN2, NOV/CCN3, WISP1-3/CCN4-6) dar. Seit der Entdeckung von CYR61 und CTGF konnten die überlappenden, aber meist nicht redundanten zellspezifischen Effekte in verschiedenen Zellsystemen nachgewiesen werden. Die Einflüsse auf zahlreiche Prozesse wie Proliferation und Migration, aber auch Angiogenese und das Überleben von Zellen lassen eine weitreichende Bedeutung im Zusammenhang mit vielen Entwicklungsprozessen vermuten, so auch der des muskuloskelettalen Systems und der Entwicklung der Lunge.
In der vorliegenden Arbeit wurden für die nähere Charakterisierung von CYR61 und CTGF humane mesenchymale Stammzellen (hMSC) und die humane primäre Lungenendothelzelllinie HPMEC-ST1.6R (human pulmonary microvascular endothelial cells) gewählt. Beide Zellsysteme sind für die Untersuchung der Funktionsfähigkeit in den verschiedenen Kompartimenten bestens geeignet. So ist die Zelllinie HPMEC-ST1.6R den primären Endothelzellen, im Vergleich mit anderen in der Forschung eingesetzten Zelllinien,  in Bezug auf spezifische Oberflächenmarker am nächsten. Mesenchymale Stammzellen bilden als multipotente Zellen das Rückrat des muskuloskelettalen Systems und sind an der Homöostase des menschlichen Stütz- und Bewegungsapparates maßgeblich beteiligt.
Um experimentell nutzbare Konzentrationen an rekombinanten Proteinen zu erhalten, wurde ein Baculovirus-Expressionsystems gewählt. Nach der erfolgreichen Klonierung der CTGF/Fc-Tag Sequenz in einen Expressionsvektor konnte dies auch durch Produktion in SF21-Insektenzellen erreicht und erstmalig rekombinantes CTGF/Fc von hoher Reinheit gewonnen werden. Allerdings konnte eine beständige Funktionsfähigkeit der aufgereinigten Proteine mittels eines Proliferationstestes nachfolgend nur bedingt bestätigt werden.
Für die weitere Versuchsplanung, einer Untersuchung der Auswirkung von rekombinantem CTGF (rCTGF) bzw. CYR61 (rCYR61) auf die Zielzellen, musste zunächst die zelleigene ctgf bzw. cyr61 Expression herunterreguliert werden, um einen endogenen Störeffekt auszuschließen. Durch den Einsatz spezifischer shRNAs konnte ctgf/CTGF sowohl in den hMSC-, wie auch den HPMEC-ST1.6R-Zielzellen deutlich herunterreguliert und nachfolgend eine markant reduzierte Proliferation beobachtet werden. Ein Effekt für die Regulation von cyr61 blieb aus.
In dieser Arbeit wurden anschließend erstmals mittels Microarray-Analysen Veränderungen im Genexpressionsmuster der ctgf herunterregulierten hMSC- bzw. Lungenendothelzellen gegenüber Kontrollzellen untersucht. Des Weiteren war die Auswirkung einer Behandlung von ctgf herunterregulierten Zielzellen mit rCTGF gegenüber unbehandelten Kontrollzellen von Interesse. Für beide Zellsysteme konnten signifikante Genregulationen nach der Behandlung mit CTGF spezifischen shRNAs gegenüber den Kontrollzellen detektiert werden, mit interessanten Genclustern im Bereich der TGF-beta (transforming growth factor ß) Signalgebung, sowie der fokalen Adhäsion (z.B. VEGF). Eine Behandlung mit rCTGF hingegen zeigte gegenüber den unbehandelten Kontrollzellen in der Auswertung der Microarray-Analyse keine signifikante Veränderung im Genexpressionsmuster.
In dieser Arbeit wurden, neben einer effektiven Gewinnung von rekombinantem CTGF und der Herunterregulation der endogenen ctgf Expression, wichtige Erkenntnisse zur Biologie von CTGF (und CYR61) in mesenchymalen Stammzellen hMSC und der Lungenendothelzelllinie HPMEC-ST1.6R erlangt. Die erhaltenen Microarray-Daten bieten eine fundierte Grundlage für zahlreiche fortführende Untersuchungen.
N2  - Cystein rich protein 61 (CYR61/CCN1) and connective tissue growth factor (CTGF/CCN2) are two very interesting members of the CNN family (CCN- CYR61/CCN1, CTGF/CCN2, NOV/CCN3, WISP1-3/CCN4-6) consisting of six members so far. Since its discovery the overlapping, but mostly non-redundant effects of CYR61 and CTGF were shown in different cell systems. Both proteins are linked to many different processes like proliferation and migration, but also angiogenesis and survival. They seem to be involved in very fundamental biological processes, amongst other the development of the musculoskeletal system and the lung and were analyzed in this study.
To distinguish the two proteins CYR61 and CTGF, primary human mesenchymal stem cells (hMSC) and a human pulmonary endothelial cell line (HPMEC-ST1.6R) were chosen. Both cell systems are suited very well for getting more information about the function in these different compartments. So the cell line HPMEC-ST1.6R is more related to primary endothelial cells in reference to the cell surface markers, compared to other cell lines used for experimental research. Mesenchymal stem cells form the backbone of the musculoskeletal system and are involved in the homeostasis of this complex system.
Getting adequate concentrations of recombinant proteins for the upcoming experiments a baculovirus expression system was chosen. After successful cloning of the CTGF/Fc-Tag sequence into an expression vector, recombinant CTGF/Fc of high purity was obtained for the first time, produced in SF21 insect cells. However the stable functioning of the proteins was partly confirmed by proliferation tests.
To study the effect of recombinant CTGF or CYR61 in further experiments, the endogenous ctgf or cyr61expression had to be downregulated to avoid negative effects. By using specific shRNAs ctgf/CTGF has been downregulated in hMSC as well as HPMEC-ST1.6R cells and subsequently a reduced proliferation was observed. No effect was detected for the regulation of cyr61.
In this study for the first time changes in regulation of gene expression after downregulation of ctgf in hMSC and HPMEC-ST1.6R cells were studied by microarray analyses. Furthermore to discover the effect of treating ctgf downregulated cells with recombinant CTGF compared to control cells was another aim of this experimental series. For both cell systems, significant gene regulations were detected after treatment with CTGF specific shRNAs with interesting gene cluster for TGFß-signaling as well as focal adhesion (e.g. VEGF). In contrast, no significant change in gene regulation was detected by microarray analysis after treating the target cells with rCTGF compared to non-treated cells.
In summary, besides the effective preparation of rCTGF and the marked downregulation of ctgf gene expression, this study provides fundamental information about CTGF and its biology in hMSC and HPMEC-ST1.6R cells, as well. Based on the numerous detected gene regulations in the microarray analyses the study provides a basis for further experiments.
 
KW  - Connective Tissue Growth Factor
KW  - CYR61
KW  - CTGF
KW  - Mesenchymzelle
KW  - Endothelzelle
Y1  - 2014
U6  - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-98711
ER  -