TY - RPRT A1 - Reinders, Heinz T1 - Jugend. Engagement. Politische Sozialisation. Abschlussbericht an die DFG über das Gesamtprojekt 2010-2013. N2 - Gemeinnützige Tätigkeit ist ein gesellschaftlich relevantes Phänomen, das bei nahezu allen Alters und Bevölkerungsschichten ab dem frühen Jugendalter zu finden ist (Freiwilligensurvey, 2010). Jugendliche zwischen 14 und 19 Jahren gehören dabei neben den 30- bis 49-Jährigen zu der besonders häufig gemeinnützig tätigen Alterskohorte (Freiwilligensurvey, 2010: 156). Somit stellen Jugendliche und junge Erwachsene eine bedeutsame Population dar, bei denen es lohnend ist, nach Auswirkungen dieser gemeinnützigen Tätigkeit auf ihre Persönlichkeitsentwicklung im Allgemeinen und ihre politische Sozialisation im Besonderen Ausschau zu halten. Das übergeordnete Ziel des Projekts ist es, den Nachweis eines Entwicklungsnutzens von gemeinnütziger Tätigkeit bei Jugendlichen zu erbringen. Der Arbeits- und Ergebnisbericht knüpft an den Abschlussbericht zur ersten Förderperiode des Projekts (Az. RE1569/6-1) an und ergänzt im Wesentlichen die Auswertungsschritte des Längsschnitts, wie er nach Abgabe des o.g. Abschlussberichts vorlag. Er gliedert sich in die Darstellung der Ziele des Projekts insgesamt sowie die spezifischen Ziele der aktuellen Förderphase (vgl. Kapitel 2.1 & 2.2). Im Anschluss hieran werden das Design der Studie sowie die daraus erzielten Befunde präsentiert (vgl. Kapitel 2.3 & 2.4). T3 - Schriftenreihe Empirische Bildungsforschung - 29 KW - Ehrenamtliche Tätigkeit KW - Engagement KW - Jugend KW - Studie KW - adolescent KW - engagement KW - voluntary service Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-90261 SN - 978-3-923959-91-4 SN - 1867-9994 ER - TY - THES A1 - Sumski, Anna Magdalena T1 - Adenosinrezeptoren auf Zervix-, Uterus- und Mammakarzinomzellen T1 - Adenosine receptors in cervical, uterine and breast cancer cells N2 - Adenosinrezeptoren werden auf nahezu allen Körperzellen exprimiert und übernehmen dort vielfältige und wichtige Funktionen. Auch auf diversen Tumorzelllinien konnten bereits Adenosinrezeptoren nachgewiesen und – je nach Subtyp – mit Pro- oder Anti-tumor-Effekten in Zusammenhang gebracht werden. In dieser Arbeit wurden Gebärmutterhalskrebszellen sowie endometriale und triple-negative Brustkrebszellen auf Expression und mögliche Funktionen von Adenosinrezep-toren untersucht. Da spezifische Antikörper bis heute nicht verfügbar sind, wurde ein pharmakologischer Ansatz mit subtypspezifischen Agonisten und Antagonisten gewählt. In Radioliganden-Bindungsassays, konnte nachgewiesen werden, dass sich auf der Zer-vixkarzinom-Zelllinie SiHa und der Brustkrebs-Zelllinie HCC1806 Adenosinrezeptoren des Subtyps A1 befinden. Die endometrialen Krebszelllinien Ishikawa und HEC-1-A exprimieren Rezeptoren vom Subtyp A1 und A2A. A3-Adenosinrezeptoren wurden auf keiner der untersuchten Zelllinien gefunden. Der Nachweis von A2B-Rezeptoren kann mit dem Radioliganden-Bindungsassay nicht erbracht werden, da bislang kein Radioligand bekannt ist, der eine ausreichende Affini-tät besitzt, um diesen Subtyp zweifelsfrei nachweisen zu können. Obwohl die Mehrheit der untersuchten Zelllinien Adenosinrezeptoren exprimiert, konnte ein signifikanter Effekt auf die Adenylatcyclase bei Stimulation der auf den Zellen vorhandenen Adenosinrezeptoren nur bei den HEC-1-A-Zellen festgestellt werden. Auch auf funktionelle A2B-Rezeptoren fand sich im Adenylatcyclaseassy kein Hinweis. Im durchgeführten Kristallviolettassay zeigte sich ein proapoptotischer Effekt auf Ishi-kawa- und HEC-1-A-Zellen bei hohen Adenosin-Konzentrationen (100 µM). Die im BrdU-Assay gemessene Proliferationsrate hingegen änderte sich nach Vorbehandlung mit Adenosin nicht. Das metabolisch stabilere NECA (in Kombination mit ADA) hatte im Kristallviolettassay einen stärkeren Einfluss auf die Apoptoserate der jeweiligen Zelllinie als Adenosin und auch im BrdU-Assay sank die Menge an inkorporiertem BrdU. Ein Synergismus zwischen Stimulation von Adenosinrezeptoren und diversen Todesliganden bzw. Chemotherapeutika konnte nicht nachgewiesen werden. Freies extrazelluläres Adenosin kann auch aus dem Abbau von ATP generiert werden, wenn Zellen die Ektonukleotidasen CD39 und CD73 exprimieren. Aufgrund der im-munsuppressiven Wirkung von Adenosin können diese Enzyme T-Zell- und NK-Zellantworten im Mikromilieu von Tumoren hemmen. Die durchflusszytometrische Analyse von HEC-1-A- und Ishikawa-Zellen zeigte zwar, dass die Expression von CD39 und CD73 nach Stimulation der Adenosinrezeptoren unverändert blieb. Die Ex-pression von Enzymen, lässt aber vermuten, dass die Zellen in vivo von Adenosin profi-tieren könnten. Angesichts der in vitro Daten, die allenfalls einen wachstumshemmen-den Effekt von Adenosin zeigten, könnte die vorrangige Wirkung von Adenosin im Tumormikromilieu tatsächlich auf der Inhibition von Immunantworten beruhen. Mög-licherweise würden die Rezeptoren dann in erster Linie als Sensoren dienen. Weitere Forschungsarbeit wird helfen, die Rolle der Adenosinrezeptoren im Tumorge-schehen vollständig zu verstehen und möglicherweise für die Krebstherapie nutzbar zu machen. N2 - In this thesis, cell lines from cervical, endometrial and triple-negative breast cancer were investigated for expression and putative functions of adenosine receptors. Due to the lack of specific antibodies, a pharmacological approach using subtype-specific agonists and antagonists was taken. Radio ligand binding assays showed that adenosine receptors of the A1 subtype are expressed by SiHa cervical cancer and by HCC1806 breast cancer cells. Receptors of the A1 and A2A subtype are expressed by the endometrial cancer cell lines Ishikawa and HEC-1-A. A3 adenosine receptors could not be detected in any of the 5 investigated cell lines and the presence of receptors of the A2B subtype cannot be assessed with the available ligands. However, while the majority of the cell lines expressed adenosine receptors, a significant effect of adenosine receptor stimulation on adenylylcyclase activity was only detected in HEC-1-A cells. In crystal violet assays, high concentrations (100 µM) of adenosine showed a proapoptotic effect in Ishikawa- and HEC-1-A cells. The proliferation rate as measured by BrdU uptake was not affected by adenosine. The metabolically more stable adenosine receptor agonist NECA (in combination with ADA) had, in contrast, a stronger impact on the rate of apoptosis in the respective cell lines. Moreover, NECA also reduced BrdU uptake. Using various chemotherapeutics and death ligands, no synergy was observed between stimulation of adenosine receptors and further death stimuli. Free extracellular adenosine can also be generated from ATP when cells express the ectonucleotidases CD39 and CD73. Due to the immunosuppressive effect of adenosine, these enzymes can inhibit T cell and NK cell responses in the tumor microenvironment. Flow cytometry, however, showed that expression of CD39 and/or CD73 remained unaltered after stimulation of adenosine receptors. Thus, further investigations will be required to reveal the functional role of adenosine receptor expression on the investigated tumor cell lines. KW - Adenosinrezeptor KW - Rezeptor KW - Adenosin KW - Gebärmutterhalskrebs KW - Brustkrebs KW - Liganden KW - Adenylatcyclaseassay KW - FACS KW - Bindungsassay KW - BrdU Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-99332 ER - TY - THES A1 - Hartmann, Laura T1 - Die funktionelle Rolle der Transkriptionsfaktoren bZIP1 und bZIP53 in der Arabidopsis thaliana- Wurzel nach Salstress T1 - The functional role of bZIP1 and bZIP53 transcription factors in salt treated roots of Arabisopsis thaliana N2 - Die zunehmende Versalzung des Bodens führt weltweit zu starken Ernteeinbußen. Ob- wohl die Wurzeln der Pflanzen als erstes mit dem Salzstress in Berührung kommen, ist noch nicht viel über Signaltransduktionswege in Wurzeln zur Anpassung der Pflanze an Salzstress bekannt. Die bZIP-Transkriptionsfaktoren der Gruppe S1, bZIP1 und bZIP53, werden gewebespezifisch in der Wurzel nach Salzstress aktiviert. In dieser Arbeit werden diese bZIPs in ein Netzwerk eingeordnet, von der Aktivierung der Tran- skriptionsfaktoren bis zur Funktion in der Regulation des Stoffwechsels in der salzgest- ressten Pflanze. Die Aktivierung von bZIP1 kann über verschiedene sowohl ionische als auch osmotische Stimuli erfolgen und ist abhängig von Calcium, der HEXOKINASE 1 und SnRK1- Kinasen (Snf1 RELATED PROTEIN KINASE 1). Die dunkelinduzierte Expression von bZIP1 wird HXK1-abhängig durch Glucose inhibiert, bei Energiemangelbedingungen ist die Aktivierung von bZIP1 SnRK1-abhängig. Beide Enzyme spielen auch in der salzinduzierten Expression von bZIP1 eine Rolle. Über Transkriptom- und Me- tabolomanalysen kann gezeigt werden, dass bZIP1 und bZIP53 an der Umprogram- mierung des Kohlenhydrat- und Aminosäuremetabolismus teilhaben. Besonders Gene der Glukoneogenese (PYRUVAT ORTHOPHOSPHAT DIKINASE und FRUCTOSE- 1,6-BISPHOS- PHATASE) bzw. des Aminosäurekatabolismus (BRANCHED- CHAIN AMINO ACID TRANSAMINASE 2, METHYLCROTONYL- COA-CARBOXYLASE A und HOMOGENTISATE 1,2-DIOXYGENASE ) werden von den Transkriptionsfaktoren reguliert. Das spricht für eine Umprogrammierung des Metabolismus und der Mobilisierung von Energie aus Aminosäuren zur Anpassung an die Stressbedingungen. Die Transkriptionsfaktoren der Gruppe S1 bilden vorzugsweise Heterodimere mit der Gruppe C. Mit Mutantenanalysen, die zum einen die Transkriptionsfaktoren des C/S1-Netzwerks und zum anderen Komponenten der Abscisinsäure (ABA) abhängigen Signaltransduktion beinhalten, konnte ein Signaltransduktionsnetzwerk aufgestellt werden, das die Antwort auf abiotischen Stress mittels des Signalwegs über ABA, SnRK2 und AREB (ABA RESPONSIVE ELEMENTS-BINDING PROTEIN) mit der SnRK1-vermittelten Antwort auf Energiemangelbedingungen in der Pflanze verknüpft. Die gefundenen stress- bzw. energieresponsiven Gene konnten nach den Mutantenana- lysen auf Grund ihrer unterschiedlichen Regulation in vier Klassen eingeteilt werden, wovon nur eine, die Klasse 4, von dem C/S1 Netzwerk reguliert wird. Die Klassen 1- 3 sind unabhängig von den bZIP-Transkriptionsfaktoren der Gruppe C. Die Klasse 1 bilden typische ABA-responsive Gene, die von den Gruppe A-bZIPs reguliert werden. Faktoren der Gruppe A sind auch an der Expression der Gene der Klasse 2 beteiligt, diese werden aber auch durch bZIP1 und bZIP53 induziert. Dieser Klasse konnten Gene zugeordnet werden, die im Abbau verzweigtkettiger Aminosäuren eine Rolle spielen. Am Aminosäureabbau sind außerdem die Gene der Klasse 2 beteiligt. Für diese Gene konnte eine Expressionsregulation durch bZIP1 und bZIP53 gezeigt werden. Für die Bestimmung möglicher Heterodimerisierungspartner bedarf es noch weiterer Analysen. Dieses Model, das den abitoschen Stress abhängigen ABA-Signalweg mit dem ener- gieabhängigen SnRK1-Signaltransduktionsweg verknüpft, zeigt die präzise Regulation von mindestens 4 Gen-Klassen, deren Expression durch die Kombination verschiedener bZIP-Transkriptionsfaktoren aktiviert wird. N2 - Increasing salinization of soil has led to significant crop loss worldwide. Notwith- standing the fact that plant roots are the first to be affected by salt stress, signal transduction pathways in roots for salt stress adaptation are still mostly unknown In this work the group S1 bZIP transcription factors bZIP1 and bZIP53 that are spe- cifically induced by salt stress in roots, were functionally characterized with respect to their role in salt stress response in plants. Transcriptional activation of bZIP1 can be mediated by both ionic and osmotic stimuli and is dependent on Ca2+, HEXO- KINASE 1 (HXK1) and the SnRK1 kinases (Snf1 RELATED PROTEIN KINASE 1). Dark induced expression of bZIP1 is inhibited by glucose depending on HXK1 acti- vity. In starvation conditions the transcription of bZIP1 is mediated by SnRK1. Here both signaling enzymes are shown to be involved in salt induced bZIP1 transcripti- on. Transcriptome and metabolome analyses reveal an important function of bZIP1 and bZIP53 concerning the reprogramming of primary carbohydrate and amino acid metabolism during salt stress in the Arabidopsis root. Particularly genes involved in gluconeogenesis (PYRUVAT ORTHOPHOSPHAT DIKINASE and FRUCTOSE-1,6- BISPHOSPHATASE )or amino acid catabolism (BRANCHED- CHAIN AMINO ACID TRANSAMINASE 2, METHYLCROTONYL- COA-CARBOXYLASE A and HOMO- GENTISATE 1,2-DIOXYGENASE) are regulated by these transcription factors. This points to reprogramming of metabolism and remobilization of energy by amino acid degradation under stress. Group S1 bZIPs preferably form heterodimers with group C bZIP transcription factors. Mutant analyses of C/S1 bZIPs and ABA signaling com- ponents, respectively, revealed a complex network connecting abiotic stress responses via ABA-SnRK2-AREB (ABA RESPONSIVE ELEMENTS-BINDING PROTEIN) to SnRK1 mediated starvation responses. The detected genes were grouped in four classes according to their different regulation, of which only class 4 is regulated by the C/S1 network. Classes 1-3 are controlled independently of group C transcription factors. Class 1 contains typical ABA responsive genes, regulated by group A bZIPs. These are also involved in gene expression of class 2 genes, which are as well induced by bZIP1 and bZIP53. Genes of branched chain amino acid catabolism belong to this class. Al- so involved in amino acid catabolism are genes of class 2, these genes were shown to be transcriptionally regulated by bZIP1 and bZIP53. Further analyses are required to reveal possible heterodimerization partners. This model, that links the abiotic stress responding ABA pathway to the energy dependent SnRK1 signaling pathway, reveals at least four gene classes that are very precisely regulated by combining different bZIP transcription factors. KW - Salzstress KW - salt KW - Transkriptionsfaktor KW - Ackerschmalwand KW - transcription factors KW - root KW - Wurzel Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-99423 ER - TY - THES A1 - Nerreter, Thomas T1 - Untersuchungen über den Einfluss des Tyrosinkinaseinhibitors Dasatinib auf die Funktion von T-Zellen und aus Monozyten generierten Dendritischen Zellen T1 - Studies on the effect of the tyrosine-kinase inhibitor dasatinib on function of T cells and monocyte-derived dendritc cells N2 - Kinasen der SRC-Familie (SFKs) sind sowohl in Wachstum und Metastasierung von Tumor- und Leukämiezellen als auch an prominenter Stelle in vielgestaltige Signalwege aller Immunzellen involviert. Eine Hemmung von SFKs ist damit ein vielversprechendes Mittel zur Therapie maligner Erkrankungen, kann aber darüber hinaus auch sehr effektiv zur Immunmodulation genutzt werden. Für den zur Therapie von CML und AML zugelassenen Tyrosinkinaseinhibitor (TKI) Dasatinib (Handelsname Sprycel®), für den unter anderem SFKs die Hauptziele darstellen, wurden, neben der antitumoralen Wirkung, sowohl immunsuppressive als auch immunstimulierende Effekte beschrieben. Aus diesem Grund könnte Dasatinib ein für die Modulation von Immunantworten sehr interessantes Hilfsmittel darstellen. In der vorliegenden Arbeit werden die hemmenden und fördernden Einflüsse von Dasatinib auf zwei Typen von Immunzellen genauer untersucht, um so die Auswirkungen einer Dasatinib-Behandlung auf Zellen des Immunsystems besser zu verstehen und sich das immunmodulatorische Potenzial von Dasatinib besser nutzbar machen zu können. Der erste Teil der Arbeit beschäftigt sich mit der Untersuchung möglicher kombinatorischer Effekte zwischen Dasatinib und dem Glucocorticoid Dexamethason auf verschiedene Subsets von T-Zellen vor dem Hintergrund eines potentiellen Einsatzes der Kombination bei der allogenen Hämatopoetischen Stammzelltransplantation (HSCT) zur Separation von Graft-versus-Leukemia (GvL)-Effekten und der Graft-versus-host Disease (GvHD). Während keine kombinatorischen Effekte bei der Aktivierung von T-Zellen auftraten, ergaben sich bei der Untersuchung des Einflusses auf die Proliferation besonders in CD8+ T-Zellen additive Effekte durch die Kombination. Die Proliferation naiver T-Zell-Subsets wurde bereits durch die beiden Einzelsubstanzen alleine stark gehemmt. Dagegen waren Memory T-Zell-Subsets deutlich unempfindlicher, allerdings konnte durch eine Kombination von Dexamethason und Dasatinib auch die Proliferation dieser Memory Subsets effektiv gehemmt werden. Hierbei zeigten sich bei CD8+ Memory Subsets die deutlichsten synergistischen Effekte. Da eine Kombination in stärkerem Maße auch CD8+ gegenüber CD4+ Memory Subsets hemmt und diese Subsets unterschiedliche Rollen in der Induktion von GvL-Effekten und der Auslösung einer GvHD zu spielen scheinen, ist eine Steigerung der GvL-Effektivität durch die Medikamenten-Kombination bei gleichzeitiger Minimierung eines GvHD-Risikos in Zusammenhang mit anderen publizierten Ergebnissen durchaus denkbar. Weil eine starke Hemmung von virus-spezifischen T-Zellen nur bei sehr hohen Konzentrationen auftrat, ist zudem das Risiko einer Virus-Reaktivierung, die ein großes Problem bei einer HSCT darstellt, eher als gering einzuschätzen. Der zweite Teil der Arbeit befasst sich mit dem Einfluss von Dasatinib auf aus Monozyten generierte Dendritische Zellen (moDCs) mit einem Fokus auf der Beeinflussung ihrer Migration. Während eine Behandlung mit Dasatinib nur sehr geringe Auswirkungen auf die Ausreifung der moDCs und die Expression von kostimulatorischen Molekülen hatte, führte eine Dasatinib-Behandlung zu einer Zeit- und Dosis-abhängigen Verringerung der Zytokinsekretion (IL-10 und IL-12). Im Gegensatz dazu hatte Dasatinib keinen Einfluss auf die phagozytotische Aktivität der moDCs und auf ihre Fähigkeit, Virus-spezifische T-Zell-Antworten auszulösen. Dasatinib zeigte dagegen einen deutlich steigernden Einfluss auf die Migration von moDCs gegen einen CCL19-Gradienten im Transwell-Assay, ohne die Expression des CCL19-Rezeptors CCR7 zu beeinflussen. Da ähnliche Migrations-steigernde Effekte auch bei einer Behandlung mit dem spezifischen SFK-Inhibitor SKI-1 auftraten, eine Behandlung mit Nilotinib, einem TKI der nicht auf SFKs wirkt, im Gegensatz dazu aber zu einer Hemmung der Migration führte, liegt es nahe dass die Migrations-steigernde Wirkung von Dasatinib über SFKs vermittelt wird. Dasatinib führte zu einer deutlichen Inhibierung der Phosphorylierung der inhibitorischen Immunrezeptoren Siglec-9 und Siglec-3 (CD33) ohne ihre Expressionslevel zu beeinflussen. Eine mit spezifischen Antikörpern durchgeführte Blockierung dieser Immunrezeptoren, deren ITIM-Domänen mutmaßlich von SFKs phosphoryliert werden, hatte eine deutliche Steigerung der Migration und eine verringerte Phosphorylierung von Siglec-9, Siglec-3 und SHP-2 zur Folge. Letztere ist eine Phosphatase, die nach Bindung an phosphorylierte ITIM-Domänen von Rezeptoren wie den Siglecs verschiedene Zielmoleküle dephosphoryliert. Die Ergebnisse dieser Arbeit legen nahe, dass die Migrations-steigernde Wirkung von Dasatinib über eine Hemmung von SFKs und daraus resultierend auf dem Wegfall eines inhibitorischen Signalwegs erfolgt. Diese Steigerung der Migration könnte in der Tumor-Therapie von großem Nutzen sein, da bei einer Vakzinierung mit autologen DCs, die mit Tumor-assoziierten Antigenen stimuliert wurden, die schlechte Einwanderung in die Lymphknoten eines der Hauptprobleme darstellt. Zur Überwindung dieses Problems könnte Dasatinib ein sehr effektives Hilfsmittel darstellen und die Therapie-Effizienz deutlich verbessern. Da Dasatinib aber auch eine ganze Reihe weiterer, sehr vielfältiger Einflüsse auf alle Arten von Immunzellen ausübt, scheint eine Verwendung spezifischer blockierender α-Siglec-Antikörper auf Grund geringerer Nebenwirkungen im Vergleich zu Dasatinib möglicherweise sogar noch deutlich besser geeignet zu sein, das Migrationsverhaltens Dendritischer Zellen positiv zu beeinflussen. Die Verwendung gegen Siglec-Rezeptoren gerichteter Antikörper als Adjuvantien könnte somit zu einem erfolgreicheren Einsatz der Vakzination mit Dendritischen Zellen in der Tumor-Therapie führen. N2 - SRC-family kinases (SFKs) are involved in growth and metastasis of tumor and leukemic cells as well as in manifold signaling pathways at prominent position in all types of immune cells. Inhibition of SFKs thereby represents a promising tool for the therapy of malignant diseases but can also be used quite effectively for immunomodulation. Besides its antitumoral activity, immune-suppressive as well as immune-stimulatory effects have been described for the tyrosine kinase inhibitor (TKI) dasatinib (trademark Sprycel®) which is approved for the treatment of CML and AML. Therefore the use of dasatinib could be a very interesting method for the modulation of immune responses. The present paper aimes to scrutinize the inhibitory and promoting effects of dasatinib on two types of immune cells to gain a better insight into the consequences of a dasatinib treatment in immune cells and to take advantage of the immunomodulatory potential of dasatinib. The first part of the paper deals with the investigation of potential combinatory effects between dasatinib and the glucocorticoid dexamethasone on various T cell subsets in the context of a potential use of the combination in allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) to dissect Graft-versus-leukemia (GvL) effects and Graft-versus-host Disease. While no combinatory effects regarding T cell activation occurred, the investigation of the influence on T cell proliferation revealed significant additive effects of the combination especially in CD8+ T cells. The proliferation of naïve T cell subsets was inhibited already by use of the single agents. In contrast, memory T cell subsets proved to be much more insensitive, but their proliferation was effectively hampered by a combination of dasatinib and dexamethasone whereas the most pronounced synergistic effects occurred in CD8+ memory subsets. Since the combination more potently inhibits also CD8+ in comparison to CD4+ Memory subsets and since these subsets seem to fulfill diverging roles in mediation of GvL effects and induction of GvHD, an increase in GvL efficacy by the drug combination while concurrently reducing the risk of a GvHD is conceivable, especially when including other published results. Moreover, as a potent inhibition of virus-specific T cells only occurred at very high concentrations, the risk of viral reactivations, which represent a major problem with HSCT, could be considered as rather marginal. The second part of the paper addresses the influence of dasatinib on monocyte-derived dendritic cells (moDCs) with a special focus on its influence on their migration. While dasatinib treatment exhibited only negligible effects on moDCs’ maturation and expression of costimulatory molecules, dasatinib led to a time- and dose-dependent reduction in cytokine secretion (IL-10 and IL-12). In contrast, dasatinib had no influence on phagocytotic activity of moDCs and on their ability to induce virus-specific T cell responses. Notably Dasatinib had a pronounced beneficial effect on migration of moDCs towards a CCL-19 gradient in a transwell assay without altering the expression of the CCL19 receptor CCR7. Since comparable migration-enhancing effects also occurred in presence of the specific SFK-inhibitor SKI-1 while the use of nilotinib, a TKI not inhibiting SFKs, in contrast led to an inhibition of migration, it can be assumed that dasatinib mediates its migration-enhancing effects via an inhibition of SFKs. Dasatinib treatment led to a dramatic decrease in phosphorylation of the inhibitory immunoreceptors Siglec-9 and Siglec-3 (CD33) without altering their expression levels. The use of specific antibodies for blocking of these immunoreceptors, whose ITIM domains are thought to be phosphorylated by SFKs, led to a powerful increase in migration and diminished phosphorylation of Siglec-9, Siglec-3 and SHP-2. The latter is a phosphatase which dephosphorylates target molecules after binding phosphorylated ITIM domains of receptors like the Siglecs. This paper’s results suggest that dasatinib mediates its migration-enhancing effects via inhibition of SFKs resulting in omission of an inhibitory signaling pathway. This enhancement of migratory capacity could be very useful in anti-tumor therapy as limited migration to the lymph nodes is one of the major problems when vaccinating with autologous dendritic cells that were stimulated with tumor-associated antigens. Dasatinib could be a potent mediator to overcome this problem and could lead to an improvement in the efficacy of therapy. Since dasatinib in addition also affects a broad range of processes in all immune cells, the use of specific α-Siglec blocking antibodies seems to be the more appropriate attempt to positively influence the migratory behavior of dendritic cells due to fewer side effects in comparison to dasatinib. Utilization of antibodies that target siglec receptors as adjuvants could lead to a more successful use of a vaccination with dendritic cells in tumor therapy. KW - Protein-Tyrosin-Kinasen KW - Dexamethason KW - T-Lymphozyt KW - Dendritische Zelle KW - Tyrosinkinaseinhibitor Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-99477 ER - TY - THES A1 - Patil, Sandeep S. T1 - Oncolytic virotherapy and modulation of tumor microenvironment with vaccinia virus strains T1 - Onkolytische Virotherapie und Modulation des Tumormilieus mittels verschiedener Vaccinia Virus Typen N2 - Oncolytic viral therapies have shown great promise pre-clinically and in human clinical trials for the treatment of various cancers. Oncolytic viruses selectively infect and replicate in cancer cells, destroying tumor tissue via cell lysis, while leaving noncancerous tissues unharmed. Vaccinia virus (VACV) is arguably one of the safest viruses, which has been intensively studied in molecular biology and pathogenesis as a vaccine for the eradication of smallpox in more than 200 million people. It has fast and efficient replication, and cytoplasmic replication of the virus lessens the chance of recombination or integration of viral DNA into the genome of host cells. Anti-tumor therapeutic efficacy of VACV has been demonstrated for human cancers in xenograft models with a variety of tumor types. In addition recombinant oncolytic VACVs carrying imaging genes represent an advance in treatment strategy that combines tumor-specific therapeutics as well as diagnostics. As for other targeted therapies, a number of challenges remain for the clinical translation of oncolytic virotherapy. These challenges include the potential safety risk of replication of oncolytic virus in non-tumor tissue, the relatively poor virus spread throughout solid tumor tissue and the disadvantageous ratio between anti-viral and anti-tumoral immunity. However, manipulation of components of the tumor microenvironment may help oncolytic virus infection in killing the tumor tissue and thereby increasing the anti-tumor efficacy. Furthermore, dogs with natural cancer are considered as one of the best animal models to develop new drugs for cancer therapy. Traditionally, rodent cancer models have been used for development of cancer therapeutics. However, they do not adequately represent several features that define cancer in humans, including biology of initiation of tumor, the complexity of cancer recurrence and metastasis and outcomes to novel therapies. However, the tumor microenvironment, histopathology, molecular and genomics data from dog tumors has significant similarities with corresponding human tumors. These advantages of pet dog cancers provide a unique opportunity to integrate canine cancer patients in the studies designed for the development of new cancer drugs targeted against both human and canine cancers. This dissertation centers on the use of VACV strains in canine cancer xenografts with the aim of understanding the effects of modulation of tumor microenvironment on VACV-mediated tumor therapy. In the first studies, wild-type VACV strain LIVP6.1.1 was tested for its oncolytic efficiency in canine soft tissue sarcoma (STSA-1) and canine prostate carcinoma (DT08/40) cells in culture and xenografts models. LIVP6.1.1 infected, replicated within, and killed both STSA-1 and DT08/40 cells in cell culture. The replication of virus was more efficient in STSA-1 cells compared to DT08/40 cells. In xenograft mouse models, LIVP6.1.1 was safe and effective in regressing both STSA-1 and DT08/40 xenografts. However, tumor regression was faster in STSA-1 xenografts compared to DT08/40 xenografts presumably due to more efficient replication of virus in STSA-1 cells. Biodistribution profiles revealed persistence of virus in tumors 5 and 7 weeks post virus injection in STSA-1 and DT08/40 xenografts, respectively, with the virus mainly cleared from all other major organs. Immunofluorescence staining detected successful colonization of VACV in the tumor. Consequently, LIVP6.1.1 colonization in the tumor showed infiltration of innate immune cells mainly granulocytes and macrophages in STSA-1 tumor xenografts. These findings suggest that virotherapy-mediated anti-tumor mechanism in xenografts could be a combination of direct viral oncolysis of tumor cells and virus-dependent infiltration of tumor-associated host immune cells. In further studies, the effects of modulation of tumor angiogenesis of VACV therapy were analyzed in canine cancer xenografts. GLV-1h109 VACV strain (derived from prototype virus GLV-1h68) encoding the anti-VEGF single chain antibody GLAF-1 was characterized for its oncolytic efficacy in STSA-1 and DT08/40 cancer cells in culture and tumor xenografts. Concomitantly, the effects of locally expressed GLAF- 1 in tumors on virus replication, host immune infiltration, tumor vascularization and tumor growth were also evaluated. GLV-1h109 was shown to be similar to the parental virus GLV-1h68 in expression of the two marker genes that both virus strains have in common (Ruc-GFP and gusA) in cell cultures. Additionally, the anti-VEGF single-chain antibody GLAF-1 was expressed by GLV-1h109 in both cell cultures and tumor xenografts. The insertion of GLAF-1 did not significantly affect the replication and cytotoxicity of GLV-1h109 in the STSA-1 and DT08/40 cell lines, although at early time points (24-48 hpi), the replication of GLV-1h109 was higher in STSA-1 cells compared to DT08/40 cells. In addition, STSA-1 cells were more susceptible to lysis with GLV-1h109 than DT08/40 cells. GLV-1h109 achieved a significant inhibition of tumor growth in both STSA-1 and DT08/40 canine xenografts models. Consequently, the significant regression of tumor growth was initiated earlier in STSA-1 tumor xenografts compared to regression in DT08/40 xenografts. The reason for the higher efficacy of GLV-1h109 in STSA-1 xenografts than DT08/40 xenografts was attributed to more efficient replication of virus in STSA-1 cells. In addition, tumor-specific virus infection led to a continued presence of GLAF-1 in peripheral blood, which could be useful as a pharmacokinetic marker to monitor virus colonization and persistence in GLV-1h109- injected xenograft mice. GLAF-1 is a single-chain antibody targeting human and murine VEGF. It was demonstrated that GLAF-1 was functional and recognized both canine and human VEGF with equal efficiency. Histological analysis of tumor sections 7 days after GLV-1h109 injection confirmed that colonization of VACV and intratumoral expression of GLAF-1 translated into a significant decrease in blood vessel number compared to GLV-1h68 or PBS-treated control tumors. Subsequently, reduction in blood vessel density significantly improved the spread and replication of VACV as observed by FACS analysis and standard plaque assay, respectively. Inhibition of tumor angiogenesis and increased replication of virus further improved the infiltration of innate immune cells mainly granulocytes and macrophages in STSA-1 tumor xenografts. Both the results, i.e. improved virus spread and increased infiltration of innate immune cells in tumor, were explained by a phenomenon called “vascular normalization”, where anti-VEGF therapy normalizes the heterogeneous tumor vasculature thereby improving delivery and spread of VACV. In summary, the effects of inhibition of tumor angiogenesis on virus spread and replication were demonstrated using a vaccinia virus caring an anti- angiogenic payload targeting vascular endothelial growth factor (VEGF) in canine cancer xenografts. In the final studies, the effects of VACV therapy on modulation of the immune system were analyzed in canine cancer patients enrolled in a phase I clinical trial. V-VET1 (clinical grade LIVP6.1.1 VACV) injection significantly increased the percentages of CD3+CD8+ T lymphocytes at 21 days after initiation of treatment. CD3+CD8+ T lymphocytes are mainly cytotoxic T lymphocytes that have potential to lyse cancer cells. Subsequently, the frequency of immune suppressor cells, mainly MDSCs and Treg was also analyzed in peripheral blood of canine cancer patients. Increase in the MDSC population and decreased CD8/Treg ratio is known to have inhibitory effects on the functions of cytotoxic T cells. We demonstrated that injection of V-VET1 in canine cancer patients significantly reduced the percentages of MDSCs at 21 days post initiation of treatment. Additionally, CD8/Treg ratio was increased 21 days after initiation of V-VET1 treatment. We also showed that changes in the frequency of immune cells neither depends on dose of virus nor depends on tumor type according to the data observed from this clinical trial with eleven analyzed patients. This preclinical and clinical data have important clinical implications of how VACV therapy can be used for the treatment of canine cancers. Moreover, dogs with natural cancers can be used as an ideal animal model to improve the oncolytic virotherapy for human cancers. Furthermore, modulation of tumor microenvironment mainly tumor angiogenesis and tumor immunity has significant impact on the success of oncolytic virotherapy. N2 - Therapien für verschiedenste Krebsarten mittels onkolytischer Viren zeigten sowohl in präklinischen- als auch in humanen klinischen Studien ein erfolgversprechendes Potenzial. Onkolytische Viren infizieren selektiv Krebszellen und replizieren ausschließlich in diesen. In der Folge zerstören sie Tumorgewebe durch Zelllyse, während gesundes Gewebe unbeeinträchtigt bleibt. Das Vaccinia-Virus besitzt ein äußerst geringes Risikopotential, und wurde intensiv auf molekularbiologischer Ebene und in Bezug auf seine Pathogenese untersucht. All das qualifizierte es als Vakzin zur Ausrottung der Pocken und seit Markteinführung mehr als 200 Millionen Menschen injiziert. Das Vaccinia-Virus zeigt eine schnelle und effiziente Replikation, welche im Zytoplasma der Zelle stattfindet. Dies verringert die Möglichkeit der Rekombination oder Integration der viralen DNA in das Wirtsgenom. Die therapeutische Wirksamkeit onkolytischer Vaccinia-Viren (VACVs) wurde in humanen Xenograft-Mausmodellen mit unterschiedlichen Tumorarten gezeigt. Rekombinante onkolytische VACVs, welche mit fluoreszierenden Genen ausgestattet sind, kombinieren die Vorteile tumorspezifischer Therapeutika und dienen gleichzeitig als Diagnostika. Wie auch andere spezifische Therapien, steht auch die onkolytische Virustherapie vor einer Reihe von Herausforderungen. Dazu gehören die Replikation onkolytischer Viren in nicht-kanzerogenem Gewebe, relativ schlechte Virusverbreitung durch solides Tumorgewebe und ein unvorteilhaftes Verhältnis zwischen antiviraler und antitumoraler Immunität. Die gezielte Manipulation einzelner Komponenten des Tumormikromilieus kann jedoch zu einer verbesserten Virusinfektion und Lyse des Tumorgewebes führen und somit die Effizienz der antitumoralen Therapie verstärken. ... KW - Onkolyse KW - Vaccinia-Virus KW - Tumor microenvironment KW - Oncolytic Virotherapy Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-99514 ER - TY - JOUR T1 - einBlick - Ausgabe 24 - 17. Juni 2014 N2 - Nachrichten aus der Julius-Maximilians-Universität Würzburg KW - Würzburg KW - Universität KW - Wurzburg KW - Wuerzburg KW - University Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-99652 UR - http://www.presse.uni-wuerzburg.de/einblick/ VL - 24/2014 ER - TY - JOUR T1 - einBlick - Ausgabe 25 - 24. Juni 2014 N2 - Nachrichten aus der Julius-Maximilians-Universität Würzburg KW - Würzburg KW - Universität KW - Wurzburg KW - Wuerzburg KW - University Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-99679 UR - http://www.presse.uni-wuerzburg.de/einblick/ VL - 25/2014 ER - TY - JOUR T1 - einBlick - Ausgabe 26 - 01. Juli 2014 N2 - Nachrichten aus der Julius-Maximilians-Universität Würzburg KW - Würzburg KW - Universität KW - Wurzburg KW - Wuerzburg KW - University Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-99688 UR - http://www.presse.uni-wuerzburg.de/einblick/ VL - 26/2014 ER - TY - JOUR T1 - einBlick - Ausgabe 27 - 08. Juli 2014 N2 - Nachrichten aus der Julius-Maximilians-Universität Würzburg KW - Würzburg KW - Universität KW - Wurzburg KW - Wuerzburg KW - University Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-99698 UR - http://www.presse.uni-wuerzburg.de/einblick/ VL - 27/2014 ER - TY - THES A1 - Wenzel, Jens T1 - Regulation of TLR-induced macrophage responses by cytoskeleton-associated phosphoproteins T1 - Regulation der Antwort von Makrophagen auf TLR-Stimulation durch Zytoskelett-assoziierte Phosphoproteine N2 - Toll-like receptors (TLR) are pattern recognition receptors (PRR) by which macrophages (MØ) sense pathogen-associated molecular patterns (PAMPs). The recognition of lipopolysaccharide (LPS), the PAMP of gram negative bacteria, by TLR4 triggers signaling cascades and leads to the pro-inflammatory activation of the cells. A recent quantitative and kinetic analysis of the phosphoproteome of LPS-activated primary macrophages highlighted the cytoskeleton as a cell compartment with an enriched protein phosphorylation. In total 44 cytoskeleton-associated proteins were regulated by this post-translational modification and thus might be involved in the control and regulation of key macrophage functions like spreading, motility and phagocytosis. To investigate the control of cytoskeleton-associated cell functions by TLR4 activation, we first developed a method to quantitatively measure the spreading response of bone marrow MØ after stimulation with LPS. Fluorescence microscopy was used for cell imaging and visualisation of the MØ contact area. In collaboration with the Fraunhofer Institute Erlangen, we developed and validated a software tool for the semi-automated segmentation and quantitation of MØ fluorescence microscopy data, which allowed fast, robust and objective image analysis. Using this method, we observed that LPS caused time-dependent spreading, which was detectable after 1-2 h and maximal after 24 h. Next, the impact of genetic or pharmacological inhibition of known TLR signaling components was investigated. Deficiency in the adapter protein MYD88 strongly reduced spreading activity at the late time points, but had no impact early after LPS-stimulation. A similar effect was observed upon pharmacological inhibition of ERK1/2 signaling, indicating that ERK1/2 mediates MYD88-dependent MØ spreading. In contrast, MØ lacking the MAPK p38 were impaired in the initial spreading response but responded normally 8-24 h after stimulation. The genetic deletion of the MAPK phosphatases DUSP1 and DUSP16 resulted in impaired late spreading, corroborating the essential role for functional MAPK signaling in TLR4-driven MØ spreading. To identify the contribution of other cytoskeletal phosphoproteins to MØ spreading, siRNA knockdown of selected candidate genes in primary murine MØ was employed and combined with automated quantitative image analysis. These experiments revealed a functional role for the Myosins MYO1e and MYO1f in MØ spreading. These motor proteins are strongly phosphorylated in LPS-activated MØ. Because of their ability to simultaneously bind to actin filaments and cell membrane or other proteins, we investigated their role in phagocytosis, cytokine production and antigen presentation. Phagocytosis and killing of bacteria were not affected in Myo1e-/- macrophages. However, MYO1e plays a role in chemokine secretion and antigen presentation processes. MCP1 (CCL2) release was selectively increased in Myo1e-deficient MØ and dendritic cells (DC), while cytokine secretion was unaffected. Furthermore, macrophages and DCs lacking MYO1e showed lower levels of MHC-II on the cell surface. However, mRNA levels of CCL2 and of MHC-II were unaltered. These data suggest a role for MYO1e in the transport of selected chemokines and of MHC-II molecules to the cell surface. MHC-II-restricted antigen presentation assays revealed an impaired capacity of macrophages and DC lacking MYO1e to stimulate antigen-specific T cells, suggesting that the reduced MHC-II expression is functionally relevant. Taken together, in this study first a quantitative image analysis method was developed which allows the unbiased, robust and efficient investigation of the macrophage spreading response. Combination of this method with siRNA knockdown of selected cytoskeleton-associated phosphoproteins led to the identification of MYO1e and MYO1f as regulators of macrophage spreading. Furthermore, we identified MYO1e in MØ and DC to be essential for the intracellular transport of CCL2 and MHC-II to the cell surface and for optimal stimulation of antigen-specific CD4 T cells. N2 - Toll-like Rezeptoren (TLR) sind Mustererkennungsrezeptoren (PRR) durch die Makrophagen (MØ) pathogen-assoziierte molekulare Muster (PAMPs) erkennen. Die Erkennung von Lipopolysacchariden (LPS), dem PAMP gramnegativer Bakterien, durch TLR4 löst Signalkaskaden aus, die zu einer pro-inflammatorischen Aktivierung der Zellen führen. Eine quantitative und kinetische Analyse des Phosphoproteoms LPS-aktivierter primärer Makrophagen identifizierte das Zytoskelett als ein Zellkompartiment mit gesteigerter Proteinphosphorylierung. Insgesamt wurden 44 Zytoskelett-assoziierte Proteine identifiziert, die durch diese post-translationale Modifikation reguliert wurden und demzufolge an der Regulation wichtiger Zellfunktionen von Makrophagen wie Spreading, Motilität und Phagozytose beteiligt sein könnten. Um die Kontrolle Zytoskelett-vermittelter Zellfunktionen nach TLR4 Aktivierung zu untersuchen, entwickelten wir zunächst eine Methode zur quantitativen Messung der Spreadingantwort von Knochenmarksmakrophagen nach LPS Stimulation. Die Visualisierung der Zellen sowie ihrer Kontaktfläche erfolgte hierbei mittels Fluoreszenzmikroskopie. Für eine schnelle, robuste und objektive Analyse der Fluoreszenzaufnahmen entwickelten und validierten wir in Kollaboration mit dem Fraunhofer Institut in Erlangen eine Software zur halbautomatischen Segmentierung und Quantifizierung der Kontaktfläche. Unter Verwendung dieser Methode konnte eine zeitabhängige LPS-induzierte Zunahme der Zellkontaktfläche beobachtet werden, die nach 1-2 Stunden detektierbar war und ein Maximum nach 24 Stunden erreichte. Durch den Einsatz pharmakologischer Inhibitoren sowie genetisch veränderter Zellen wurde anschließend der Einfluss bekannter TLR4-Signalwegkomponenten untersucht. Die genetische Defizienz des Adapterproteins MYD88 führte hierbei zu einer stark reduzierten Spreadingaktivität der Zellen während der späten LPS Stimulationsphase, wohingegen das initiale Spreading nicht beeinflusst wurde. Ein vergleichbarer Effekt konnte unter Verwendung eines pharmakologischen Inhibitors zur Hemmung des ERK1/2 Signalweges identifiziert werden. Diese Beobachtungen deuten darauf hin, dass ERK1/2 für die Weiterleitung des MYD88 vermittelten Spreading notwendig ist. Im Gegensatz dazu wurde in p38-defizienten Makrophagen ein beeinträchtigtes initiales Spreading beobachtet, wohingegen das späte Spreading nach 8 – 24 Stunden nicht beeinflusst war. Die genetische Deletion der MAPK Phosphatasen DUSP1 und DUSP16 resultierte ebenfalls in einer Minderung des späten Spreadings, ebenfalls ein Hinweis auf die essentielle Rolle funktioneller MAPK Signalwege. Um die Beteiligung weiter Zytoskelett-Phosphoproteine am Zellspreading zu identifizieren, wurde die Expression ausgewählter Kandidatengene in primären Makrophagen mittels spezifischer siRNA unterdrückt und das Zellspreading mit Hilfe der entwickelten Software quantifiziert. Diese Versuche zeigten eine funktionelle Rolle der Myosine MYO1e und MYO1f. Diese Motorproteine weisen ebenfalls eine starke Phosphorylierung nach LPS Stimulation auf. Aufgrund ihrer Eigenschaft simultan mit Aktinfilamenten und Zellmembranen sowie anderen Proteinen zu interagieren, untersuchten wir ihre Rolle während der Phagozytose, Zytokinfreisetzung und Antigenpräsentation. Obwohl Myo1e defiziente Makrophagen keine Beeinträchtigung der Phagozytose oder Abtötung von Bakterien aufwiesen, spielte das Motorprotein eine wichtige Rolle in der Chemokinfreisetzung und Antigenpräsentation. Interessanterweise war die Sekretion des Chemokins MCP1 (CCL2) in Myo1e-defizienten Makrophagen und dendritischen Zellen (DC) selektiv erhöht, während die Zytokinfreisetzung unbeeinträchtigt war. Des Weiteren wiesen Myo1e KO Makrophagen und DC eine reduzierte MHC-II Oberflächen-Expression auf, obwohl die MHC-II als auch die CCL2 Transkription auf mRNA Ebene nicht beeinflusst war. Diese Daten legen nahe, dass MYO1e während des Transports bestimmter Chemokine, sowie von MHC-II zur Zelloberfläche eine wichtige Rolle spielt. Zudem zeigten Myo1e KO Makrophagen und DC in einem MHC-II-abhängigen Antigenpräsentationsassay eine abgeschwächte Fähigkeit zur Antigen-spezifischen T-Zell Aktivierung, was die funktionelle Relevanz der reduzierten Expression von MHC-II nahelegt. Zusammenfassend wurde in dieser Studie zunächst eine Methode zur quantitativen Bildanalyse entwickelt, welche eine unvoreingenommene, robuste und effiziente Untersuchung des Spreadings von Makrophagen erlaubte. Die Kombination dieser Methode mit dem spezifischen siRNA Knockdown ausgewählter Zytoskelett-assoziierter Phosphoproteine führte zur Identifizierung von MYO1e und MYO1f als wichtige Regulatoren dieser Zellfunktion. Darüber hinaus konnte in Makrophagen und DC eine essentielle Rolle für MYO1e im intrazellulären Transport von CCL2 und MHC-II an die Zelloberfläche identifiziert werden, sowie dessen Notwendigkeit für eine vollständige Aktivierung antigen-spezifischer CD4 T Zellen. KW - Toll-like-Rezeptoren KW - Makrophage KW - Phosphoproteine KW - Zellskelett KW - macrophage KW - cytoskeleton KW - phosphorylation KW - TLR4 Y1 - 2014 U6 - http://nbn-resolving.de/urn/resolver.pl?urn:nbn:de:bvb:20-opus-98843 ER -