Sarah Margaretha Beck

• Cardio- and cerebrovascular diseases (CVDs), such as myocardial infarction and ischemic stroke, are the leading cause of death worldwide, caused by overshooting platelet activation and subsequent thrombus formation. However, at sites of vascular injury this tightly-regulated, multi¬step process is critical to limit blood loss and to prevent bleeding. Anti-platelet agents, such as aspirin or clopidogrel, have been proven to be beneficial in prevention of CVDs, but are associated with an elevated bleeding risk and therefore are oftenCardio- and cerebrovascular diseases (CVDs), such as myocardial infarction and ischemic stroke, are the leading cause of death worldwide, caused by overshooting platelet activation and subsequent thrombus formation. However, at sites of vascular injury this tightly-regulated, multi¬step process is critical to limit blood loss and to prevent bleeding. Anti-platelet agents, such as aspirin or clopidogrel, have been proven to be beneficial in prevention of CVDs, but are associated with an elevated bleeding risk and therefore are often contraindicative. In recent years, the (hem)ITAM-bearing receptors GPVI and CLEC-2 have been identified as critical regulators of platelet activation and thrombus formation, rendering them promising targets for novel anti-platelet drugs. Yet, they are also involved in a plethora of (patho)physiological processes. Consequently, interference with the (hem)ITAM signaling cascade may lead to severe side-effects. In this context, GPV has previously been identified as a mediator of thrombotic and hemostatic function, while its mode of action remains elusive. Therefore, this thesis focused on the function of GPV in thrombotic and hemostatic processes. Extensive characterization of GPV-deficient mice as well as generation and analysis of anti-GPV antibodies and mice with a mutation rendering GPV uncleavable by thrombin (Gp5Kin/Kin) revealed an unexpected role of GPV as a central modulator of platelet activation and thrombus formation. Gp5-/- as well as Gp5Kin/Kin mice restored the thrombotic and hemostatic defect in the absence of both (hem)ITAM receptors. The in-house generated monoclonal anti-GPV antibodies 89F12 and 5G2 were found to reproduce the knockout phenotype and extended the thrombus-modulatory role of GPV beyond (hem)ITAM receptors, pointing to a critical role of thrombin-cleaved soluble GPV (sGPV). Surprisingly, recombinant sGPV had a strong antithrombotic effect in in vivo throm¬bosis models as well as in in vitro flow adhesion assays using human or murine blood, without affecting hemostasis. These data establish GPV as a key player in platelet physiology. Although data gained from studies using genetically modified mice cannot always directly be transferred to humans, the findings presented in this thesis may serve as basis for the generation of novel treatment options for bleeding complications (anti-GPV antibodies) and thrombotic diseases (sGPV) with a good safety profile. The newly generated humanized GPV mouse provides a valuable tool to study human GPV in vivo. A second part of this thesis focused on the analysis of protein kinase C (PKC) ι/λ. PKC family of serine/threonine kinases is involved in several physiological processes regulating platelet activation. However, little is known about atypical PKC isoforms and particularly PKCι/λ has never been studied before in platelets. Therefore, platelet- and megakaryocyte-specific PKCι/λ knockout mice were used to assess its role in platelet function in vitro and in vivo. Surprisingly, PKCι/λ was found to be dispensable for platelet function in thrombosis and hemostasis.…
• Kardio- und zerebrovaskuläre Krankheiten, wie Myokardinfarkt und ischämischer Schlaganfall, sind die häufigste Todesursache weltweit und werden durch überschießende Thrombozyten-Aktivierung und anschließende Thrombusbildung verursacht. Andererseits ist Thrombusbildung nach Gefäßverletzungen ein eng regulierter, mehrstufiger Prozess, der wichtig ist, um Blutverlust zu begrenzen und Blutungen zu verhindern. Thrombozytenaggregationshemmer, wie Aspirin oder Clopidogrel, haben sich in der Prävention von kardiovaskulären Krankheiten als nützlichKardio- und zerebrovaskuläre Krankheiten, wie Myokardinfarkt und ischämischer Schlaganfall, sind die häufigste Todesursache weltweit und werden durch überschießende Thrombozyten-Aktivierung und anschließende Thrombusbildung verursacht. Andererseits ist Thrombusbildung nach Gefäßverletzungen ein eng regulierter, mehrstufiger Prozess, der wichtig ist, um Blutverlust zu begrenzen und Blutungen zu verhindern. Thrombozytenaggregationshemmer, wie Aspirin oder Clopidogrel, haben sich in der Prävention von kardiovaskulären Krankheiten als nützlich erwiesen, erhöhen aber gleichzeitig das Blutungsrisiko und sind deshalb oft kontraindikativ. In den letzten Jahren wurden die (hem)ITAM-gekoppelten Rezeptoren GPVI und CLEC-2 als wichtige Regulatoren der Thrombozytenaktivierung und Thrombusbildung identifiziert, was sie zu vielversprechenden Angriffspunkten in der Entwicklung neuartiger Thrombozyten-aggregationshemmer macht. Beide Rezeptoren sind jedoch an einer Vielzahl von weiteren (patho)physiologischen Prozessen beteiligt, was vermuten lässt, dass eine Interferenz mit der (hem)ITAM Signalkaskade unter Umständen starke Nebenwirkungen hervorrufen kann. Im Zusammenhang mit Untersuchungen zu (hem)ITAM Rezeptoren wurde GPV als wichtiger Mediator thrombotischer und hämostatischer Prozesse identifiziert. Die Wirkungsweise von GPV blieb bislang jedoch unklar. Studien zur physiologischen Rolle von GPV in Thrombose und Hämostase standen daher im Fokus dieser Thesis. Die intensive Charakterisierung von GPV-defizienten Mäusen sowie die Generierung und Analyse von anti-GPV Antikörpern und von Mäusen mit einer Mutation, aufgrund derer GPV nicht mehr von Thrombin geschnitten werden kann (Gp5Kin/Kin), deckten eine unerwartete Rolle von GPV als Regulator der Thrombozytenaktivierung und Thrombusbildung auf. Gp5-/- und Gp5Kin/Kin Mäuse konnten den Verlust der (hem)ITAM Rezeptoren GPVI und CLEC-2 in Thrombose und Hämostase kompensieren. Die eigens generierten monoklonalen anti-GPV Antikörper 89F12 und 5G2 reproduzierten den GPV-knockout Phänotyp und erweiterten die Thrombus-modulierende Rolle von GPV über (hem)ITAM Rezeptoren hinaus. Zusammengenommen weisen die Ergebnisse auf eine wichtige Rolle des Thrombin-geschnittenen, löslichen GPV (sGPV) hin. Überraschenderweise hat rekombinantes sGPV einen starken antithrombotischen Effekt in Thrombosemodellen in vivo und in vitro unter Flussbedingungen in humanem und murinem Blut, ohne die hämostatische Funktion zu beeinflussen. Diese Daten etablieren GPV als wichtigen Akteur in der Thrombozyten-Physiologie. Obwohl Daten aus Studien mit genetisch veränderten Mäusen nicht direkt auf den Menschen übertragbar sind, können die in dieser Arbeit präsentierten Ergebnisse als Grundlage für die Entwicklung neuer Behandlungsmöglichkeiten mit gutem Sicherheitsprofil bei Blutungskomplikationen (anti-GPV Antikörper) und bei thrombotischen Erkrankungen (sGPV) dienen. Eine neu generierte humanisierte GPV Maus bietet zudem ein wertvolles Werkzeug, um humanes GPV in vivo zu untersuchen. Der zweite Teil der Thesis konzentrierte sich auf die Proteinkinase (PKC) ι/λ. Die Familie der PKC aus den Serin/Threonin Kinasen ist an einer Reihe physiologischer Prozesse beteiligt, die Thrombozytenaktivierung regulieren. Zur Rolle atypischer PKC Isoformen in thrombozytären Prozessen ist jedoch wenig bekannt und insbesondere zur Rolle von PKCι/λ in Thrombozyten lagen bisher keine Untersuchungen vor. Diese wurde daher in Thrombozyten- und Megakaryozyten-spezifischen PKCι/λ-knockout Mäusen in vitro und in vivo untersucht. Überraschenderweise zeigte sich, dass die atypische PKC Isoform PKCι/λ im Gegensatz zu vielen anderen Isoformen für die Thrombozytenfunktion bei Thrombose und Hämostase entbehrlich ist.…