Sabrina Hupp

• Streptococcus pneumoniae is one of the major causes of bacterial meningitis, which mainly affects young infants in the developing countries of Africa, Asia (esp. India) and South America, and which has case fatality rates up to 50% in those regions. Bacterial meningitis comprises an infection of the meninges and the sub-meningeal cortex tissue of the brain, whereat the presence of pneumolysin (PLY), a major virulence factor of the pneumococcus, is prerequisite for the development of a severe outcome of the infection and associated tissue damageStreptococcus pneumoniae is one of the major causes of bacterial meningitis, which mainly affects young infants in the developing countries of Africa, Asia (esp. India) and South America, and which has case fatality rates up to 50% in those regions. Bacterial meningitis comprises an infection of the meninges and the sub-meningeal cortex tissue of the brain, whereat the presence of pneumolysin (PLY), a major virulence factor of the pneumococcus, is prerequisite for the development of a severe outcome of the infection and associated tissue damage (e. g. apoptosis, brain edema, and ischemia). Pneumolysin belongs to the family of pore forming, cholesterol-dependent cytolysins (CDCs), bacterial protein toxins, which basically use membrane-cholesterol as receptor and oligomerize to big aggregates, which induce cell lysis and cell death by disturbance of membrane integrity. Multiple recent studies, including this work, have revealed a new picture of pneumolysin, whose cell-related properties go far beyond membrane binding, pore formation and the induction of cell death and inflammatory responses. For a long time, it has been known that bacteria harm the tissues of their hosts in order to promote their own survival and proliferation. Many bacterial toxins aim to rather hijack cells than to kill them, by interacting with cellular components, such as the cytoskeleton or other endogenous proteins. This study was able to uncover a novel capacity of pneumolysin to interact with components of the actin machinery and to promote rapid, actin-dependent cell shape changes in primary astrocytes. The toxin was applied in disease-relevant concentrations, which were verified to be sub-lytic. These amounts of toxin induced a rapid actin cortex collapse in horizontal direction towards the cell core, whereat membrane integrity was preserved, indicating an actin severing function of pneumolysin, and being consistent with cell shrinkage, displacement, and blebbing observed in live cell imaging experiments. In contrast to neuroblastoma cells, in which pneumolysin led to cytoskeleton remodeling and simultaneously to activation of Rac1 and RhoA, in primary astrocytes the cell shape changes were seen to be primarily independent of small GTPases. The level of activated Rac1 and RhoA did not increase at the early time points after toxin application, when the initial shape changes have been observed, but at later time points when the actin-dependent displacement of cells was slower and less severe, probably presenting the cell’s attempt to re-establish proper cytoskeleton function. A GUV (giant unilamellar vesicle) approach provided insight into the effects of pneumolysin in a biomimetic system, an environment, which is strictly biochemical, but still comprises cellular components, limited to the factors of interest (actin, Arp2/3, ATP, and Mg2+ on one side, and PLY on the other side). This approach was able to show that the wildtype-toxin, but not the Δ6 mutant (mutated in the unfolding domain, and thus non-porous), had the capacity to exhibit its functions through a membrane bilayer, meaning it was able to aggregate actin, which was located on the other side of the membrane, either via direct interaction with actin or in an Arp2/3 activating manner. Taking a closer look at these two factors with the help of several different imaging and biochemical approaches, this work unveiled the capacity of pneumolysin to bind and interact both with actin and Arp2 of the Arp2/3 complex. Pneumolysin was capable to slightly stabilize actin in an actin-pyrene polymerization assay. The same experimental setup was applied to show that the toxin had the capacity to lead to actin polymerization through activation of the Arp2/3 complex. This effect was additionally confirmed with the help of fluorescent microscopy of rhodamine (TRITC)-tagged actin. Strongest Arp2/3 activation, and actin nucleation/polymerization is achieved by the VCA domain of the WASP family proteins. However, addition of PLY to the Arp2/3–VCA system led to an enhanced actin nucleation, suggesting a synergistic activation function of pneumolysin. Hence, two different effects of pneumolysin on the actin cytoskeleton were observed. On the one hand an actin severing property, and on the other hand an actin stabilization property, both of which do not necessarily exclude each other. Actin remodeling is a common feature of bacterial virulence strategies. This is the first time, however, that these properties were assigned to a toxin of the CDC family. Cytoskeletal dysfunction in astrocytes leads to dysfunction and unregulated movement of these cells, which, in context of bacterial meningitis, can favor bacterial penetration and spreading in the brain tissue, and thus comprises an additional role of pneumolysin as a virulence factor of Streptococcus pneumonia in the context of brain infection.…
• S. pneumoniae gehört zur Gruppe der Pathogene, die bakterielle Meningitis verursachen, eine Infektion, die hauptsächlich bei Neugeborenen und Kleinkindern in den Entwicklungsländern von Afrika, Asien und Südamerika auftritt, und in diesen Regionen Sterblichkeitsraten von bis zu 50% aufweist. Meningitis ist eine Infektion der Hirnhäute und dem sich direkt darunter befindlichen Cortex-Gewebe. Pneumolysin (PLY), ein Haupt-Pathogenitätsfaktor des sog. Pneumococcus, ist hauptsächlich verantwortlich für einen schweren Verlauf der Infektion und fürS. pneumoniae gehört zur Gruppe der Pathogene, die bakterielle Meningitis verursachen, eine Infektion, die hauptsächlich bei Neugeborenen und Kleinkindern in den Entwicklungsländern von Afrika, Asien und Südamerika auftritt, und in diesen Regionen Sterblichkeitsraten von bis zu 50% aufweist. Meningitis ist eine Infektion der Hirnhäute und dem sich direkt darunter befindlichen Cortex-Gewebe. Pneumolysin (PLY), ein Haupt-Pathogenitätsfaktor des sog. Pneumococcus, ist hauptsächlich verantwortlich für einen schweren Verlauf der Infektion und für Gewebeschädigungen, wie Apoptose, Hirnödemen und Ischämie. Pneumolysin gehört zur Familie der Cholesterol-abhängigen Cytolysine (CDCs), bakteriellen Protein-Toxinen, die an Membran-Cholesterol binden, sich zu großen Aggregaten zusammenschließen und durch die Beeinträchtigung der Membranintegrität (Porenbildung) Zell-Lyse und Zelltod verursachen. Zahlreiche neuere Studien, darunter auch diese Arbeit, haben ein neues Bild von Pneumolysin aufgezeigt, dessen Eigenschaften weit über die Membranbindung, die Poren-Bildung und die Induktion von Zelltod und inflammatorischen Prozessen hinausgehen. Es ist weithin bekannt, dass Bakterien das Gewebe ihres Wirts schädigen, um ihre eigene Vermehrung und ihre Ausbreitung zu begünstigen. In diesem Zusammenhang fungieren bakterielle Toxine als Pathogenitätsfaktoren, die mit zellulären Komponenten, wie dem Zytoskelett und anderen Zytosol-Proteinen interagieren, was allerdings bevorzugt zu Zellveränderungen, und seltener zum Zelltod führt. Die vorliegende Arbeit konnte zeigen, dass Pneumolysin schnelle, und zum Teil gravierende, Aktin-abhängige Zellstruktur-Veränderungen in primären Astrozyten hervorruft. Hierbei wurde das Toxin in Konzentrationen appliziert, die im Liquor von Meningitis-Patienten detektiert werden können, und die zusätzlich als sub-lytisch für Astrozyten in Zellkultur verifiziert wurden. Diese Toxin-Mengen führten zu einem schnellen, horizontalen Aktinkortex-Kollaps, wobei die Membranintegrität erhalten blieb. Dies deutete auf eine „Severing“-Funktion (das Abtrennen oder Zerschneiden von Aktinfilamenten) von Pneumolysin hin, was mit den Beobachtungen übereinstimmt, die in Experimenten mit lebendigen Zellen gemacht wurden (Zellveränderungen, Zellbewegungen und „Blebbings“). Im Gegensatz zu Neuroblastoma Zellen, in denen Pneumolysin Zytoskelett-Veränderungen, und gleichzeitig die Aktivierung von Rac1 und RhoA verursachte, waren die Zell-Veränderungen bei Astrozyten primär unabhängig von der Aktivierung kleiner GTPasen. Obwohl gezeigt werden konnte, dass die Veränderungen vom Aktin-Zytosklett abhängig waren, war das Level an Rac1 und RhoA in den frühen Phasen nach der Toxin-Gabe nicht erhöht. Eine Aktivierung der GTPasen konnte dahingegen zu späteren Zeitpunkten detektiert werden, in denen die Zellbewegung abgeschwächt und verlangsamt war. Die späte Aktivierung kann als Reaktion der Zelle auf die vom Toxin ausgelösten Veränderungen gesehen werden, die zu einer Wiederherstellung der normalen Zytoskelett-Funktion führen soll. GUV-Experimente ermöglichten eine genauere Betrachtung der Pneumolysin-Effekte in einem biomimetischen, jedoch strikt biochemischen Ansatz, der alle zellulären Komponenten enthält, die untersucht werden sollen (Pneumolysin, Aktin, Arp2/3, ATP, und Mg2+). Im GUV-System befand sich das Toxin im Inneren der Vesikel, und Aktin in der extra-vesikulären Suspension, einem Verhältnis genau umgekehrt zum zellullären System. Zusätzlich wurden Arp2/3 und ATP/Mg2+, für die Aktin-Polymerisierung essentielle Faktoren, in der Aktin-Suspension zur Verfügung gestellt. Die GUV-Experimente konnten zeigen, dass Wildtyp-Pneumolysin, allerdings nicht seine Mutante Δ6-PLY (Mutation in der sog. unfolding domain, und deshalb nicht Poren-bildend), seine Effekte auf das Aktin-Zytoskelett durch die Membran-Barriere hindurch, in einer Membran-gebundenen Form ausüben kann. Aktin wurde an den Stellen höchster Toxinbindung aggregiert, was entweder über eine direkte Interaktion von PLY mit Aktin, oder über eine Aktivierung des Aktin-Effektors Arp2/3 durch Pneumolysin erklärt werden kann. Weitere biochemische Ansätze (wie enzyme-linked sorbent assays, ELSAs) und Mikroskopie-Techniken (Immunocyto-Chemie) konnten beweisen, dass Pneumolysin sowohl mit Aktin, als auch mit Arp2 (einer Komponente des heptameren Arp2/3 Proteinkomplexes) direkt interagieren kann. Aktin-Pyren Experimente und Fluoreszenzmikroskopie (von TRITC-markiertem Aktin) wiesen auf eine Kapazität von Pneumolysin hin, Aktin direkt zu stabilisieren, und über die Aktivierung von Arp2/3 eine Aktin-Polymerisierung hervorrufen zu können.…