Antje Kurz

• Störungen des PI3K-AKT-Signalweges treten besonders häufig in Endometrium und Ovarialkarzinomen auf. Ursache kann eine Überaktivierung von Wachstumsfaktor-Rezeptoren, Mutationen oder der Funktionsverlust von PTEN sein, was zu einer Störung der Regulation und damit zu einer Überaktivierung des PI3K-AKTSignalweges führt und so das Einleiten autophagischer Prozesse verhindert. Hierauf kommt es zu unkontrollierter Zellvermehrung, welche zur Tumorentstehung und Tumorprogression beiträgt [12][23]. Die in dieser Arbeit durchgeführten UntersuchungenStörungen des PI3K-AKT-Signalweges treten besonders häufig in Endometrium und Ovarialkarzinomen auf. Ursache kann eine Überaktivierung von Wachstumsfaktor-Rezeptoren, Mutationen oder der Funktionsverlust von PTEN sein, was zu einer Störung der Regulation und damit zu einer Überaktivierung des PI3K-AKTSignalweges führt und so das Einleiten autophagischer Prozesse verhindert. Hierauf kommt es zu unkontrollierter Zellvermehrung, welche zur Tumorentstehung und Tumorprogression beiträgt [12][23]. Die in dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen konnten zeigen, dass die Hemmung des PI3K-AKT-Signalweges durch den PI3K-Inhibitor AEZS-126 erfolgversprechende antiproliferative Effekte in in vitro-Modellen des Ovarialkarzinoms zeigte. In vitro konnte die niedermolekulare Pyridopyrazin-Verbindung AEZS-126 das Wachstum und die Progression von Zellen der parentalen Ovarialkarzinom-Zelllinie A2780, der daraus abgeleiteten cis-Platin-resistenten Tochterzelllinie Acis2780 und der aus einem Ovar-Adenokarzinom gewonnenen Zelllinie SKOV-3 signifikant hemmen. In Vitalitätsassays ermittelte IC50-Werte lagen im mikromolaren Bereich und zeigten konzentrationsabhängige Antitumor-Effekte. Neben den AEZS-126-abhängigen Effekten wurde auch die Wirksamkeit des mTOR-Inhibitors Rapamycin auf die Zelllinien A2780 und Acis2780 untersucht. Es zeigten sich ebenfalls konzentrationsabhängige antiproliferative Effekte. Durch die Kombination der beiden Inhibitoren AEZS-126 und Rapamycin konnte zusätzlich eine gesteigerte Wirksamkeit gegen die Tumorzellen erzielt werden und synergistische Effekte traten auf. ImWestern-Blot konnte nach Inkubation der Ovarialkarzinomzelllinien mit AEZS-126 durch den Einsatz von AEZS-126 eine verminderte Expression von pAKT nachgewiesen werden, welche insbesondere bei den cis-Platin-resistenten Acis2780-Zellen durch die Kombination mit Rapamycin noch verstärkt wurde. Durch FACS-Analysen konnte gezeigt werden, dass die Ovarialkarzinomzellen durch die Behandlung mit AEZS-126 im Wachstum gehemmt werden und unabhängig von ihrer Zellzyklusphase in den Zelltod geführt werden können. So zeigte sich in den Zellzyklusanalysen eine konzentrationsabhängige Verschiebung der Zellzahl von der G0/G1-Phase in die sub-G0-Phase, welche die Population der toten Zellen darstellt. Eine Spezifizierung des Zelltod-Mechanismuses erfolgte einerseits durch Annexin-V-FITC-FACS-Analysen und andererseits durch Vitalitätsassays mit Koinkubation von AEZS-126 mit dem Caspase-Inhibitor zVAD-fmk, dem Nekroptose-Inhibitor Necrostatin-1 und dem Nekrose-Inhibitor Necrox-2. Aus diesen Untersuchungen ging klar hervor, dass AEZS-126 in den Zelllinien A2780, Acis2780 und SKOV-3 Nekroptose induziert. Rapamycin alleine zeigte sowohl apoptotische als auch nekrotische Wirkmechanismen. Die Kombination der beiden Inhibitoren AEZS-126 und Rapamycin führte zu einer synergistischen Wirkverstärkung, was sich in einem verstärkten Absterben der Zellen schon bei geringeren eingesetzten Konzentrationen der beiden Inhibitoren zeigte. Auch hier traten hauptsächlich nekrotische Effekte auf. Von besonderem Interesse war die Interaktion von Ovarialkarzinomzellen (A2780, Acis2780), die mit AEZS-126 vorbehandelt worden waren, mit Zellen des Immunsystems. So konnte gezeigt werden, dass AEZS-126 eine verbesserte Zelllyse der Tumorzellen durch NK-Zellen ermöglicht. Zusätzlich konnten die cis-Platin-resistenten Acis2780-Zellen durch Vorbehandlung mit entsprechende Konzentrationen des PI3KInhibitors in vergleichbarem Ausmaß wie die parentalen A2780-Zellen für die Lyse durch NK-Zellen zugänglich gemacht werden. AEZS-126 scheint auf Grund dieser Ergebnisse und der schon nachgewiesenen guten antiproliferativen Wirkung von AEZS-126 auf verschiedene Zelllinien ein geeigneter Kandidat für weiterführende in vivo-Versuche zu sein. Zusätzlich sollte erwogen werden, neben der Inhibiton des PI3K-AKT-Signalweges eine zeitgleiche Hemmung des Ras-Raf-MEK-ERK-Signalweges in Betracht zu ziehen. Durch die Interaktionen der beiden Signalwege könnte es sonst bei der Inaktivierung des einen zur Aktivierung des anderen Signalweges kommen [143]. Durch eine Überexpression von pAKT durch eine PTEN-Mutation kommt es beispielsweise zur Inaktivierung von Ras und der darauf folgenden Signalkaskade, während ein erhöhtes Expressionsniveau an pAKT im PI3K-AKT-Signalweg zu einer Aktivierung von mTOR und damit zur Hemmung autophagischer Prozesse führt [23]. So kann die Phosphorylierung des Proteins p70S6K, dem Schlüsselmolekül zwischen den beiden Signalwegen, welches mTOR nachgeschaltet ist, durch Rapamycin gehemmt werden und damit zu einer erhöhten Aktivierung von AKT und ERK führen [143]. Durch die Kombinationsbehandlung mit Inhibitoren des PI3K-AKT-Signalweges, die an verschiedenen Stellen der Signalkaskade angreifen, kann, wie in dieser Arbeit gezeigt wurde, die Antitumorwirkung verstärkt werden. Die in dieser Arbeit untersuchten Inhibitoren AEZS-126 und Rapamycin zeigten bei den parentalen Ovarialkarzinom- zellen A2780 und den cis-Platin-resistenten Acis2780-Zellen in der Kombinationsbehandlung synergistische Effekte und führten schon bei geringen Konzentrationen zu verstärkter antiproliferativer Wirksamkeit. Aus den erzielten Ergebnissen geht hervor, dass die Kombinationsbehandlung mit AEZS-126 und Rapamycin geeignet wäre, in in vivo-Experimenten weiter untersucht zu werden.…
• Purpose Platinum resistance is the most crucial problem for treatment of ovarian cancer. There is a clinical need for new treatment strategies which overcome platinum resistance. Recently high level of AKT was shown to be involved in platinum resistance and furthermore in resistance against Natural-killer (NK)-cell mediated killing in ovarian cancer. Methods Here, we investigate the ability of the PI3K/AKT inhibitor AEZS-126 alone and in combination with rapamycin to selectively target ovarian cancer cell proliferation and survival inPurpose Platinum resistance is the most crucial problem for treatment of ovarian cancer. There is a clinical need for new treatment strategies which overcome platinum resistance. Recently high level of AKT was shown to be involved in platinum resistance and furthermore in resistance against Natural-killer (NK)-cell mediated killing in ovarian cancer. Methods Here, we investigate the ability of the PI3K/AKT inhibitor AEZS-126 alone and in combination with rapamycin to selectively target ovarian cancer cell proliferation and survival in vitro by MTT-assays and FACS based analysis. Furthermore the mechanism of cytotoxicity is analysed by FACS based assays. The NK-killing efficiency of ovarian cancer cells with and without pre-treatment with AEZS-126 was analysed. Results AEZS-126 showed good anti-tumour activity in in vitro models of ovarian cancer. Main mechanism of cytotoxicity seems to be necroptosis which could be abrogated by co-incubation with necrostatin-1. Furthermore pre-treatment of platinum resistant cells with AEZS-126 resulted in an increased accessibility of these tumour cells for killing by NK-cells. Conclusion We demonstrated the highly efficient anti-tumour activity of AEZS-126 in in vitro models of ovarian cancer. Due to the good anti-tumour activity and the expected increase in NK-cell mediated killing even of platinum resistant tumour cells, AEZS-126 seems to be a promising candidate for clinical testing in ovarian cancer.…