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Diabetes mellitus Typ 1 ist eine chronische Autoimmunerkrankung, die über eine Zerstörung pankreatischer Beta-Zellen der Langerhans-Inseln zu einem absoluten Insulinmangel führt. Ursächlich für die Zerstörung des Pankreasgewebes sind autoreaktive T-Zellen, die eine Entzündungsreaktion (Insulitis) im Pankreas bewirken.
Zentrales Thema der Promotionsarbeit ist die Erforschung grundlegender quantitativer
und qualitativer Eigenschaften von T-Zellen von Diabetikern im Vergleich zu gesunden, alters-gleichen Kontrollpersonen. Der Fokus der Arbeit liegt dabei auf der Analyse von naiven T-Zellen und ihrer Polarisierbarkeit in proinflammatorische Th17 (Interleukin-17-produzierende) Zellen und regulatorische T-Zellen (Tregs), die die Inflammation unterdrücken können. Voruntersuchungen der Arbeitsgruppe zeigten tendenziell eine proportionale Vermehrung von proinflammatorischen T-Zellen (Th17 Zellen) im peripheren Blut von Typ1 Diabetikern.
Aus dem Vollblut wurden mittels Ficoll-Dichtezentrifugation periphere mononukleäre
Zellen des Blutes (PBMC) gewonnen. Über magnetisch aktivierte Zell-Separation (MACS) wurden naive T-Zellen (CD4+CD45RA+CD27+) aus den PBMCs isoliert. Diese naiven Zellen wurden angeregt sich zu adulten, immunkompetenten Zellen zu differenzieren. Die Antigenstimulation der T-Zellen wurde imitiert durch Aktivierung mit Antikörpern gegen die Moleküle CD3 und CD28 oder einem C. albicans-Antigen. Die Stimulation wurde unter Co-Kultivierung mit autologen antigenpräsentierenden Zellen durchgeführt. Die Richtung der Differenzierung wurde durch Zugabe verschiedener Zytokin-Cocktails beeinflusst. Nach Abschluss der Kultivierung wurde sowohl der Phänotyp der Zellen als auch deren Fähigkeit bestimmte Zytokine zu produzieren mittels Durchflusszytometrie (FACS) bestimmt. Weiterhin wurden Suppressionsassays durchgeführt, bei denen die Suppressionsfähigkeit von aus naiven T-Zellen induzierten Tregs auf autologe PBMCs von Typ 1 Diabetes Patienten überprüft wurde. In dem zunächst durchgeführten Vergleich von Kindern mit einer Erstmanifestation mit gesunden Kontrollen konnte eine stärkere IFN-Produktion gezeigt
werden mit signifikanten Unterschieden innerhalb der Ki67+ Zellen. Interessanterweise zeigte sich diese stärkere IFN Sekretion der T-Zellen der Diabetiker unter Bedingungen, die die Expression von TH17-Zellen fördern sollten. Zusätzlich konnten T-Zellen nachgewiesen werden, die für IFN und IL17 doppelt positiv waren. In weiteren Versuchen wurden auch Vergleiche zwischen längere Zeit an Diabetes erkrankten Kindern und erwachsenen Diabetikern mit gesunden Kontrollen durchgeführt.
Bei den erwachsenen Diabetikern konnten dabei mehr IFN+/IL17+ T Zellen innerhalb der Ki67+ T-Zellen nachgewiesen werden als bei den Kontrollen. Die Zellkulturexperimente wurden im Weiteren mit C. albicans-Antigen als einem spezifischen Stimulus des Immunsystems durchgeführt. Die Untersuchung zeigte zunächst einmal, dass das C. albicans-Antigen bezüglich Proliferation und T-Zell-Differenzierung ein deutlich schwächerer Stimulus im Vergleich zur Stimulation mit aCD3/aCD28 war. Beobachtet werden konnte allerdings, dass es durch Stimulation mit dem C. albicans-Antigen insgesamt zu einer stärkeren Aktivierung des TH17-Zell-Systems kam mit Ausnahme der längere Zeit an einem Diabetes
erkrankten Kinder, die eine geringere IL17-Produktion im Vergleich zu den Kontrollen aufwiesen.
Insgesamt zeigten sich teils deutliche Unterschiede zwischen den Gruppen der Diabetiker, so dass von einer Beeinflussung der Ergebnisse durch Krankheitsdauer, Krankheitsaktivität, Alter der Probanden und Therapiedauer ausgegangen werden muss.
Die Untersuchung des Proliferationsverhaltens ergab sowohl bei den proinflammatorischen
T-Zellen als auch bei den Tregs keine Unterschiede zwischen den Diabetikern und den Kontrollpatienten, ebenso wie die quantitative Untersuchung der Ausbildung von CD25+FOXP3+ Tregs aus den naiven T-Zellen unter unspezifischer Stimulation. Unter spezifischer Stimulation hingegen zeigten sich mehr Tregs bei den Kindern mit einer Erstmanifestation und den erwachsenen Diabetikern.
Ebenfalls unter Stimulation mit dem C. albicans-Antigen zeigten sich unter proinflammatorischen Bedingungen bei den Kindern mit einer Erstmanifestation und unter antiinflammatorischen Bedingungen bei den erwachsenen Diabetikern ein signifikant höherer Anteil CD127- Tregs (CD25+FOXP3+) im Vergleich zu den Kontrollprobanden.
Interessanterweise zeigte sich bei den erwachsenen Diabetikern sowohl bei spezifischer
als auch bei unspezifischer Stimulation eine stärkere Produktion von IL17 durch die Tregs.
Die Untersuchung der Expression des Homing-Rezeptors CD62L auf den Tregs ergab keine signifikanten Unterschiede, aber eine höhere Expression bei allen Diabetikern im Vergleich zu den jeweiligen Kontrollgruppen und die Untersuchung des IFN-Rezeptors erbrachte keine signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen, allerdings zeigten sich die Mediane und Mittelwerte bei den Kindern mit einer Erstmanifestation im Vergleich zu den Kontrollen bei unspezifischer Stimulation erhöht.
Zur Ergänzung der Zellkulturexperimente wurden im Weiteren Suppressionsversuche mit aus naiven T-Zellen induzierten Tregs durchgeführt. Die Suppressionsversuche konnten eine geringere Hemmung der Proliferation durch die induzierten Tregs der Diabetiker zeigen und damit auf eine mögliche Dysfunktion der Tregs deuten.
Um Möglichkeiten der Beeinflussung des Immunsystems zu untersuchen wurden die Zellkulturen erneut unter Blockade von IFNy und Zugabe von TGFb durchgeführt. Die Blockade von IFNy führte zu einer geringer ausgeprägten Differenzierung und Proliferation der T-Zellen. Weiterhin konnten in der intrazellulären Färbung weniger IFN positive T-Zellen gefunden werden und es zeigte sich eine stärkere Expression des IFN-Rezeptors. Bei den Kindern mit einer Erstmanifestation zeigte sich zusätzlich auch eine geringere Ausprägung der IL17+ T-Zellen. Hier ergaben sich keine Unterschiede in der Quantität der Tregs. Die erwachsenen Diabetiker zeigten hier weniger Tregs, dafür aber eine stärkere Proliferation innerhalb der Tregs. Bei den Kindern mit einem längere Zeit bestehenden Diabetes hingegen zeigten sich keine quantitativen Unterschiede.
Die Beeinflussung durch Zugabe von TGFb bei den erwachsenen Diabetikern und den Kindern mit einer Erstmanifestation führte zu einer geringeren T-Zell Differenzierung mit mehr naiven T-Zellen und weniger Memory-T-Zellen sowie zu einer geringeren IFNy Expression. Bei den Erwachsenen zeigte sich ebenso eine geringere Proliferation, geringe Anzahlen für Tregs sowie eine geringe Ausprägung der Expression von CD62L und der Produktion von IL17 durch Tregs.
Insgesamt konnte gezeigt werden, dass es Unterschiede zwischen den proinflammatorischen
T-Zellen sowie den induzierten Tregs der Diabetiker im Vergleich zu den gesunden Kontrollen gibt. Insbesondere die Bedeutung von IFNy bei den Erstmanifestation konnte gezeigt werden. Aber auch die Sekretion von IL17 oder die Expression von CD62L auf den Tregs stellen interessante Ansatzpunkte zur weiteren Erforschung des Diabetes dar. Weiterhin zeigten die Suppressionsversuche eine gestörte Regulation durch die induzierten Tregs bei den Diabetikern. Sowohl die Blockade von IFNy als auch die Zugabe von TGFb zeigten inflammationshemmende Wirkung bei den Lymphozyten der Diabetiker in vitro und stellen
interessante Ansatzpunkt für eine mögliche Therapie dar.
Infektionen durch C. albicans auf den Schleimhäuten sind eine häufige Erkrankung bei Patienten mit einer Schwächung der T-Zellimmunität. Blutstrominfektionen mit der Hefe C. albicans (Candidämie) stellen, vor allem bei Patienten auf Intensivstationen, eine nach wie vor bedrohliche Komplikation mit hoher Letalität dar.
Das pH-regulierte Antigen 1 (Pra1) ist ein Protein, das von C. albicans produziert wird, auf der Oberfläche des Pilzes gebunden vorkommt und auch vom Pilz in den Überstand sezerniert wird. Im humanen System bindet das Protein an T-Zellen an das Oberflächenprotein CD46. Es ist des Weiteren bekannt, dass das Pra1 an bestimmte Immunzellen der Maus (Monozyten und Phagozyten) binden kann. Eine Bindung an T-Zellen der Maus ist bisher nicht beschrieben. Eine genaue Charakterisierung der Interaktion von Pra1 mit Immunzellen der Maus ist interessant, da die Maus als biologischer Modellorganismus zur Erforschung der Infektion mit C. albicans dient. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass rekombinantes Pra1 (rPra1) auch an Maus-CD4+ T-Zellen binden kann.
Es wurden Einflussfaktoren auf die gefundene Bindung von Pra1 an CD4+ T- Zellen gesucht. Als ein Einflussfaktor wurde Zink identifiziert. Pra1 kann an freies Zink binden und durch Zugabe von ZnCl2 während der Inkubation von Pra1 mit T-Zellen kann das Signal von gebundenem Pra1 an CD4+ T-Zellen erhöht werden. Aspf2, ein Protein aus Aspergillus fumigatus mit großer Homologie zu Pra1, kann nicht an diese Zellen binden.
Im in-vivo-Experiment mit Tieren, die mit C. albicans infiziert wurden, konnte kein wildtypisches sezerniertes Pra1 gebunden an T-Zellen nachgewiesen werden. Zellkulturüberstände von C. albicans zeigten nach Inkubation in vitro mit T-Zellen ein Signal für gebundenes Pra1 an CD4+ T-Zellen.
Die Bindungskinetik von Pra1 an T-Zellen zeigte eine über die Zeit der Inkubation konstante Zunahme des Signals von zellgebundenem rPra1 an CD4+ T-Zellen. In der off-Kinetik fand sich eine Abnahme des Signals über die Zeit bis an die Grenze der Nachweisbarkeit.
Der Bindungspartner von Pra1 auf T-Zellen konnte nicht identifiziert werden. Die strukturell und funktionell verwandten Oberflächenproteine Crry, CD59a und CD55 wurden auf Bindungsfähigkeit an T-Zellen in entsprechenden Knockout- Mäusen getestet, konnten jedoch als Rezeptor für Pra1 ausgeschlossen werden. Durch die Bindung von sezerniertem Pra1 an neutrophile Granulozyten wird die Fähigkeit dieser Zellen zur Phagozytose eingeschränkt. Die Bindung von Pra1 an CD4+ T-Zellen führt zur Kostimulation der T-Zellen, also zur verstärkten Zellaktivierung und Proliferation. Durch die Zugabe von 10 μM Zinkchlorid wird die kostimulatorische Aktivität von Pra1 verstärkt.
Während der Zellaktivierung von Effektor-Memory-CD4+ T-Zellen reduziert rPra1 die Sekretion von IFN-γ. Diese Reduktion von IFN-γ-produzierenden Zellen entsteht nicht durch einen Einfluss von Pra1 während der Zellaktivierung von naiven CD4+ T-Zellen zu Th1-Zellen und auch nicht durch die Auslösung von Apoptose in IFN-γ-produzierenden Th1-Zellen. Die Bindung von Pra1 an CD4+- T-Zellen, die über den T-Zell-Rezeptor aktiviert werden, reduziert in vitro die Sekretion des Zytokins. Zusätzlich werden weitere Zytokine in ihrer sezernierten Menge reduziert wie IL-2 und TNF-α.
Zytotoxische CD8+ T-Zellen spielen eine bedeutende Rolle in der Immunantwort gegen HIV-1. Trotz allem kommt es jedoch im Verlauf der Infektion bei den meisten Betroffenen zum Anstieg der Viruslast und Abfall der CD4 Zellzahl, obwohl auch in diesem fortgeschrittenen Stadium der Infektion virusspezifische CD8+ T-Zellantworten mittels INF-γ-Produktion nachgewiesen werden können. Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, weitere funktionelle und phänotypische Merkmale von CD8+ T-Zellen zu untersuchen, um eine mögliche Ursache für die im Verlauf der Infektion ineffizient werdende Immunantwort zu finden. Einen statistisch signifikanten Unterschied der INF-γ Produktion CD8+ T-Zellen zwischen Progressors und Controllers ließ sich mittels INF-γ Elispot bei den von uns untersuchten Patienten nicht nachweisen. Es ist also davon auszugehen, dass CD8+-T-Zellen im fortgeschrittenen, chronischen Stadium der Infektion funktionelle Lücken aufweisen, die sich nicht durch INF-basierte Untersuchungsmethoden nachweisen lassen. Anhand intrazellulärer Zytokinfärbung ließ sich unabhängig vom Schweregrad der Infektion eine erhaltene Produktion der Zytokine INFγ und TNFα, nicht hingegen eine Produktion von IL-2 nachweisen. Bei der Untersuchung HIV spezifischer CD8+ T-Zellen mit Hilfe von Tetramerfärbungen zeigte sich in Bezug auf den Aktivierungsgrad, gemessen an der CD38-Expression, ein deutlicher Unterschied zwischen Progressors und Controllers, der innerhalb der HIV-spezifischen CD8+ T-Zellen im Vergleich zur gesamten CD8+ T-Zellpopulation noch ausgeprägter zu erkennen war. Hier gab es eine signifikante positive Korrelation zur Viruslast und eine signifikante negative Korrelation zur CD4-Zellzahl der HIV-Infizierten. Anhand des Aktivierungsmarkers HLA-DR ließ sich dieser Unterschied nicht nachweisen. Im Bezug auf die Proliferationsfähigkeit, Apoptoseempfindlichkeit und lytische Funktion HIV-spezifischer Zellen konnte kein statistisch signifikanter Unterschied zwischen Progressors und Controllers ausgemacht werden. Schlüsse für die Gesamtheit der HIV-spezifischen Zellen eines HIV-Infizierten kann man natürlich nicht ziehen. Man darf nicht außer Acht lassen, dass uns lediglich eine begrenzte Anzahl von Epitopen bei den durchgeführten Untersuchungen zur Verfügung stand. Es wurde jedoch deutlich, dass es feine Unterschiede und Trends zu geben scheint, die eine gezielte weiterführende Untersuchung erfordern. Weiterhin ist auch zu bedenken, dass möglicherweise andere Faktoren, als die von uns untersuchten, für den unterschiedlichen Krankheitsverlauf verantwortlich sein können. Welche Faktoren nun tatsächlich die Ursache sind dafür, dass das menschliche Immunsystem gegen das HI-Virus in der Regel früher oder später verliert, bleibt weiterhin offen. Sehr wahrscheinlich handelt es sich hierbei um das Zusammenspiel mehrerer Mechanismen. Die gezielte Untersuchung HIV-spezifischer Zellen ist bei der weiteren Erforschung der genauen Zusammenhänge unerlässlich.
TRAIL (TNF Related Apoptosis Inducing Ligand), ein Mitglied der TNF-Ligandenfamilie, wurde bislang hauptsächlich hinsichtlich seiner dominanten Funktion als Auslöser des apoptotischen Programms untersucht. In neueren Untersuchungen konnte allerdings gezeigt werden, dass TRAIL unter bestimmten Bedingungen auch eine starke Aktivierung nicht-apoptotischer Signalwege induzieren kann. Um die Mechanismen der TRAIL-induzierten nicht-apoptotischen Signaltransduktion genauer zu untersuchen, wurde in der hier vorliegenden Arbeit besonderes Augenmerk auf die TRAIL-vermittelte Aktivierung des Transkriptionsfaktors NFkB und deren Modulation durch Interferon gamma und FLIP gelegt. Hierbei konnte gezeigt werden, dass Interferon gamma, neben einer synergistischen Wirkung hinsichtlich der TRAIL-induzierten Apoptose, unter nicht-apoptotischen Bedingungen, die durch Caspase-Inhibition oder Bcl2-Überexpression geschaffen wurden, auch eine verstärkende Wirkung auf die TRAIL-induzierten NFkB-Aktivierung in KB-Zellen entfaltet. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass FLIP, ein Inhibitor der Caspase-8-Aktivierung, dessen Expression unter anderem durch Interferon gamma reguliert wird, neben einer Apoptose-inhibierenden Wirkung auch die TRAIL-induzierte NFkB-Aktivierung in KB-Zellen inhibiert, was auf eine gemeinsame Regulation beider Mechanismen auf der Ebene des DISC (Death Inducin Signaling Complex) hindeutet.