Institut für Pharmazie und Lebensmittelchemie
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Eines der größten Probleme bei Granulationsprozessen in der pharmazeutischen Industrie ist die Feuchtigkeit der Prozessluft. Kann bzw. möchte man die Luft aus ökonomischen oder sonstigen Gründen hinsichtlich ihres absoluten Feuchtgehalts nicht konditionieren, bleibt bei hoher Luftfeuchte – wie sie z.B. beim Aufzug eines Gewitters oder bei heftigen Regenfällen auftritt – oft nur die Option des Produktionsstillstandes. Die vorliegende Arbeit befasst sich einerseits mit der Frage, ob es möglich ist, unabhängig von den Außenluftbedingungen – wie Temperatur, Druck und relative Feuchte – Granulate mit vergleichbaren Eigenschaften zu reproduzieren. Zum anderen soll geklärt werden, welchen Einfluss verschiedene Prozess- und Materialparameter bzw. deren Schwankungen auf das Endprodukt haben, und was dies wiederum für eine Automatisierung des Prozesses bzw. für die Anforderungen an eine Steuer- und Regelung der Herstellanlage bedeutet. Ausgehend von der Massenbilanzierung einer Wirbelschichtgranulierung wird der Einfluss verschiedener Prozess- und Materialparameter auf ein Standardgranulat untersucht. Die Ergebnisse der unterschiedlichen Versuchsreihen bestätigen einerseits die Reproduzierbarkeit von Granulateigenschaften basierend auf den Berechnungen der kritischen Sprührate. Andererseits zeigen sie den Einfluss verschiedener Prozess- und Materialparameter auf die Qualität des Endproduktes. Hieraus können wichtige Erkenntnisse für eine automatische Steuer- und Regelung der Herstellanlage abgeleitet und entsprechende Sollanforderungen für jeden einzelnen Prozessparameter sowie die überwachenden Sensoren definiert werden. Die Berechnungen zur Machbarkeit eines Granulatansatzes sind eine wertvolle Entscheidungsgrundlage hinsichtlich der Planung einer Granulatherstellung und dienen auch für eine Ansatzvergrößerung als Kalkulationsbasis. Ebenso kann die Algorithmenabfolge der „kritischen Sprührate“ zusammen mit den Formeln der „Berechnungen zur Machbarkeit“ für die Anpassung der Prozessparameter an die jahres- und tageszeitlichen Schwankungen der Außenluft herangezogen werden. Wie theoretische Studien zum „Ausgleich der Außenluftbedingungen“ aufzeigen, ist es mit Hilfe dieser Algorithmen möglich, die freie Feuchte während der Sprühphase auf ein definiertes Niveau zu bringen und dort zu halten. Dieser Anteil an überschüssigem Wasser ist primär für das Kornwachstum und somit für die Reproduktion von Granulaten verantwortlich. Die vorliegende Arbeit stellt mit ihren theoretischen Ansätzen einen entscheidenden Schritt hin zu einer automatisierten Wirbelschichtanlage dar. Sie zeigt Ansatzpunkte für ein mögliches Vorgehen auf und liefert Hinweise für die Anforderungen an Messsensoren sowie Steuer- und Regeleinheiten.
Aus früheren Untersuchungen ist bekannt, dass Fleischerzeugnisse höhere Gehalte an polychlorierten Biphenylen (PCB) und polychlorierten Dibenzo-p-dioxinen bzw. polychlorierten Dibenzofuranen (PCDD/F) aufweisen als das unverarbeitete Fleisch selbst. Aufgrund dessen war es Ziel dieser Arbeit, mögliche Kontaminationsquellen für diese Substanzen in Fleischerzeugnissen zu finden. Als Einstieg in die Thematik wurden Bratwurstproben auf ihren WHO-PCB- und WHO-PCDD/F-TEQ untersucht. Dabei hat man auch Produktionsgeräte für Fleischerzeugnisse auf ihr Potential geprüft, diese mit den genannten Substanzen zu kontaminieren. Bei den weiteren Arbeiten wurde besonderes Augenmerk auf die Untersuchung von verschiedenen Gewürzen und Gewürzextrakten gelegt. Wiesen Gewürze Kontaminationen mit den genannten Stoffen auf, wurde möglichen Ursachen nachgegangen. Eine weitere, wichtige Fragestellung war in diesem Zusammenhang, ob und in welchem Ausmass PCBs und Dioxine durch die Extraktion der Gewürze mit organischen Lösemitteln bzw. überkritischem CO2 in den Extrakt übergehen können. Die Bestimmung der WHO-PCDD/F- bzw. WHO-PCB-TEQ in Gewürzen erfolgte nach einem von uns speziell für Gewürze entwickeltem, aufwendigem Clean-Up mittels Kapillargaschromatographie und anschließender hochauflösender Massenspektrometrie (HRGC-HRMS). Die Abtrenn- und Aufreinigungsschritte umfassten (i) Gefriertrocknung, (ii) Homogenisation mit Zusatz an internem Standard, (iii) Separierung mittels beschleunigter Lösemittelextraktion; (iv) verschiedene nacheinander geschaltete Flüssigchromatographie-Schritte (Gelpermeation; Florisil; schwefelsaures Kieselgel; Aktivkohle). Zusammenfassend lässt sich an Einzelergebnissen festhalten: - Aufgrund der Untersuchung von Bratwurstproben (aus einem Zeitraum von zwei Jahren) waren betriebsspezifische Ursachen wie Betriebseinrichtungen - z.B. veraltete Geräte oder ähnliches - für eine Kontamination von Fleischerzeugnissen mit PCB oder Dioxinen nicht grundsätzlich auszuschließen. Sie sind aber wenig wahrscheinlich. - Lediglich bei der Verwendung von über 40 Jahre alten Geräten ergab sich eine Tendenz zur Kontamination von Fleischerzeugnissen mit PCB, aber nicht mit Dioxinen. - Bei der Untersuchung von Gewürzen wurde festgestellt, dass Blattgewürze tendenziell höhere PCB- und Dioxingehalte aufweisen als andere Gewürzarten. - Weder das Erntejahr noch der Erntezeitpunkt (unterschiedliche Wachstumsstadien) sind ausschlaggebend für eine stark variierende Kontamination mit den Analyten. - Bei Aufschlüsselung der einzelnen Proben nach deren Herkunft zeigte sich, dass eine Kontamination standortspezifisch hervorgerufen werden kann. - Die Trocknung (in verschiedenen Varianten) und weitere bei Blattgewürzen gängige Verarbeitungsschritte sind aufgrund der erzielten Ergebnisse als Ursache für die höheren PCB- bzw. Dioxingehalte in Blattgewürzen auszuschließen. - Die Untersuchung von Gewürzextrakten zeigte, dass bei einer CO2-Extraktion PCB und Dioxine zu einem geringeren Grad im Extrakt angereichert werden, als dies bei einer Fest-Flüssigextraktion mit organischen Lösemitteln der Fall ist. Insgesamt betrachtet, kann die Verwendung von naturbelassenen, höchstens getrockneten Gewürzen zu keiner derartigen Kontamination von Fleischerzeugnissen mit PCB oder Dioxinen führen, dass die damit hergestellten Produkte aufgrund einer Überschreitung der gesetzlichen Höchstwerte beanstan¬det werden würden. In einem Rechenmodell ließ sich zeigen, dass bei der Herstellung von Fleisch-erzeugnissen die Verwendung von Gewürzextrakten, die mit organischen Lösungsmitteln hergestellt wurden, einen höheren Eintrag an PCB und Dioxinen im fertigen Fleischerzeugnis hervorruft als dies bei entsprechender Produktion mit naturbelassenen Gewürzen (bei üblichen Einsatzmengen) der Fall ist. Bei Flüssig-CO2-Extrakten hingegen fand im Vergleich zu naturbelassenen Gewürzen ein geringerr Eintrag an PCB und Dioxinen statt.
In der vorliegenden Arbeit werden instrumentell-analytische Studien zur enzymatischen und chemischen Bildung von 4-Hydroxy-2,5-dimethyl-3(2H)-furanon (HDMF) und 4-Hydroxy-5-methyl-3(2H)-furanon (HMF) – zwei wichtigen Aromakomponenten zahl-reicher Früchte und verarbeiteter Lebensmittel – vorgestellt. Die Studien demonstrieren erstmals die Bildung dieser Verbindungen aus Zuckerphosphaten unter physiologischen Reaktionsbedingungen. Ein Schwerpunkt der Arbeiten lag dabei auf der Bildung von HDMF aus D-Fructose-1,6-diphosphat (Fru-1,6-dP) durch den Hefestamm Zygosaccharomyces rouxii. Der Zusatz von 1-13C-Fru-1,6-dP bzw. 13C6-D-Glucose zum Nährmedium der Hefe Z. rouxii zeigte, dass ausschließlich exogen zugesetztes Fru-1,6-dP durch die Hefe zu HDMF transformiert wird. Untersuchungen, in denen der Einfluss verschiedener Wachstumsbedingungen auf die HDMF-Bildung durch Z. rouxii getestet wurde, zeigten bezüglich der HDMF-Bildung ein pH-Optimum bei pH 5.1 sowie eine maximale Produktivität der Zellen bei einer NaCl-Konzentration von 20%. Mittels einer neu entwickelten cKZE-Methode wurde für durch Z. rouxii gebildetes HDMF eine Enantiomerenanreicherung von 27%ee nachgewiesen, was eine enantioselektive Biosynthese durch Enzymsysteme der Hefe impliziert. Als Grundvoraussetzung für den Nachweis einer Enantiomerenanreicherung im HDMF-Molekül stellte sich ein schwach-saurer pH-Wert des wässrigen Mediums heraus. Dies konnte durch Ermittlung der Tautomerisierungsgeschwindigkeit des HDMF-Moleküls mittels 1H-NMR-Spektroskopie belegt werden. Anhand von HPLC-MS/MS-Analysen wurde die Bildung von HMF in zellfreien cytosolischen Rohproteinextrakte aus Z. rouxii, welche mit Fru-1,6-dP und Nicotinamidadenindinucleotiden (NAD, NADH, NADP, NADPH) inkubiert worden waren, nachgewiesen. In Substratstudien wurde HMF nach Applikation von Fru-1,6-dP, D-Fructose-6-phosphat, D-Glucose-6-phosphat, 6-Phosphogluconsäure, D-Ribose-5-phosphat (Rib-5-P) und D-Ribulose-1,5-diphosphat an cytosolische Proteinextrakte nachgewiesen. Die für die Transformationen der Hexosephosphate zu D-Ribulose-5-phosphat (Ribu-5-P) benötigten Enzyme Fructose-1,6-diphosphatase, Phosphohexose-Isomerase, Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase und 6-Phosphogluconsäure-Dehydrogenase konnten mittels spezifischer Enzymassays in den cytosolischen Extrakten nachgewiesen werden. Gebildetes Ribu-5-P wird im Folgenden spontan in HMF umgelagert (> 1%). Die Inkubation von Phosphoribose-Isomerase mit Rib-5-P in Gegenwart von o-Phenylendiamin (o-PD) führte zur Bildung von 2-Methyl-3-(1,2-dihydroxyethyl)-quinoxalin, das anhand seiner UV-, MS- und NMR-Daten eindeutig identifiziert wurde. Daraus konnte die Bildung von 4,5-Dihydroxy-2,3-pentandion (DPD) in den Reaktionsansätzen abgeleitet werden, was durch die Synthese der entsprechenden deuterierten bzw. unmarkierten Alditolacetat-Derivate und anschließende HRGC-MS-Analyse abgesichert wurde. Durch Inkubation von 1-13C-Ribu-5-P bzw. 5-13C-Ribu-5-P mit o-PD und HPLC-MS/MS-Analyse der entstandenen Quinoxalinderivate konnte gezeigt werden, dass die Methylgruppe des DPD-Moleküls infolge einer nicht-enzymatischen Phosphat-Eliminierung gebildet wird. Nach Applikation von o-PD an reife Tomaten wurde mittels HPLC-MS/MS ebenfalls 2-Methyl-3-(1,2-dihydroxyethyl)-quinoxalin detektiert. Dieses Ergebnis impliziert ein genuines Vorkommen von DPD in Tomaten, in deren Aromaextrakten auch HMF nachgewiesen wurde. Somit ist in natürlichen Systemen ebenfalls von einer HMF-Bildung über diese Zwischenverbindung auszugehen. Anhand von HPLC-UV-MS/MS-Analysen wurde eine selektive Bildung von HDMF aus Fru-1,6-dP in Gegenwart von NADH unter milden Reaktionsbedingungen nachgewiesen. Durch Inkubation von 1-13C-Fru-1,6-dP mit [4R,S-2H2]-NADH und anschließender HRGC-MS-Analyse des gebildeten isotopen-markierten HDMF konnte gezeigt werden, dass HDMF infolge eines nicht-enzymatischen Hydrid-Transfers von NADH auf eine aus Fru-1,6-dP abgeleitete Zwischenverbindung gebildet wird. Das Hydrid-Ion wird hierbei selektiv auf C-5 oder C-6 des Kohlenhydratgrundgerüstes des Zuckerphosphates übertragen. Der Zusatz von o-PD und Fru-1,6-dP zum Z. rouxii-Nährmedium und anschließende HPLC-DAD-Analyse führte zur Detektion von drei Quinoxalinderivaten. Diese wurden anhand ihrer MS/MS-Daten und NMR-Spektren als phosphorylierte Quinoxalinderivate identifiziert, aus denen sich die Bildung von 2-Hexosulose-6-phosphat, 1-Deoxy-2,3-hexodiulose-6-phosphat und 1,4-Dideoxy-2,3-hexodiulose-6-phosphat in den Nährmedien ableiten ließ. Somit gelang erstmals der Beweis der Bildung von 1-Deoxy-2,3-hexodiulose-6-phosphat im Nährmedium, einem vielfach postulierten, aber bislang nicht nachgewiesenen Intermediat der HDMF-Bildung aus Fru-1,6-dP. Aufgrund der enantioselektiven Bildung von HDMF durch die Hefen wird daher bei der HDMF-Biosynthese durch Z. rouxii von einer Kombination aus nicht-enzymatischen Reaktionsschritten und einer durch Oxidoreduktasen der Hefezellen vermittelten Reduktion ausgegangen.
Zelluläre Regulation und klinische Aspekte des monocyten-/macrophagenspezifischen Proteins CD163
(2005)
In der vorliegenden Arbeit wurde die zelluläre Regulation des monocyten-/ macrophagenspezifischen Oberflächenproteins CD163 untersucht und klinische Aspekte der löslichen Form des CD163 (sCD163) diskutiert. sCD163 wird in vivo durch einen inflammatorischen Reiz von der Zelloberfläche abgespalten. Bislang waren jedoch noch keine Mediatoren charakterisiert worden, die immer unter Entzündungsbedingungen vorhanden sind. In den eigenen Untersuchungen des Shedding von CD163 konnten für die Generierung des sCD163 neue endogene Aktivatoren identifiziert werden. Sowohl reaktive Sauerstoffspezies, wie Wasserstoffperoxid oder Stickstoffmonoxid, als auch das Produkt von endogenen Oxidationsreaktionen mit reaktiven Sauerstoffspezies 8-iso Prostaglandin F2a erwiesen sich als potente Aktivatoren des Shedding von CD163. Neben den bekannten physiologischen Funktionen des 8-iso Prostaglandin F2a konnte erstmals eine neue Funktion bei Entzündungen definiert werden. Dieser Effekt wurde spezifisch durch 8-iso Prostaglandin F2a hervorgerufen, da das isomere Prostaglandin F2a unter gleichen Bedingungen keinen Einfluss auf das Shedding von CD163 ausübte. Das Immunsuppressivum Cyclosporin A konnte ebenfalls als Induktor des Shedding von CD163 ermittelt werden. Damit konnte zusätzlich zur bekannten immunmodulatorischen Wirkung des Cyclosporin A eine weitere antiinflammatorische Wirkung über Monocyten/Macrophagen aufgezeigt werden. Durch Untersuchungen der Inhibierung des Shedding von CD163 konnten Gemeinsamkeiten bezüglich der in die sCD163-Generierung involvierten Mediatoren dargestellt werden. Obwohl die untersuchten Verbindungen wahrscheinlich über unterschiedliche Signalwege das Shedding von CD163 induzieren, waren die Anwesenheit von reaktiven Sauerstoffspezies und intrazellulärem Calcium und die Beteiligung einer TIMP-3-sensitiven Metalloproteinase an diesem Prozess essentiell. Bei einem Vergleich zwischen dem Shedding von CD163 und Tumor necrosis factor-a (TNF-a) ergaben sich Gemeinsamkeiten durch die Induktion des Shedding beider Verbindungen durch 8-iso Prostaglandin F2a und in sehr viel geringerem Maße durch Wasserstoffperoxid. Im Gegensatz dazu waren deutliche Unterschiede in dem Ausmaß der induzierten Stimulation des Shedding durch Stickstoffmonoxid, Prostaglandin F2a und Cyclosporin A zu erkennen. Im Hinblick auf die entgegengesetzten Wirkungen von sCD163 als antiinflammatorisch wirkende Verbindung und TNF-a als proinflammatorisches Cytokin, konnte dargestellt werden, dass die Freisetzung durch unterschiedliche Aktivatoren erfolgt. Nach Bestimmung der Konzentrationen von sCD163 und 8-iso PGF2a in bronchoalveolärer Lavage-Flüssigkeit von Patienten mit Cystischer Fibrose konnten keine abschließende Aussagen über die Eignung beider Parameter als biologische Marker für chronische Entzündungen der Lunge bei diesen Patienten getroffen werden. Weiterführend zu der Kenntnis, dass sCD163 die antiinflammatorische Wirkung über eine Interaktion des Proteins mit humanen T-Lymphocyten und nachfolgender Hemmung der Proliferation dieser Zellen ausübt, wurde diese Wechselwirkung genauer untersucht. In quantitativen Bestimmungen des sCD163 in isolierten T-Lymphocyten verschiedener Spender konnte erstmals gezeigt werden, dass sCD163 zu einem Teil konstitutiv in die T-Lymphocyten aufgenommen wird und dass diese Aufnahme durch proinflammatorische Aktivierung der T-Lymphocyten stark gesteigert werden kann. Durch fluoreszenzmikroskopische Aufnahmen unstimulierter T-Lymphocyten konnte die intrazelluläre Lokalisation des sCD163 visualisiert werden. Nach Aktivierung der Zellen mit einem proinflammatorischen Reiz fand innerhalb der Zellen eine Translokalisation des sCD163 aus dem cytoplasmatischen Bereich zur Zellmembran statt. Damit konnte erstmals gezeigt werden, dass abhängig vom Aktivierungsstatus der T-Lymphocyten eine Umverteilung des sCD163 innerhalb der Zellen erfolgt. Eine quantitative Bestimmung des sCD163 und seines Bindungspartners in T-Lymphocyten nichtmuskuläres Myosin Typ IIA gelang mittels eines neu entwickeltem ELISA, der spezifisch sCD163 und Myosin ausschließlich im Komplex erfasst. Damit konnte durch die in dieser Arbeit beschriebenen Untersuchungen ein grundlegender Beitrag zur Charakterisierung der Regulation der Proteinexpression und des Shedding von CD163 in humanen Monocyten sowie der Interaktion des sCD163 mit T-Lymphocyten geleistet werden.
In klinischen Studien wurden bereits positive Effekte des standardisierten Kiefernrindenextrakts Pycnogenol® auf die Symptome von Patienten mit milden Formen von Kniegelenks-Osteoarthritis ermittelt; hauptsächlich ausgedrückt durch Senkung des WOMAC-Scores. Der hinter dieser Symptomverbesserung zu Grunde liegende Mechanismus wurde jedoch noch nicht untersucht. Deshalb sollten in der vorliegenden Arbeit erstmalig die zellulären pharmakodynamischen Effekte des Nahrungsergänzungsmittels, in Hinblick auf wichtige Marker der Knorpelhomöostase, untersucht werden. Hierfür wurden 30 Patienten mit schweren Gonarthrose-Formen und Indikation zum Kniegelenksersatz in eine randomisiert-kontrollierte Studie eingeschlossen.
Die genaue Ursache der Erkrankung Osteoarthritis ist bis heute nicht geklärt, jedoch gilt ein Ungleichgewicht von Knorpelaufbau und –abbau in den betroffenen Gelenken als einer der zentralen Parameter der Pathogenese. Diese Imbalance resultiert in einem sukzessiven Knorpelverlust, der mit einem Entzündungsgeschehen im ganzen Gelenk, also auch unter Beteiligung von Synovium und subchondralen Knochen, einhergeht. Eine wichtige Rolle spielen hierbei die matrix-abbauenden Enzyme MMPs und ADAMTS sowie proinflammatorische Mediatoren, z.B. das IL-1β. Nach dreiwöchiger Einnahme von 200 mg Pycnogenol® am Tag, konnten wir, im Vergleich zur unbehandelten Kontrollgruppe, eine Senkung der relativen Genexpression von MMP-1, MMP-3 und MMP-13 im Knorpelgewebe feststellen. Bei MMP-3 und MMP 13 war diese Reduktion signifikant. Ebenso wurde die relative Expression von IL-1β statistisch signifikant gesenkt. Im Rahmen der Untersuchung der Entwicklung von Markerkonzentrationen im Serum im Verlauf der Studie wurde eine signifikante Senkung der ADAMTS-5-Konzentrationen bei behandelten Patienten, im Vergleich zur Kontrollgruppe, offenbar. Weiterhin wurden die MMP-13-Konzentrationen im Serum positiv durch Einnahme des Rindenextraktes beeinflusst. In der Körperflüssigkeit, die dem Erkrankungsgeschehen am nähesten kommt, der Synovialflüssigkeit, konnten ebenso hemmende Effekte auf knorpelabbauende Enzyme nach Einnahme von Pycnogenol® beobachtet werden. Hierbei sah man niedrigere Konzentrationen der Marker MMP-1 und MMP-13 sowie der Abbaumarker von Typ-II-Collagen und von Aggrecan in den Gelenkflüssigkeiten der Verum- im Vergleich zu denen der Kontrollgruppe. Im Rahmen von ex-vivo-Versuchen zeigten sich mit beiden Spezimen keine Unterschiede zwischen den beiden Studiengruppen. Die beobachteten Tendenzen konnten durch Korrelationsanalysen untermauert werden.
Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit liefern den ersten Ansatz zum Verständnis der zellulären Mechanismen, die für die positiven Einflüsse des standardisierten Kiefernrindenextraktes auf die Symptomatik der Gonarthrose verantwortlich sind. Weitere Studien mit einer größeren Studienpopulation und einer Anwendung von Pycnogenol® über einen längeren Zeitraum sind nötig, um diese zellulären Geschehnisse zu bestätigen und näher zu untersuchen. Auf Grund des günstigen Nebenwirkungsprofils von Pycnogenol® ist eine Langzeittherapie zur Verzögerung eines erstmaligen Kniegelenksersatzes durchaus denkbar. Dies hätte den Vorteil, dass das betroffene Gelenk weniger oft ausgetauscht werden müsste, was wegen der begrenzten Haltbarkeit in etwa alle 10 Jahre geschieht.
Aus epidemiologischen Studien ist schon seit Längerem bekannt, dass eine hohe tägliche Aufnahme von Polyphenolen über die Nahrung zu geringeren Inzidenzraten neurologischer Erkrankungen, wie z.B. Morbus Parkinson oder Morbus Alzheimer, führt. Auch Pycnogenol® hat in-vivo schon positive Effekte auf diverse neurologische Erkrankungsgeschehen gezeigt. Um zu verstehen, welcher Inhaltsstoff bzw. welche Inhaltsstoffe und/oder Metabolite die Blut-Hirn-Schranke passieren und für diese Wirkungen verantwortlich sein könnten, wurde in der vorliegenden Arbeit mit Hilfe eines cEND-in-vitro-Modells die Blut-Hirn-Schrankengängigkeit ausgewählter Bestandteile des Extraktes und des Metaboliten M1 untersucht. Dabei zeigte keine der untersuchten Substanzen unter den gewählten Versuchsbedingungen einen quantifizierbaren Übertritt durch den Zellkultur-Monolayer. Auf Grund unserer Versuche ist jedoch eine Aufnahme des M1 und von (+)-Catechin in die Endothelzellen durchaus denkbar. Diese Aufnahme scheint für den M1, in erleichterter Form, durch den GLUT-1-Transporter zu verlaufen.
Die positiven Effekte des Nahrungsergänzungsmittels auf neurologische Erkrankungen scheinen nicht durch direkte Einwirkungen im Gehirn selbst verursacht zu werden. Eine stabilisierende Wirkung auf die BHS, die eine wichtige Barriere zum Schutz des Gehirns vor äußeren Einflüssen ist, scheint dafür eine plausiblere Erklärung zu sein. Weiterführende in-vivo-Tierversuche können darüber Aufschluss geben.
Zusammenfassend konnte mit der vorliegenden Arbeit ein Beitrag zur Aufklärung der zellulären Effekte des standardisierten Kiefernrindenextraktes bei schwerer Kniegelenks-Osteoarthritis geleistet werden. Zusätzlich konnten wir, mit Hilfe eines rationalen Ansatzes zur Ermittlung der Blut-Hirn-Schrankengängigkeit ausgewählter Inhaltsstoffe von Pycnogenol®, das Verständnis für die positiven Wirkungen von Pycnogenol® im Rahmen neurologischer Erkrankungen erweitern.
Zusammenfassend stellen sich die hydrophoben Nanomaterialien als die optimalen Fließregulierungsmittel dar (Ausnahme: Printex® G). Die Agglomerate des hochpotenten hydrophoben Ruß-Derivats Printex® 95 liegen von Herstellerseite bereits in genügend zerkleinerter Form vor, so daß keine weitere Zerkleinerung während des Mischvorganges erforderlich ist. Infolgedessen adsorbiert es mit höchster Geschwindigkeit an die Oberfläche der Schüttgutpartikel und übernimmt dort die Funktion von Oberflächenrauhigkeiten. In der Folge der werden die interpartikulären Haftkräfte sehr schnell minimiert. Im Gegensatz zu den hydrophilen Nanomaterialien zeigt Printex® 95 keinen ausgeprägten Wiederanstieg der Zugspannungen selbst nach sehr langen Mischzeiten von 4320 Minuten. Durch die Verwendung des hydrophoben Ruß-Derivates Printex® 95 werden Pulvermischungen erhalten, die zudem weitestgehend unempfindlich sind gegenüber Kapillarkräften bei erhöhten Umgebungsfeuchten. Das hydrophobe Printex® 95 vereint damit praktisch alle gewünschten Eigenschaften eines optimalen Fließregulierungsmittels und es kann als Modellsubstanz für die Entwicklung noch potenterer Nanomaterialien dienen. Bisher stand das nicht abschließend beurteilte cancerogene Potential dieses Stoffes einer breiten Anwendung entgegen.
A series of photoactivatable CO‐releasing molecules (PhotoCORMs) was prepared from manganese pentacarbonyl bromide and 1H‐benzimidazol‐2‐ylmethyl‐(N‐phenyl)amine ligands (L) bearing different electron‐donating and electron‐withdrawing groups R = H, 4‐CH\(_3\), 4‐OCH\(_3\), 4‐Cl, 4‐NO\(_2\), 2‐, 3‐, and 4‐COOCH\(_3\) on the phenyl substituent to give octahedral manganese(I) complexes of the general formula [MnBr(CO)\(_3\)(L)]. Aerated DMSO solutions of the compounds are stable in the dark for 16 h with no CO release. However, the compounds rapidly release CO upon illumination at 412–525 nm, depending on the substitution pattern. Its influence on the photophysical and photochemical properties was systematically explored using UV/Vis spectroscopy and CO release measurements with a commercial gas sensor system. In the nitro‐substituted compound, the electronically excited state switched from benzimidazole‐ to phenyl‐centered, leading to a markedly different photochemical behavior of this visible‐light activated PhotoCORM.
Die Interaktion des onkogenen Transkriptionsfaktors MYCN mit der Ser/Thr Kinase Aurora-A verhindert
dessen Abbau über das Ubiquitin Proteasomsystem indem die Rekrutierung des SCF FbxW7 Komplexes
verhindert wird. Die Kinase nimmt mit der Bindung an MYCN eine aktive Konformation ein und erhält
somit die Fähigkeit zur Kinaseaktivität ohne die sonst notwendige Phosphorylierung von Thr288 oder
die Anwesenheit eines Aktivators wie TPX2. Da hohe MYCN Konzentrationen Tumore wie
Neuroblastome antreiben, ist die Störung der Komplexbildung mit Aurora-A eine valide Strategie zur
Entwicklung von Chemotherapeutika. Einige Inhibitoren von Aurora-A wie Alisertib (MLN8237) sind in
der Lage, eine Konformationsänderung in der Kinase zu verursachen, die mit der Bindung von MYCN
inkompatibel ist und auf diese Weise den Abbau des Transkriptionsfaktors induziert. Da Aurora-A
wichtige Funktionen in der Mitose übernimmt, könnte eine direkte Adressierung des Komplexes anstelle
einer systemischen Inhibition der Kinase vielversprechender sein.
Ziel des Projektes war die Identifizierung von Molekülen, die selektiv an das Interface des
Aurora-A – MYCN Komplexes binden und weiter optimiert werden können, um einen gezielten Abbau
des Transkriptionsfaktors über einen PROTAC Ansatz zu ermöglichen. Virtuelle Screenings und
molekulardynamische Simulationen wurden durchgeführt, um kommerziell erhältliche Verbindungen zu
identifizieren, welche mit einer Bindetasche des Komplexes interagieren, die nur zustande kommt, wenn
beide Proteine miteinander interagieren. Aus einem ersten Set von zehn potentiellen Liganden wurde
für vier eine selektive Interaktion mit dem Protein – Protein Komplex gegenüber Aurora-A oder MYCN
alleine in STD-NMR Experimenten bestätigt. Zwei der Hits besaßen ein identisches Grundgerüst und
wurden als Ausganspunkt für die Optimierung zu potenteren Liganden genutzt. Das Gerüst wurde
fragmentweise vergrößert und in Richtung besserer in-silico Ergebnisse und Funktionalisierung zur
Anbringung von E3-Ligase-Liganden optimiert. Neun dieser Liganden der zweiten Generation wurden
synthetisiert.
Um quantitative Bindungsdaten zu erhalten, wurde ein kovalent verknüpftes Aurora-A – MYCN
Konstrukt entworfen. Die strukturelle und funktionale Integrität wurde in STD-NMR und BLI
Experimenten mit bekannten Aurora-A Inhibitoren bestätigt, sowie in NMR-basierten ATPase Assays.
Zusätzlich konnte die Kristallstruktur des Konstrukts gelöst und damit die Validität des Designs bestätigt
werden. Quantitative Messungen der synthetisierten Moleküle identifizierten HD19S als Hit mit einer
zehnfach höheren Affinität für das Aurora-A – MYCN Konstrukt im Vergleich zu der Kinase allein.
Zusätzlich wurden in-silico Untersuchungen zu PROTACs der Aurora-A Kinase durchgeführt.
Interaktionen zwischen Aurora-A, der E3-Ligase Cereblon und den Liganden wurden modelliert und für
die Erklärung unterschiedlicher Aktivitäten der eingesetzten PROTACs verwendet. Zudem zeigte das
aktivste PROTAC eine hohe Selektivität für Aurora-A gegenüber Aurora-B, obwohl die verwendete
Erkennungseinheit (Alisertib) an beide Aurora-Proteine bindet. Dieser Umstand konnte durch
energetische Analysen von molekulardynamischen Simulationen der ternären Komplexe erklärt werden.
Optimierungsmöglichkeiten für eine effizientere Degradation von Aurora-A durch die PROTACs wurden
basierend auf modifizierten Erkennungseinheiten und verbesserten Linkern untersucht.
Die Zahl der Tuberkuloseerkrankungen ist in den letzten Jahrzehnten weltweit gestiegen. Da es an innovativen Antituberkulotika mangelt, werden nach wie vor Medikamente der ersten Generation eingesetzt. Das wachsende Problem sind multi-resistente und extrem-resistente Bakterienstämme, die kaum oder gar nicht auf die medikamentöse Therapie ansprechen. Charakteristisch für M. tuberculosis ist eine dicke Zellwand. Der Aufbau der Zellwand ermöglicht es dem Bakterium in den Makrophagen zu persistieren und sich dort zu vermehren. Die Zellwand ist reich an Mykolsäuren und so wenig durchlässig für Fremdstoffe. Das mykobakterielle Zellwandskelett kann man in zwei Teile unterteilen, den Zellwandkern und die äußere Lipidhülle. Die freien Lipide der äußeren Lipidhülle dienen als Signalmoleküle im Krankheitsverlauf und interkalieren mit den Mykolsäuren des Zellwandkerns. M. tuberculosis besitzt für die Fettsäurebiosynthese zwei Enzymkomplexe: Die Typ-I-Fettsäuresynthase, die auch in Säugetieren zu finden ist, produziert Fettsäuren von C16- bis C26-Kettenlänge, die dann in der Typ-II-Fettsäuresynthase (FAS-II) zu Meromykolsäuren verlängert werden. Im Synthesezyklus des FAS-II sind mehrere monofunktionale Enzyme hintereinander geschaltet. Wird eines dieser Enzyme in seiner Funktion gestört, kumulieren Zwischenprodukte und benötigte Zellwandlipide können nicht synthetisiert werden. In der Folge wird die Zellwand instabil und das Bakterium stirbt. Die mykobakterielle Lipidbiosynthese ist somit ein ideales Target für die Entwicklung neuer Antituberkulotika. Ziel dieser Arbeit war es, eine neue Inhibitorklasse des FAS-II Enzyms InhA des M. tuberculosis mittels virtuellem Screening zu finden. Für das virtuelle Screening wurden drei aufeinander aufbauende Pharmakophorhypothesen entwickelt und mit diesen zwei unabhängige Datenbanken durchsucht. Als Grundlage für die Berechnungen des virtuellen Screenings diente die PDB Röntgenkristallstruktur 2h7m mit dem Liganden 1-Cyclohexyl-N-(3,5-dichlorophenyl)-5-oxopyrrolidin-3-carboxamid. Für die Erstellung der Pharmakophorhypothesen wurden zuerst die Strukturen des Enzyms mit und ohne Ligand bezüglich ihrer Konformationsunterschiede vor allem im Bereich der Bindetasche analysiert. Als nächstes wurden die Wechselwirkungen des Liganden mit den Aminosäuren der Bindetasche und dem Cofaktor näher analysiert und die verschiedenen Wechselwirkungsarten hinsichtlich ihrer Relevanz für eine inhibitorische Aktivität beurteilt. Schließlich wurde eine Bindetaschenanalyse durchgeführt und Hotspots für unterschiedliche chemische Funktionalitäten berechnet. Für das Datenbankenscreening wurden das ZINC 'drug-like' Subset (2005) und CCGs MOE 2006 Vendor Compound 3D Collection verwendet, beides Datenbanken exklusiv kommerziell erhältlicher Verbindungen. Das ZINC 'drug-like' Subset wurde über einen für InhA individuell angepassten hierarchischen Filter numerisch reduziert. Von den verbleibenden Verbindungen wurde eine Konformerendatenbank berechnet. Die MOE 2006 Vendor Compound 3D Collection lag bereits als Konformerendatenbank vor und wurde für das Screening 'as-is' verwendet. Mit den Pharmakophorhypothesen I und II wurde das reduzierte ZINC 'drug-like' Subset gescreent. Für die Treffer wurden Fingerprints berechnet, sie danach mithilfe des Tanimotokoeffizienten nach ihrer Ähnlichkeit in Cluster eingeteilt und visuell analysiert; 149 Verbindungen wurden für die Dockingsimulationen ausgewählt. Die MOE Konformerendatenbank wurde ebenso über einen für InhA individuell angepassten hierarchischen Filter numerisch reduziert und mit der Pharmakophorhypothese III gescreent, 28 Verbindungen wurden für die Dockingsimulationen ausgewählt. Die Dockingsimulationen wurden mit den Programmen MOE Dock und Autodock durchgeführt. Die Ergebnisse wurden numerisch ausgewertet und innerhalb der Bindetasche relativ zur jeweiligen zugrunde liegenden Pharmakophorhypothese visuell analysiert; 27 Substanzen wurden schließlich für die Testungen ausgewählt. Die Testungen erfolgten mit einem enzymatischen Assay und einem Assay an attenuierten M. tuberculosis Für die Etablierung des enzymatischen Assays wurde das Enzym InhA mittels Vektortransformation in E. coli überexprimiert und säulenchromatographisch aufgereinigt. Das Substrat 2-trans-Octenoyl-Coenzym A wurde synthetisiert. Von den 27 ausgewählten Substanzen waren 9 im Handel erhältlich und wurden schließlich auf ihre inhibitorische Aktivität getestet. Es wurden ein Thiazolidin-2,4-dion, ein 2-Thioxoimidazolidin-4-on und ein Sulfonamid als aktive Substanzen gefunden.
Sekundäre Pflanzenstoffe zeichnen sich wegen ihrer heterogenen Zusammensetzung und großen Strukturvariabilität durch eine komplexe Pharmakokinetik aus. Wissen um die Pharmakokinetik ist wiederum für die Beurteilung von pharmakodynamischen Prozessen unabdingbar. Ziel dieser Arbeit war es durch die Bestimmung wichtiger pharmakokinetischer Parameter zur Erweiterung des Verständnisses um die Verteilung von verschiedenen Bestandteilen und Metaboliten eines standardisierten Extraktes der französischen Meereskieker (pinus pinaster) im menschlichen Körper beizutragen. Es erfolgte zunächst, unter Verwendung zweier verschiedener Methoden, die Bestimmung der Plasmaproteinbindung dieser Substanzen. Hierbei fand eine affinitätschromatographische Methode mit immobilisiertem Albumin Anwendung. Die Flavonoide Taxifolin, (+)-Catechin sowie das Catechindimer Procyanidin B1 zeigten eine, aufgrund der vorliegenden Polyphenolstruktur der Substanzen gut erklärbare ausgeprägte Bindung, während für Kaffesäure, Ferulasäure und ein δ-(3,4-Dihydroxyphenyl)-γ-valerolacton (Metabolit M1), das in vivo als Metabolit aus(+)-Catechin gebildet wird, eine wesentlich geringere Affinität zu Albumin ermittelt werden konnte. Desweiteren kam eine Filtrationsmethode zur Anwendung, die durch Abtrennung der Proteine aus dem Plasma eine Bestimmung der Bindung ermöglichte. Um die in Vorversuchen gezeigte ausgeprägte unspezifische Bindung der Flavonoide (+)-Catechin und Taxifolin an Membran- und Gefäßoberflächen zu minimieren wurde eine Vorbehandlung der Membranen vorgenommen. Die Resultate beider Methoden zeigten eine gute Übereinstimmung, ausgenommen der bei der Ultrafiltration erhaltenen geringen Proteinbindung des Procyanidin B1. Auch die Ultrafiltrationsmethode ergab für Taxifolin und (+)-Catechin eine beinahe vollständige Bindung. Für die Phenolcarbonsäuren Ferulasäure und Kaffeesäure sowie den Metaboliten M1 hingegen ergaben sich geringere Affinitäten so dass die Ergebnisse der affinitätschromatographischen Methode bestätigt und durch die Verwendung von zwei verschiedenen unabhängigen Bestimmungsansätzen eine gesteigerte Aussagekraft der Resultate erreicht werden konnte. Eine weitere Ergänzung der Aufklärung des pharmakokinetischen Profils erfolgte durch die Ermittlung der Verteilung dieser Substanzen zwischen Plasma und verschiedenen Blutzellen. Insbesondere für den Metaboliten M1 zeigte sich bei einigen der Versuche eine ausgeprägte Affinität zu Erythrozyten und mononukleären Zellen. Ob diesem Phänomen möglicherweise aktive Transportmechanismen zu Grunde lagen sollte durch weiterführende Betrachtungen geklärt werden. Die Untersuchungen ergaben, dass an dieser Verteilung weder ein Aminosäuretransporter noch das para-Glykoprotein beteiligt gewesen waren, jedoch ließen ergänzende Versuche den Schluss zu, dass eine erleichterte Diffusion in das Zellinnere durch den Glucose-Transporter GLUT-1 ermöglicht werden könnte. Diese Vermutung wurde durch vergleichende Energiefeld-,Oberflächen-, und Volumenberechnungen zwischen dem natürlichen Substrat des Transporters Glucose und dem Metaboliten M1 gestützt. Aufbauend auf den Ergebnissen der Verteilungsversuche wurde ein möglicher intrazellulärer Metabolismus der Substanzen in Erythrozyten und mononukleären Zellen, insbesondere durch Reaktionen des Phase II Metabolismus, untersucht. Mittels massenspektrometrischer Untersuchungen konnten Hinweise auf die Bildung eines Addukts zwischen Glutathion und dem Metaboliten M1 in Erythrozyten gefunden werden. Abschließend wurde durch die Bestimmung der protektiven Eigenschaften des Metaboliten M1 gegen oxidative Schädigungen der Erythrozytenmembran auch ein pharmakodynamischer Aspekt dieser Verbindung hinzugefügt. Zwar zeigte sich bereits in einem Konzentrationsbereich von 1 μM eine ausgeprägte antioxidative Aktivität des Metaboliten M1, jedoch konnte kein Hinweis auf Beeinflussung oxidativer Membranschädigungen durch möglicherweise intrazellulär gebildete Konjugate obiger Verbindung gefunden werden. Im Rahmen dieser Arbeit konnten für verschiedene Bestandteile eines Kiefernrindenextraktes und ein δ-(3,4-Dihydroxyphenyl)-γ-valerolacton Plasmaproteinbindungen und erstmals die Verteilung dieser Substanzen zwischen Plasma und Blutzellen ermittelt werden. Insbesondere die in einigen Versuchen gezeigte Aufnahme bzw. Adsorption könnte einen Beitrag zur Klärung der Beobachtung liefern, dass eine deutliche Diskrepanz gefunden wurde zwischen in vivo gemessenen Plasmakonzentrationen, welche in vitro nicht ausreichend sind um deutliche Effekte auszulösen und Ergebnissen aus ex vivo Untersuchungen, die eine deutliche Beeinflussung insbesondere antiinflammatorischer Prozesse zeigten.
Die Pseudodistomine gehören zu den ersten Piperidinalkaloiden marinen Ursprungs, die 1987 von Ishibashi et al. aus der Tunikate (Ascidie) Pseudodistoma kanoko isoliert wurden. Aus der gleichen Tunikate wurde 1995 das Pseudodistomin C isoliert. Die amphiphilen Piperidinalkaloide zeigen eine Antitumor-Aktivität gegen bestimmte Mäuseleukämiezellen, wobei Pseudodistomin C auch eine Cytotoxizität gegen menschliche HeLa-abgeleitete Krebszellen KB aufweist. In der Einleitung wird ausführlich auf Vorkommen, Struktur, Biogenese, pharmakologische Perspektiven und literaturbekannten Synthesen dieser amphiphilen Piperidin-Alkaloide eingegangen. Im Hauptteil wird zunächst eine gescheiterte Synthese ausgehend von D-Ribose über das Konzept einer Tandem Wittig-[3+2]-Cycloaddition beschrieben. Daraufhin wird ein völlig neuer Syntheseweg vorgestellt, welcher den formalen Aufbau des Pseudodistomin C über einen bekannten Piperidin-Grundkörper ermöglich. Des weiteren konnte das vollständig geschützte Pseudodistomin E synthetisiert werden.
In der vorliegenden Arbeit wurde der fließregulierende Effekt diverser hochdisperser Fällungskieselsäuren vom Typ SIPERNAT® (Evonik Degussa GmbH) auf die Fließeigenschaften kohäsiver Schüttgüter untersucht. Der Wirkmechanismus dieser nanostrukturierten Fließregulierungsmittel beruht bei trockenen und elektrostatisch nicht aufgeladenen Pulvern vorwiegend auf der Reduktion von van-der-Waals-Kräften durch Adsorption kleinerer Aggregate des Fließregulierungsmittels an die Oberfläche der Schüttgutpartikel und somit Vergrößerung des Abstandes bzw. Verkleinerung der Kontaktflächen zwischen den Trägerpartikeln. Durch unterschiedlich langes Mischen von Fließregulierungsmitteln mit kohäsiven Schüttgütern verändert sich sowohl die Anzahl adsorbierter Nanopartikel als auch die Größe, Größenverteilung und Form der Adsorbate, was in unterschiedlichen Fließeigenschaften der Mischungen resultiert. Zur Untersuchung des Zusammenhanges zwischen Oberflächenbelegung durch Adsorbate und Fließeigenschaften einer Mischung wurde Maisstärke, die als kohäsives Modellschüttgut fungierte, eine konstante Menge Fließregulierungsmittel zugesetzt und die Mischungen unterschiedlich langen Mischzeiten in einem Freifallmischer unterzogen. Die aus dem Mischprozeß resultierende Belegung der Maisstärkeoberfläche durch Adsorbate wurde mittels Rasterelektronenmikroskop mit anschließender bildanalytischer Auswertung (KL 300®, Carl Zeiss) charakterisiert. Die Fließeigenschaften der Mischungen wurden mit einem Zugspannungstester, einem modifizierten Auslauftrichter sowie Hausner-Faktor untersucht. Es konnte gezeigt werden, daß sich die Fließeigenschaften mit steigender Mischzeit kontinuierlich bis zum Erreichen eines Optimums verbessern. Dies wird mit der Abnahme der Adsorbatgrößen und der Zunahme der Adsorbatanzahl auf der Maisstärkeoberfläche erklärt. Bei kurzen Mischzeiten bewirken adsorbierte Fließregulierungsmittelaggregate eine Verbesserung der Fließeigenschaften durch Verhinderung direkter Kontakte zwischen den Schüttgutpartikeln. Bei weiterer Zunahme der Oberflächenbelegung werden die Fließeigenschaften durch einen Übergang von Träger-Adsorbat-Träger-Kontakten zu Träger-Adsorbat-Adsorbat-Träger-Kontakten verbessert. Eine beobachtete Verschlechterung der Fließeigenschaften nach Überschreiten der optimalen Mischzeit beruht wahrscheinlich auf einer Veränderung der dreidimensionalen Form der Adsorbate, die zu einer Vergrößerung der Kontaktflächen führt. Beim Vergleich der unterschiedlichen Messmethoden zur Ermittlung der Fließeigenschaften wurde ersichtlich, dass die Messparameter des modifizierten Auslauftrichters gut mit dem Hausner-Faktor korrelieren, während die Zugspannungsmessungen z.T. abweichende Ergebnisse lieferten. Eine genaue Analyse des Messvorgangs am Zugspannungstester zeigte, dass die Pulverproben bei der verwendeten Messmethode (Messung mit konstanter Vorlast) in Abhängigkeit von ihren Fließeigenschaften unterschiedlich stark durch den Messvorgang verdichtet werden, was Einfluss auf die gemessenen Zugspannungswerte hatte. Aus dieser Erkenntnis konnten Verbesserungsvorschläge für die Zugspannungsmessung an Schüttgütern gemacht werden.
Der ‚Liber de arte distillandi de simplicibus’, genannt das ‚Kleine Destillierbuch’ des Straßburger Chirurgen Hieronymus Brunschwig (ca. 1450 bis 1512/13) wurde im Jahr 1500 erstmals veröffentlicht. In der vorliegenden Untersuchung sollen die darin genannten humoralpathologischen medizinischen Indikationen der destillierten Pflanzenwässer mit den nach derzeitigem wissenschaftlichem Erkenntnisstand belegten Indikationen verglichen werden und auf Übereinstimmungen und Abweichungen hin untersucht werden. Das ‚Kleine Destillierbuch’ befasst sich mit der Destillation von Arzneimitteln vorwiegend pflanzlicher Herkunft und den medizinischen Anwendungsbereichen dieser Destillate. Das erfolgreiche Werk, das in schriftlicher Form die damalige gängige Praxis der Medizinkundigen in Straßburg fixiert, entwickelte sich zum heilkundlichen Volksbuch des 16. Jahrhunderts, galt aber auch bei Berufs-Destillierern als wichtiges Technik-Lehrbuch für Destillationsverfahren. Daneben waren Brunschwigs Pflanzenbeobachtungen im ‚Kleinen Destillierbuch’ eine wertvolle Grundlage für die ältere deutsche Botanik. Für die Untersuchung wurden Druckausgaben aus den Jahren 1528 und 1610 verwendet. In einem ersten Schritt wurde durch Klärung heute ungebräuchlicher Begriffe der frühneuzeitliche Text erschlossen. Im zweiten Schritt wurden die Zutaten identifiziert, die Brunschwig zur Destillation der 269 pflanzlichen und 36 nicht-pflanzlichen, meist tierischen gebrannten Wässer verwendet. Im dritten Schritt wurden alle Indikationen der Destillate, die Brunschwig in seinen Planzenmonographien nennt, gesammelt und verschiedenen Körperregionen zugeordnet. Anschließend wurden den historischen Indikationsbezeichnungen heute gebräuchliche Bezeichnungen gegenübergestellt, um einen direkten Vergleich der Daten, die zwei grundsätzlich verschiedenen Wissenschaftsystemen entspringen, zu ermöglichen. Im vierten Schritt wurden alle von Brunschwig genannten Anwendungsbereiche der einzelnen „Wässer“-Monographien jeweils in Tabellenform aufgenommen. Diesen historischen Anwendungsbereichen wurden heutige naturwissenschaftlich belegte Indikationen gegenübergestellt. Hierfür wurde v.a. auf W. Blaschek, S. Ebel, E. Hackenthal u. a., Hagers Handbuch der Drogen und Arzneistoffe, HagerROM 2004, Programmversion 5.1, Berlin, Heidelberg 2005 zurückgegriffen. Ein Vergleich der historischen mit den aktuellen Anwendungen erfolgte anhand abgestufter Kategorien (I, II, III, IV). Für eine Interpretation der untersuchten Daten wurden diejenigen von Brunschwig verwendeten Pflanzen ausgewählt, die ein nach heutigem Wissensstand belegtes Anwendungsgebiet besitzen. Diese wurden zunächst nach den für ihre Wirkung relevanten Inhaltsstoffen geordnet. Die Übereinstimmungen bzw. Abweichungen der Brunschwigschen Anwendungsgebiete von den heute definierten Anwendungsgebieten der untersuchten Pflanzen wurden diskutiert. Die relativen Trefferhäufigkeiten wurden ermittelt. Sie liegen zwischen 33 % und 100 %, im Durchschnitt bei 65 %. Für eine weitere Diskussion wurden die gleichen Daten bezüglich der Destillat-Anwendung in den oben genannten Körperregionen geordnet. Die relativen Trefferhäufigkeiten liegen hier in einem Bereich zwischen 43 % und 86 %, im Durchschnitt bei 57 %. Die vorliegende Untersuchung ist Teil eines größeren Forschungsvorhabens. In gleicher Weise sollen mehrere Kräuterbücher des Mittelalters bzw. der frühen Neuzeit untersucht und anschließend mittels eines statistischen Verfahrens einzeln und im Vergleich umfassend ausgewertet werden.
Die vorliegende Arbeit hat sich zum Ziel gesetzt das medizinische Werk zweier ausgewählter historischer Autoren, nämlich jenes Hildegards von Bingen (1098 – 1179) und von Leonhart Fuchs (1501 – 1566), möglichst umfassend hinsichtlich der für Mittel pflanzlichen Ursprungs vergebenen Indikationen zu bearbeiten und mit modernem Wissen zu vergleichen. Mit Hilfe einer statistischen Auswertung sollte dabei festgestellt werden, ob die überlieferten Indikationen lediglich einer zufälligen Zuordnung folgen oder ob diese zielgerichtet Erfahrungswerte spiegeln. Sollte sich die Zuweisung einzelner Pflanzen zu bestimmten Indikationen nicht als zufällig erweisen, so wäre dies ein Beleg dafür, dass man bereits vor Jahrhunderten über ein Wissen verfügte, welches unseren heutigen Erkenntnissen vergleichbar wäre. Die Wahrscheinlichkeit, dass entsprechende Pflanzen, die heute medizinisch nicht mehr gebräuchlich sind, von historischen Autoren jedoch empfohlen werden, die gewünschten Wirkungen zeigen, wäre demzufolge groß. Derartigen Erfolg versprechenden Pflanzen oder traditionellen Anwendungen könnte sich die weitere klinische Forschung zuwenden. Bisherige Vergleiche der historischen Verwendung von Heilpflanzen griffen in der Regel aus einer Vielzahl von Indikationen und Autoren, die zur heutigen Indikation einer bestimmten Pflanze passenden Indikationen heraus. Der Ansatz der vorliegenden Arbeit ist insofern neu, als ein möglichst umfassender Vergleich eines einzelnen historischen Autors mit den aus heutiger Sicht als belegt geltenden Indikationen angestrebt wird. Um zu zeigen, ob die von einem untersuchten Autoren vergebenen Indikationen systematisch oder rein zufällig vergeben wurden, werden die per Zufall zu erwartenden „Treffer“ mit den beobachteten „Treffern“ verglichen. Die Indikationen des historischen Autors zu jeder Pflanze wurden anhand der folgenden Schritte bearbeitet: a) Identifikation der Pflanzen und Indikationen b) Zählen der Indikationen pro Pflanze c) Vergleich mit den aus heutiger Sicht als belegt geltenden Indikationen d) Zählen der Übereinstimmungen in vier abgestuften Bewertungskategorien (beobachtete „Treffer“) e) Statistischer Vergleich Im Ergebnis wird gefolgert, dass beide historischen Autoren dem Zufall signifikant in der Zuordnung von Indikationen überlegen sind. Tendenziell entspricht die Zuordnung durch Leonhart Fuchs eher den heute als anerkannt geltenden Indikationen, wobei dies nicht zwangsläufig mit einem geringeren Wissen Hildegards gleichzusetzen ist.
In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss hochdisperser, nanoskaliger Materialien auf die Fließregulierung eines speziell ausgesuchten Trägermaterials mit einer unregelmäßigen Partikelform und einer breiten Partikelgrößenverteilung untersucht. Als Modellsubstanz diente gemahlenes, kristallines Laktosemonohydrat im Vergleich zu Maisstärke mit gleichmäßiger Partikelform. Es wurde nachgewiesen, dass die Wirkung von Fließregulierungsmitteln auch bei kantigen Partikeln mit rauer Oberfläche wie gemahlener Laktose auf der Adsorption kleiner Agglomerate des nanoskaligen Fließregulierungsmittels beruht. Zur Charakterisierung der Fließeigenschaften von Pulvern verschiedener Morphologie stellt der Zugspannungstester eine alternative Methode dar. Anhand von Vergleichsmessungen mit der Scherzelle nach Jenike wurde gezeigt, dass der Zugspannungstester eine geeignete Methode ist. Ein weiterer Schwerpunkt der Arbeit lag auf der Entwicklung eines geeigneten Prämixes für den Einsatz von Fließregulierungsmitteln. Als Basis eines Prämixes sind grundsätzlich beide Trägermaterialien geeignet, Maisstärke ist der Laktose aber überlegen. In Prämixen mit Anteilen von 10 % Nanomaterial ist der Träger in der Lage das Fließregulierungsmittel zu zerteilen und zu adsorbieren. Diese Adsorbate werden in einer Endmischung schnell an die neu hinzugekommenen Partikel übertragen. Bei Einsatz eines Prämixes sinkt die Zugspannung mit steigender Mischzeit schneller als bei einer Direktmischung der Komponenten. Auch die Handhabung eines Prämixes hat sich als erheblich einfacher als die des reinen Nanomaterials herausgestellt. Die untersuchten Vormischungen sind sehr gut fließfähig und stauben kaum. Prämixe sind eine gute Option, Fließregulierungsmittel vorteilhaft in Pulvermischungen einzubringen. Eine Zugabe von zwei oder auch fünf Prozent eines Prämixes aus 10 % (m/m) Fließregulierungsmittel und Maisstärke statt der direkten Zugabe von 0,2 % bis 0,5 % Nanomaterial stellt eine verfahrenstechnische Verbesserung beim industriellen Einsatz von Fließregulierungsmitteln dar.
Die vorliegende Arbeit untersucht den Einfluss verschiedener nanoskaliger Fließregulierungsmittel auf die Direkt-Tablettiereigenschaften von pharmazeutischen Pulvern am Beispiel von reiner Maisstärke und deren Mischung mit einem schlecht kompaktierbaren Wirkstoff, Ibuprofen. Die wesentlichen Parameter für eine erfolgreiche Tablettierung sind die Fließfähigkeit und ein gutes Bindungsvermögen der Pulverbestandteile. Das Fließverhalten der Pulvermischungen mit je 0.2% Fließregulierungsmittelanteil wurde sowohl mit apparativ einfachen Arzneibuchmethoden als auch mit einer instrumentierten Exzenterpresse untersucht. Mittels der Instrumentierung konnten zudem die Tablettierbedingungen gezielt ausgewählt und konstant gehalten werden. Die Untersuchung der mechanischen Eigenschaften der Tabletten erfolgte mit einem Schleuniger Bruchfestigkeitstester, der zugleich die Bestimmung der Tablettenabmessungen erlaubt. Zusätzlich wurde die Belegung der Maisstärke- und Ibuprofenoberflächen mit den Fließregulierungsmitteln qualitativ am Rasterelektronenmikroskop untersucht.
Es wurde untersucht, welchen Einfluss verschiedene hochdisperse Fließregulierungsmittel, wie sie bisher in der pharmazeutischen Technologie aber auch in der Lebensmittel- und Futtermittelindustrie eingesetzt werden, auf einige ausgewählte kohäsive Schüttgüter ausüben. Dazu wurden binäre Mischungen mit variierender Konzentration an Fließregulierungsmittel und Schüttgut hergestellt und in einem Freifallmischer gemischt. Als Fließverbesserer kamen verschiedene hochdisperse Kieselsäuren, darunter eine pyrogene Kieselsäure vom Typ AEROSIL® (Evonik Degussa GmbH) und mehrere Fällungskieselsäuren vom Typ SIPERNAT® (Evonik Degussa GmbH), zum Einsatz. Maisstärke, Kartoffelstärke und Hoechst Wachs C Micropulver® dienten als kohäsive Modellsubstanzen. Für den fließregulierenden Effekt spielt die gewählte Mischdauer eine entscheidende Rolle. Denn während des Mischvorgangs werden die ehemals Mikrometer bis Millimeter großen Fließregulierungsmittelagglomerate sukzessive zerkleinert, bis sie nanoskalige Rauigkeiten auf der Schüttgutoberfläche erzeugen. Je nach gewählter Mischdauer ergeben sich somit differierende Belegungsgrade der Trägerpartikeloberfläche. Die adsorbierten Oberflächenrauigkeiten bewirken eine Vergrößerung des Haftabstands zwischen den Pulverpartikeln und eine Verkleinerung der Kontaktfläche. Dadurch reduzieren sie die interpartikulären Anziehungskräfte, die vor allem durch van-der-Waals-Kräfte verursacht werden, und verbessern somit die Fließeigenschaften des Schüttgutes. Die interpartikulären Haftkräfte der binären Mischungen wurden mit Hilfe eines Zugspannungstesters gemessen. Die Größe und Anzahl der Kieselsäureadsorbate auf der Schüttgutoberfläche wurden mittels Rasterelektronenmikroskopie und anschließender bildanalytischer Auswertung (KS 300©, Carl Zeiss) bestimmt. Es konnten Unterschiede im fließregulierenden Potential der einzelnen Kieselsäuren aufgezeigt werden, die sich durch deren individuelle Tendenz zur Fragmentierung erklären lassen. Unabhängig davon, ob Mais- oder Kartoffelstärke verwendet wurde, und welche Untersuchungsmethode den Messungen zugrunde lag, wiesen die getesteten Fließregulierungsmittel eine gleich bleibende Rangfolge ihres fließverbessernden Potentials auf. Es konnte somit gezeigt werden, dass Fällungskieselsäuren sich in gleicher Weise als Fließregulierungsmittel eignen wie die bereits breit eingesetzten pyrogenen Kieselsäuren. Jedoch müssen die Agglomerate der gewählten Silica leicht und schnell zerkleinerbar sein. Dies trifft in besonderer Weise für vermahlene Produkte zu, da deren Agglomeratgefüge lockerer sind als bei unvermahlenen Substanzen. Solche Fließregulierungsmittel, die eine große spezifische Oberfläche aufweisen, das bedeutet über eine kleine Primärpartikelgröße verfügen, besitzen eine besonders feste Agglomeratstruktur, die sich beim Mischen nur schwer zerkleinern lässt. Diese Kieselsäuren sind deshalb zur Fließregulierung nur wenig geeignet. Weiterhin sind hydrophobe Kieselsäuren den hydrophilen überlegen, wenn es darum geht, die Fließeigenschaften der Pulver zu verbessern. Das Fehlen zusätzlicher Wasserstoffbrückenbindungen wird hier für die hervorragende fließverbessernde Potenz der hydrophoben Materialien verantwortlich gemacht. Spielt jedoch das Wasseraufnahmevermögen der Silica eine Rolle, so ist es von Vorteil eine hydrophile Kieselsäure einzusetzen. Hierbei übertreffen die Fällungskieselsäuren die pyrogenen Kieselsäuren sogar in der Absorptionsfähigkeit. Die Erkenntnisse stellen einen Fortschritt für die Charakterisierung der verschiedenen Silica-Typen dar. Besonders, da der Kieselsäuretyp SIPERNAT® im Vergleich zum Typ AEROSIL® noch wenig erforscht und etabliert ist. Nachteilig für die Verwendung im Pharmabereich ist allerdings die im Vergleich zu den pyrogenen Kieselsäuren niedrigere chemische Reinheit. Die Auswahl beschränkt sich hier ausschließlich auf Produkte, die über einen hohen SiO2-Gehalt verfügen und somit den Anforderungen der Ph. Eur. genügen. Die getesteten Substanzen bleiben daher vorerst interessanter für den lebensmittel- oder futtermitteltechnologischen Bereich.
Die Fruchtreifung stellt einen hochkomplexen Prozess dar, der durch eine Reihe von biochemischen und physiologischen Veränderungen gekennzeichnet ist. Dies umfasst bedeutende Veränderungen von Textur, Farbe sowie die Bildung von geschmacks- und geruchsaktiven Verbindungen. Die vorliegende Arbeit präsentiert neue Erkenntnisse zur Biosynthese von 4-Hydroxy-2,5-dimethyl-3(2H)-furanon (Furaneol®, HDMF), einer Schlüssel-Aromakomponente der Erdbeere (Fragaria x ananassa). Daneben lieferten die durchgeführten Versuche den Nachweis einer Reihe enzymatischer Aktivitäten in der Erdbeerfrucht und beleuchteten deren Entwicklung im Verlauf der Erdbeer-Fruchtreifung. Zum ersten Mal wurde ein Protein aus Erdbeerfrüchten isoliert, partiell sequenziert und seine Beteiligung an der enzymatischen Bildung von HDMF während der Fruchtreifung nachgewiesen.
Um Arzneimittelwechselwirkungen von Arzneistoffen sowie neuen Arzneistoffkandidaten zu vermeiden, werden zur Abschätzung des Interaktionsrisikos so genannte In-vitro-Interaktionsstudien durchgeführt. Hierfür werden vor allem Mikrotiterplatten-basierte Fluoreszenz- und LC/MS-Methoden verwendet. Das Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung der Anwendbarkeit und Validität dieser In-vitro-Methoden bezüglich der Inhibition von CYP-Enzymen durch Arzneipflanzenextrakte. Die in dieser Arbeit erhaltenen Daten belegen, dass die verwendeten Fluoreszenz-Assays für Pflanzenextrakte keine validen Ergebnisse liefern und für die Bestimmung der inhibitorischen Aktivität von Pflanzenextrakten nur in wenigen Fällen geeignet sind. Bei einigen untersuchten Pflanzenextrakten wurden sehr starke inhibitorische Aktivitäten gefunden, da durch Quenching des Fluoreszenzsignals falsch positive Ergebnisse vorgetäuscht wurden. Ebenso war die Inhibition bei einigen Pflanzenextrakten aufgrund einer starken Eigenfluoreszenz sehr schwach oder konnte überhaupt nicht bestimmt werden. Des Weiteren wurden als Referenzmethoden für die Bestimmung der Inhibition von CYP-Enzymen LC/MS-basierte Methoden mit Online-Festphasenextraktion verwendet, die speziell für Pflanzenextrakte entwickelt und validiert wurden. Die Ergebnisse der LC/MS-basierten CYP-Assays wurden durch die Pflanzenmatrix nicht beeinflusst, so dass diese Assays hervorragend als Referenzmethoden für die Bestimmung der inhibitorischen Aktivität von Pflanzenextrakten geeignet sind. Bei sehr hohen Extraktkonzentrationen zeigten einige Pflanzenextrakte sehr starke Abweichungen der mittels LC/MS und Fluorimetrie in Mikrotiterplatten erhaltenen inhibitorischen Aktivität. Die Verwendung von niedrigen Extraktkonzentrationen führte zu einer besseren Übereinstimmung der erhaltenen Ergebnisse. D.h. vor allem bei hohen Extraktkonzentrationen sind starke Quenching- und Eigenfluoreszenz-Effekte zu erwarten. Dennoch sind auch bei niedrigen Extraktkonzentrationen diese Effekte nicht auszuschließen. In den meisten Veröffentlichungen wurden sehr hohe Testkonzentrationen für die Bestimmung der inhibitorischen Aktivität von Pflanzenextrakten verwendet, so dass mit hoher Wahrscheinlichkeit aufgrund von Quenching- und Eigenfluoreszenz-Effekten falsch positive bzw. negative Ergebnisse erhalten wurden. Untersuchungen zum Quenching haben gezeigt, dass die meisten Extrakte in den üblicherweise verwendeten Konzentrationen (ca. 10-1000 µg/ml) die Fluoreszenzintensität der Metabolite sehr stark reduzierten. Die Quenching-Effekte der Pflanzenextrakte beeinflussten das Fluoreszenzsignal aller enzymatisch gebildeten Metabolite (Cumarin-Derivate, Resorufin, Fluorescein), wobei die Quenching-Effekte bei Resorufin und Fluorescein in ihrer Stärke und Häufigkeit geringer ausfielen. Bei CYP2B6, CYP2C9 und CYP2D6 wurden in Verbindung mit Fluoreszenzsubstraten, die eine Cumarinstruktur aufweisen, sehr oft falsch negative oder gar keine Ergebnisse erhalten, weil die Eigenfluoreszenz der Extrakte die Metabolitenfluoreszenz überlagerte. Quenching-Effekte traten bei den untersuchten Pflanzenextrakten weitaus häufiger auf als eine Eigenfluoreszenz. Aufgrund dieser Tatsachen können die Mikrotiterplatten-basierten Fluoreszenz-Methoden nur eingesetzt werden, wenn vorher gezeigt wurde, dass die Pflanzenextrakte bei allen Testkonzentrationen sowie bei verschiedenen Metabolitenkonzentrationen weder Quenching- noch Eigenfluoreszenz-Effekte zeigen. Ebenso wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass die bisher in Veröffentlichungen durchgeführten Kontrollinkubationen nur bedingt zur Kompensation von Quenching- und Eigenfluoreszenz-Effekten geeignet sind. Das Auftreten und Ausmaß der Quenching- und Eigenfluoreszenz-Effekte sind abhängig vom Inhibitor (Pflanzenextrakt), der Inhibitorkonzentration, dem Metaboliten und dessen Anregungs- und Emissionswellenlänge sowie der Metabolitenkonzentration, die durch die enzymatische Umsetzung des Substrats und der inhibitorischen Aktivität des Inhibitors bestimmt wird. Während der Inhibitor, die zu testenden Inhibitorkonzentrationen, der Metabolit sowie dessen Anregungs- und Emissionswellenlänge eine feste Größe darstellen, ist die Metabolitenkonzentration je nach inhibitorischer Aktivität des Inhibitors sehr unterschiedlich. D. h. letztendlich hängt das genaue Ausmaß der Eigenfluoreszenz- und Quenching-Effekte von der inhibitorischen Aktivität der Pflanzenextrakte ab. Es konnte gezeigt werden, dass je geringer die Metabolitenkonzentration ist, desto stärker wird das Fluoreszenzsignal reduziert (Quenching) bzw. erhöht (Eigenfluoreszenz). Eine sinnvolle Kontrollinkubation zur Kompensation von Quenching- und Eigenfluoreszenz-Effekten kann also gar nicht durchgeführt werden. Bei In-vitro-Untersuchungen zur Bestimmung der inhibitorischen Aktivität ist die Metabolitenkonzentration nicht bekannt und somit der Einfluss der Effekte nicht bestimmbar.