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Die spinale Muskelatrophie (SMA) ist eine monogenetische Erkrankung, bei der es durch den Verlust des SMN Proteins zur Degeneration der α-Motoneurone im Rückenmark kommt. Abhängig vom Schweregrad zeigen die Patienten bereits innerhalb der ersten Lebensmonate ausgeprägte Lähmungen der Skelettmuskulatur und eine Zwerchfellparese einhergehend mit einer reduzierten Lebenserwartung. Mithilfe von Mausmodellen für die SMA konnte gezeigt werden, dass der Motoneuronenverlust bei Smn-defizienten Mäusen mit Störungen der Neurotransmission an der motorischen Endplatte und mit Differenzierungsstörungen der Motoneurone einhergeht. Die Differenzierungs-störungen primärer Smn-defizienter Motoneurone sind eng gekoppelt mit einer verminderten Clusterbildung spannungsabhängiger Kalziumkanäle im distalen axonalen Bereich. Dies wiederum führt zu einer verminderten Frequenz spontaner Kalziumeinströme am Axonterminus und hat eine veränderte axonale Elongation zur Folge.
Es wurden folgende Aspekte in Bezug auf die Verstärkung und die Induktion spontaner Kalziumeinströme in Mausmodellen für spinale Muskelatrophien in dieser Arbeit adressiert:
1) Lassen sich spontane Kalziumeinströme in Smn-defizienten Motoneuronen durch die externe Applikation von Kalziumkanalagonisten verstärken?
2) Sind spontane Kalziumeinströme in primären Motoneuronen durch den Brain-derived-neurotrophic-factor (BDNF) induzierbar?
3) Zeigen primäre Motoneurone eines Mausmodells für spinale Muskelatrophie mit Ateminsuffizienz Typ 1 (SMARD1) ebenfalls veränderte Kalziumtransienten?
Die Ergebnisse meiner Arbeit zeigen, dass durch den Kalziumkanalagonisten R-Roscovitine die Frequenz der spontanen Kalziumeinströme im distalen Axon von Smn-defizienten Motoneuronen signifikant erhöht wird. Dies hat wiederum einen regulierenden Effekt auf die Differenzierung der SMA Motoneurone zur Folge. Smn-defiziente Motoneurone zeigen somit keine Unterschiede mehr in Bezug auf Axonlängen und Wachstumskegelflächen im Vergleich zu Kontrollzellen. Für R-
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Roscovitine ist neben der agonistischen Wirkung am Kalziumkanal auch ein inhibitorischer Effekt auf die Cyclin-abhängige Kinase 5 beschrieben. Es konnte jedoch gezeigt werden, dass die erhöhten Kalziumtransienten unter der Behandlung mit R-Roscovitine durch eine direkte Bindung an die Cav2 Kalziumkanäle verursacht werden und nicht durch eine Cdk5 Blockade. Dafür spricht die schnelle und reversible Wirkung von R-Roscovitine, sowie die Aufhebung des R-Roscovitines Effekts bei gleichzeitiger Gabe des Cav2.2 Antagonisten ω-Conotoxin MVIIC.
Der zweite Aspekt dieser Arbeit behandelt den Einfluss der neurotrophen Faktoren BDNF, CNTF und GDNF auf die Kalziumtransienten am Wachstumskegel wildtypischer Motoneurone. Der Vergleich der neurotrophen Faktoren zeigt, dass nur BDNF eine induzierende Wirkung auf spontane Kalziumtransienten am Wachstumskegel hat.
Der letzte Abschnitt dieser Arbeit beschäftigt sich mit den Kalziumtransienten bei Motoneuronen aus dem Nmd2J (SMARD1) Mausmodell. Die SMARD1 gilt als eigenständige Form der spinalen Muskelatrophien mit unterschiedlicher Genetik und unterschiedlichen klinischen Merkmalen. Die Motoneurone weisen in Bezug auf die Kalziumtransienten keine Unterschiede zwischen Wildtyp und Nmd2J Mutante auf. Es ergibt sich somit kein Hinweis darauf, dass die Degeneration der Motoneurone bei der SMARD1 von einer Störung der Kalziumhomöostase im distalen axonalen Bereich ausgeht.
Spontaneous Ca\(^{2+}\) transients and actin dynamics in primary motoneurons correspond to cellular differentiation such as axon elongation and growth cone formation. Brain-derived neurotrophic factor (BDNF) and its receptor trkB support both motoneuron survival and synaptic differentiation. However, in motoneurons effects of BDNF/trkB signaling on spontaneous Ca\(^{2+}\) influx and actin dynamics at axonal growth cones are not fully unraveled. In our study we addressed the question how neurotrophic factor signaling corresponds to cell autonomous excitability and growth cone formation. Primary motoneurons from mouse embryos were cultured on the synapse specific, β2-chain containing laminin isoform (221) regulating axon elongation through spontaneous Ca\(^{2+}\) transients that are in turn induced by enhanced clustering of N-type specific voltage-gated Ca\(^{2+}\) channels (Ca\(_{v}\)2.2) in axonal growth cones. TrkB-deficient (trkBTK\(^{-/-}\)) mouse motoneurons which express no full-length trkB receptor and wildtype motoneurons cultured without BDNF exhibited reduced spontaneous Ca\(^{2+}\) transients that corresponded to altered axon elongation and defects in growth cone morphology which was accompanied by changes in the local actin cytoskeleton. Vice versa, the acute application of BDNF resulted in the induction of spontaneous Ca\(^{2+}\) transients and Ca\(_{v}\)2.2 clustering in motor growth cones, as well as the activation of trkB downstream signaling cascades which promoted the stabilization of β-actin via the LIM kinase pathway and phosphorylation of profilin at Tyr129. Finally, we identified a mutual regulation of neuronal excitability and actin dynamics in axonal growth cones of embryonic motoneurons cultured on laminin-221/211. Impaired excitability resulted in dysregulated axon extension and local actin cytoskeleton, whereas upon β-actin knockdown Ca\(_{v}\)2.2 clustering was affected. We conclude from our data that in embryonic motoneurons BDNF/trkB signaling contributes to axon elongation and growth cone formation through changes in the local actin cytoskeleton accompanied by increased Ca\(_{v}\)2.2 clustering and local calcium transients. These findings may help to explore cellular mechanisms which might be dysregulated during maturation of embryonic motoneurons leading to motoneuron disease.