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Malignant melanoma (MM) is the most dangerous type of skin cancer with rising incidences worldwide. Melanoma skin models can help to elucidate its causes and formation or to develop new treatment strategies. However, most of the current skin models lack a vasculature, limiting their functionality and applicability. MM relies on the vascular system for its own supply and for its dissemination to distant body sites via lymphatic and blood vessels. Thus, to accurately study MM progression, a functional vasculature is indispensable. To date, there are no vascularized skin models to study melanoma metastasis in vitro, which is why such studies still rely on animal experimentation.
In the present thesis, two different approaches for the vascularization of skin models are employed with the aim to establish a vascularized 3D in vitro full-thickness skin equivalent (FTSE) that can serve as a test system for the investigation of the progression of MM.
Initially, endothelial cells were incorporated in the dermal part of FTSEs. The optimal seeding density, a spheroid conformation of the cells and the cell culture medium were tested. A high cell density resulted in the formation of lumen-forming shapes distributed in the dermal part of the model. These capillary-like structures were proven to be of endothelial origin by staining for the endothelial cell marker CD31. The established vascularized FTSE (vFTSE) was characterized histologically after 4 weeks of culture, revealing an architecture similar to human skin in vivo with a stratified epidermis, separated from the dermal equivalent by a basement membrane indicated by collagen type IV. However, this random capillary-like network is not functional as it cannot be perfused.
Therefore, the second vascularization approach focused on the generation of a perfusable tissue construct. A channel was molded within a collagen hydrogel and seeded with endothelial cells to mimic a central, perfusable vessel. The generation and the perfusion culture of the collagen hydrogel was enabled by the use of two custom-made, 3D printed bioreactors. Histological assessment of the hydrogels revealed the lining of the channel with a monolayer of endothelial cells, expressing the cell specific marker CD31.
For the investigation of MM progression in vitro, a 3D melanoma skin equivalent was established. Melanoma cells were incorporated in the epidermal part of FTSEs, representing the native microenvironment of the tumor. Melanoma nests grew at the dermo-epidermal junction within the well stratified epidermis and were characterized by the expression of common melanoma markers. First experiments were conducted showing the feasibility of combining the melanoma model with the vFTSE, resulting in skin models with tumors at the dermo-epidermal junction and lumen-like structures in the dermis.
Taken together, the models presented in this thesis provide further steps towards the establishment of a vascularized, perfusable melanoma model to study melanoma progression and metastasis.
Forkhead box O transcription factors are a family of proteins involved in cellular processes downstream of the Insulin-PI3K-PKB pathway. In response to extra- or intracellular stresses, for example starvation or oxidative stress, FoxOs are required to direct cell cycle progression and apoptosis. In endothelial cells, they induce apoptosis, and their deregulation is linked to diseases involving the insulin pathway, such as diabetes. FoxOs also exhibit a complex role in tumour transformation: here their main function is to suppress tumorigenesis. In both physiological and cancer contexts, FoxO activation leads to the transcription of some general targets, such as p27kip1 or IGFBP1. The FoxOs can also induce tissue-specific genes, as ANGPT2 and BIM in the endothelium.
In endothelial cells, another pathway with a pivotal function is the MEK5/ERK5 MAPK signalling way. Its activation promotes cell survival and proliferation in stressful conditions, e.g., when blood vessels are exposed to the shear forces exerted by the blood stream. Furthermore, recent data described ERK5 as a kinase directing tumour resistance upon therapy-induced stress.
Comparing their reported roles in various tumours and in the endothelium, FoxO proteins and the MEK5/ERK5 MAPK cascade appear to exert opposite functions. First non-published data confirmed the hypothesis that FoxO factors are subject to a negative modulation by the MEK5/ERK5 pathway. Hence, one goal of this PhD project was to further characterise this crosstalk at molecular level. The major mechanism of FoxO regulation is the balance among several post translational modifications, such as phosphorylation, acetylation, and ubiquitination. Most importantly, the PKB dependent phosphorylation of FoxOs negatively controls their activity, and it is critical for their subcellular localization. Therefore, the regulation of FoxO localization as mechanism of ERK5 dependent suppression was studied, but the results presented in this thesis argue against this hypothesis. However, additional experiments are required to explore the impact of ERK5 activity on FoxO post-translational modifications.
FoxO activity can also be modulated by the interaction with other proteins, which in turn could explain general- and tissue-specific gene expression. Thus, another objective of this work was to investigate FoxO3-interactome in endothelial cells and the impact of MEK5/ERK5 activation on it. As published in (Fusi et al. 2022) and presented here, this analysis unveiled TRRAP as new FoxO bound protein in several cell types. Moreover, the interaction did not rely on the capacity of the FoxOs to bind their consensus DNA sequences at the promoter of target genes. Functional data demonstrated that TRRAP is required for FoxO-dependent gene transcription in endothelial and osteosarcoma cells. In addition, TRRAP expression in the endothelium is important for FoxO induced apoptosis. In summary, the interaction between FoxO factors and TRRAP revealed a new regulatory mechanism of FoxO-dependent gene transcription. It remains to be analysed whether the MEK5/ERK5 cascade may exert its suppressive effect on FoxO activity by interfering with their binding to TRRAP and whether such a mechanism may be relevant for tumorigenesis.
Aktivierung des MEK5/ Erk5-Signalwegs durch inhibitorische Substanzen des Mevalonatstoffwechsels
(2018)
Die Osteoporose ist eine Erkrankung, die durch verminderte Dichte und erhöhte Fragilität des Knochens gekennzeichnet ist. Sie zählt zu den häufigsten Erkrankungen weltweit und geht mit erheblicher Einschränkung der Lebensqualität und erhöhter Mortalität einher. Eine Behandlungsmöglichkeit dieses schwerwiegenden Krankheitsbilds ist die Therapie mit Bisphosphonaten. Diese hemmen mit ihren antiresorptiven Eigenschaften den Knochenabbau und fördern vermutlich gleichzeitig den Knochenaufbau. Obwohl schon lange die Wirkungsweise der Bisphosphonate erforscht wird, ist noch nicht sicher geklärt, wie beispielsweise osteoanabole oder antitumoröse Effekte vermittelt werden. Einen Erklärungsansatz bietet der MEK5/ Erk5-Signalweg. Diesem werden unter anderem antiangiogenetische, antiinflammatorische und antiproliferative Eigenschaften zugesprochen. In früheren Studien konnte gezeigt werden, dass Statine Erk5 und Erk5-abhängige Gene aktivieren können. Statine wiederum inhibieren ebenfalls den Mevalonatstoffwechsel, jedoch weiter upstream als Bisphosphonate. Da Statine zudem osteoanabole Effekte aufweisen, lag die These nahe, dass auch Bisphosphonate ihre Wirkung über den MEK5/Erk5-Signalweg vermitteln könnten. Die These konnte im Rahmen dieser Arbeit bestätigt werden: Stickstoffhaltige, nicht aber stickstofffreie Bisphosphonate aktivieren Erk5 sowohl in Endothelzellen als auch in Osteoblasten. Es gilt jedoch zu bedenken, dass eine Weiterentwicklung der Substanzen mit verbesserter Aufnahme in die Zelle zur Vermeidung von Apoptose-Induktion anzustreben ist.
Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass ein Knock-down der FDPS, dem Angriffspunkt der Bisphosphonate im Mevalonatstoffwechsel, ebenfalls eine Erk5-Phosphorylierung zur Folge hat. Durch Inhibition der FDPS wird die Prenylierung kleiner G-Proteine wie Cdc42 unterbunden, was eine veränderte Funktion der Proteine zur Folge hat. Ein Knock-down von Cdc42 mittels siRNA führt wiederum zu einer Aktivierung von Erk5. Auf diese Weise wurde nicht nur ein neuer Wirkungsweg der Bisphosphonate identifiziert, sondern auch ein möglicher Aktivierungsmechanismus der MEK5/ Erk5-Signalkaskade aufgedeckt.
Erk5 wandert nach seiner Aktivierung in den Zellkern und beeinflusst dort die Genexpression. Im Rahmen dieser Arbeit wurden knochenrelevante Gene identifiziert, die durch Zoledronat-Stimulation induziert werden konnten. Zu diesen zählen INPP4B, das die Osteoklastogenese inhibiert, und PTHLH sowie FOSL1, welche die Osteoblastogenese fördern. Somit kann davon ausgegangen werden, dass die Aktivierung des MEK5/ Erk5-Signalwegs durch Zoledronat eine Geninduktion zur Folge hat, die sowohl die osteoanabole Wirkung unterstützt, als auch die katabolen Effekte hemmt. Auf diese Weise konnte neben den bereits bekannten Wirkungswegen der Bisphosphonate ein neuer identifiziert werden, der auch einen möglichen Ansatz für weitere, bisher ungeklärte Effekte von Bisphosphonaten darstellt.
In dieser Dissertation wird der MEK5/ERK5- Signalweg als möglicher Angriffspunkt in der zielgerichteten Melanomtherapie identifiziert. Die Adressierung von ERK5 bietet eine Alternative, um einer Resistenzentwicklung gegenüber Inhibitoren des MAPK- Signalwegs entgegenzuwirken. Das maligne Melanom ist ein hochaggressiver Tumor mit steigender Inzidenz. Zunehmende Sonnenstunden im Rahmen des Klimawandels mit erhöhter Belastung der Haut durch UV-Strahlung werden die Problematik des malignen Melanoms für den Menschen in den nächsten Jahren weiter zunehmen lassen.
Die Aktivierung des MEK5/ERK5- Signalwegs scheint eine Reaktion von Tumorzellen auf Therapiestress zu sein. Diese Aktivierung liefert den Melanomzellen einen Überlebensvorteil und verhindert ein langfristiges Therapieansprechen. ERK5 beeinflusst den Zellzyklus von Melanomzellen und ist somit möglicherweise von wichtiger Bedeutung in der Tumorgenese des malignen Melanoms.
Patienten mit NRAS- Mutation profitieren auffallend weniger von einer gezielten MEKi-Therapie als solche mit BRAF Mutation. Für ersteres Patientenkollektiv steht aktuell lediglich die Immuntherapie zur Verfügung, wodurch oft nur ein kurzes, progressionsfreies Intervall erreicht werden kann und die Patienten häufig unter schweren Nebenwirkungen leiden. Grund für die problematische Behandlung könnte das häufige Auftreten einer basalen ERK5- Aktivierung in NRAS- mutierten Melanomen sein. Diese Arbeit liefert eine positive Prognose über den Nutzen einer ERK5- Inhibition als Erweiterung des Therapieschemas. Diese These gilt auch für Melanompatienten mit einer BRAF- Mutation. Patienten, die an einem malignen Melanom erkrankt sind, weisen zu 80% eine Mutation in einem dieser beschriebenen Onkogene auf. Die Arbeit lässt darauf schließen, dass eine ERK5- Inhibition in der Therapie von beiden Gruppen erfolgreich sein könnte und somit das Leben nahezu aller Melanompatienten betrifft.