Since 2018, 2 chimeric antigen receptor (CAR) T-cell therapies received approval from the European Medicine Agency, with list prices around 320 000 Euro (€) (EUR) per treatment. These high prices raise concerns for patient access and the sustainability of healthcare systems. We aimed to estimate the costs and budget impact associated with CAR T-cell therapies for current and future indications in hematological cancers from 2019 to 2029. We focused on the former France, Germany, Spain, Italy and the United Kingdom (EU-5) and the Netherlands. We conducted a review of list prices, health technology assessment reports, budget impact analysis dossiers, and published cost-effectiveness analyses. We forecasted the 10-year health expenditures on CAR T-cells for several hematological cancers in selected European Union countries. Nine cost-effectiveness studies were identified and list prices for CAR T-cell therapies ranged between 307 200 EUR and 350 000 EUR. Estimated additional costs for pre- and post-treatment were 50 359 EUR per patient, whereas the incremental costs of CAR T-cell therapy (when compared with care as usual) ranged between 276 086 EUR and 328 727 EUR. We estimated market entry of CAR T-cell therapies for chronic mantle cell lymphoma, follicular lymphoma, chronic lymphocytic leukemia, multiple myeloma, and acute myeloid leukemia in 2021, 2022, 2022, 2022, and 2025, respectively. Cumulative expenditure estimates for existing and future indications from 2019 to 2029 were on average 28.5 billion EUR, 32.8 billion EUR, and 28.9 billion EUR when considering CAR T-cell therapy costs only, CAR T-cell therapy costs including pre- and post-treatment, and incremental CAR T-cell therapy costs, respectively. CAR T-cell therapies seem to be promising treatment options for hematological cancers but the financial burden on healthcare systems in the former EU-5 and the Netherlands will contribute to a substantial rise in healthcare expenditure in the field of hematology.

Megakaryocytes (MKs), the precursors of blood platelets, are large, polyploid cells residing mainly in the bone marrow. We have previously shown that balanced signaling of the Rho GTPases RhoA and Cdc42 is critical for correct MK localization at bone marrow sinusoids in vivo. Using conditional RhoA/Cdc42 double-knockout (DKO) mice, we reveal here that RhoA/Cdc42 signaling is dispensable for the process of polyploidization in MKs but essential for cytoplasmic MK maturation. Proplatelet formation is virtually abrogated in the absence of RhoA/Cdc42 and leads to severe macrothrombocytopenia in DKO animals. The MK maturation defect is associated with downregulation of myosin light chain 2 (MLC2) and β1-tubulin, as well as an upregulation of LIM kinase 1 and cofilin-1 at both the mRNA and protein level and can be linked to impaired MKL1/SRF signaling. Our findings demonstrate that MK endomitosis and cytoplasmic maturation are separately regulated processes, and the latter is critically controlled by RhoA/Cdc42.

Hypertrophic cardiomyopathy (HCM) is a complex myocardial disorder with no well-established disease-modifying therapy so far. Our study aimed to investigate how autophagy, oxidative stress, inflammation, stress signalling pathways, and apoptosis are hallmark of HCM and their contribution to the cardiac dysfunction. Demembranated cardiomyocytes from patients with HCM display increased titin-based stiffness (Fpassive), which was corrected upon antioxidant treatment. Titin as a main determinant of Fpassive was S-glutathionylated and highly ubiquitinated in HCM patients. This was associated with a shift in the balance of reduced and oxidized forms of glutathione (GSH and GSSG, respectively). Both heat shock proteins (HSP27 and α-ß crystalline) were upregulated and S-glutathionylated in HCM. Administration of HSPs in vitro significantly reduced HCM cardiomyocyte stiffness. High levels of the phosphorylated monomeric superoxide anion-generating endothelial nitric oxide synthase (eNOS), decreased nitric oxide (NO) bioavailability, decreased soluble guanylyl cyclase (sGC) activity, and high levels of 3-nitrotyrosine were observed in HCM. Many regulators of signal transduction pathways that are involved in autophagy, apoptosis, cardiac contractility, and growth including the mitogen-activated protein kinase (MAPK), protein kinase B (AKT), glycogen synthase kinase 3ß (GSK-3ß), mammalian target of rapamycin (mTOR), forkhead box O transcription factor (FOXO), c-Jun N-terminal protein kinase (JNK), and extracellular-signal-regulated kinase (ERK1/2) were modified in HCM. The apoptotic factors cathepsin, procaspase 3, procaspase 9 and caspase 12, but not caspase 9, were elevated in HCM hearts and associated with increased proinflammatory cytokines (Interleukin 6 (IL-6), interleukin 18 (IL-18), intercellular cell adhesion molecule-1 (ICAM1), vascular cell adhesion molecule-1 (VCAM1), the Toll-like receptors 2 (TLR2) and the Toll-like receptors 4 (TLR4)) and oxidative stress (3-nitrotyrosine and hydrogen peroxide (H2O2)). Here we reveal stress signalling and impaired PQS as potential mechanisms underlying the HCM phenotype. Our data suggest that reducing oxidative stress can be a viable therapeutic approach to attenuating the severity of cardiac dysfunction in heart failure and potentially in HCM and prevent its progression.

RKIP ist ein Kinaseregulator, der unter anderem Raf und GRK-2 kontrolliert. Im Herzen inhibiert RKIP die GRK-2 und verstärkt daher die beta-adrenerge Signalweiterleitung. Eine Überexpression von RKIP im murinen Herzen führt zu einer Steigerung der kardialen Kontraktilität, die gut toleriert wird. Aufgrund einer ausgewogenen Aktivierung der beta1- und beta2-Adrenorezeptoren (beta-AR) hat der positiv inotrope Effekt -unerwarteterweise- keine schädlichen Auswirkungen auf das Herzgewebe. Der beobachtete Phänotyp weist auf einen erhöhten Energiebedarf hin. Da dies möglicherweise einen Effekt von RKIP auf Mitochondrien beinhaltet, war das Ziel dieses Projekts die Aufklärung einer möglichen Achse aus RKIP, betaAR und Mitochondrien. Elektronenmikroskopische Aufnahmen zeigten einen Effekt von RKIP auf die mitochondriale Morphologie. Die Mitochondrien in wildtypischen (Wt) Mausherzen reihten sich entlang der Myofilamente auf. In Mäusen mit einer Herz-spezifischen Überexpression von RKIP (RKIP-tg) war ein größerer Anteil des Herzgewebes mit Mitochondrien bedeckt, hervorgerufen durch eine erhöhte Anzahl an Mitochondrien im Vergleich zu Wt. Trotzdem ist die hochgeordnete Struktur von Mitochondrien und Myofilamenten nicht gestört. Die Mitochondrien bilden sogar mehrschichtige Reihen zwischen den Myofilamenten aus. Im Gegensatz dazu sind Mitochondrien aus RKIP-knockout Tieren (RKIP-KO) kleiner und ihre Konnektivität, die die geordnete Struktur ausprägt, geht verloren. Die Veränderungen der mitochondrialen Morphologie gehen einher mit Anomalitäten im Expressionsniveau von Proteinen der mitochondrialen Teilung und Fusion. Mitochondrien sind sehr dynamische Organellen, die permanenten Teilungs- und Fusionsprozessen unterliegen, die von einem Set aus GTPasen ausgeführt werden. Die Expression von DRP-1, einem Protein der mitochondrialen Teilung, ist in RKIP-KO Mausherzen hochreguliert im Vergleich zu Wt und RKIP-tg. Das könnte die reduzierte Größe von Mitochondrien in RKIP-KO Herzen erklären. Im Gegensatz dazu ist Mfn-1, ein Protein der mitochondrialen Fusionsmaschinerie, zwischen den Genotypen nicht verändert. Das passt gut zu der Beobachtung, dass RKIP nicht zu einer Vergrößerung von individuellen Mitochondrien führt. Trotzdem ist Mfn-2, ein Protein das zur Verknüpfung von Mitochondrien und von Mitochondrien mit anderen Organellen beiträgt, in RKIP-tg Mausherzen verglichen mit Wt und RKIP-KO hochreguliert. Das könnte zu der Ausbildung eines Netzwerkes zwischen der erhöhten Anzahl an Mitochondrien beitragen. Um zu überprüfen, ob die morphologischen Veränderungen auf funktionaler Ebene gespiegelt werden, wurden Sauerstoffverbrauchsmessungen durchgeführt. Tatsächlich zeigten Mitochondrien, die aus RKIP-KO Herzen gewonnen wurden, eine erniedrigte ADP-stimulierte Atmung verglichen mit Wt Mitochondrien. Bezieht man die Hyperpolarisation der inneren Mitochondrienmembran, die in isolierten Kardiomyozyten beobachtet wurde, mit ein, könnte das auf einen Defekt in der ATP-Synthese zurückzuführen sein. Im Einklang damit ist das Expressionsniveau von ATP5a, einem Protein, das am Aufbau der ATP-Synthase beteiligt ist, in isolierten Mitochondrien aus RKIP-KO Mausherzen reduziert. Das deutet auf eine essentielle Funktion von RKIP bei der mitochondrialen Funktion hin. Im Gegensatz dazu war die mitochondriale Funktion in RKIP-überexprimierenden Herzen normal. Der Sauerstoffverbrauch und das mitochondriale Membranpotential waren nicht von Wt zu unterscheiden. Jedoch steigerte eine RKIP-Überexpression das Expressionsniveau von Proteinen der Atmungskette. Dies führte uns zu der Hypothese, dass RKIP kardiale Mitochondrien schützt. Um dies zu testen, wurden Ischämie/Reperfusionsbedingungen in isolierten Kardiomyozyten simuliert, indem ein Puffer zugesetzt wurde, der die metabolischen Veränderungen während einer Ischämie imitiert. Während das mitochondriale Membranpotential in Wt Kardiomyozyten kollabiert, wenn der Ischämiepuffer zugegeben wird, waren RKIP-tg Kardiomyozyten vor diesem schädlichen Effekt geschützt. Das deutet einen RKIP-vermittelten Schutz der kardialen Mitochondrien unter ischämischen Bedingungen an. Da RKIP im Herzen als GRK-2-Inhibitor fungiert, wollten wir als nächstes die Beteiligung der betaAR am RKIP-vermittelten Effekt auf Mitochondrien untersuchen. Daher wurden die RKIP-induzierten Veränderungen der Proteinexpression in Abwesenheit von beta1AR oder beta2AR analysiert. Interessanterweise hebt der Verlust des beta2AR den RKIP-vermittelten Anstieg der Mfn-2 Expression und der Proteine der Atmungskette komplett auf, während ein beta1-KO keinen Effekt hat. Um die Rolle des beta2AR als Mitochondrien-protektiven Rezeptor weiter zu beleuchten, wiederholten wir die Experimente, bei denen adulte Kardiomyozyten mit Ischämiepuffer behandelt wurden. In Abwesenheit des beta2AR verlor RKIP seinen schützenden Effekt auf kardiale Mitochondrien. Zusammengenommen weist das darauf hin, dass RKIP einen Effekt auf morphologischer und funktionaler Ebene sowie auf Proteinebene auf Mitochondrien ausübt. Die erhöhte Anzahl an funktionalen Mitochondrien könnte dabei helfen, die zusätzliche Energie bereitzustellen, die für eine langfristige Erhöhung der kardialen Kontraktilität benötigt wird. Da wir beobachtet haben, dass RKIP Mitochondrien beeinflussen könnte, war die nächste Überlegung, die Rolle von Mitochondrien im Kontext von genetischen Formen der Kardiomyopathie zu untersuchen. Die PLNR9C Mutation verursacht eine schnell fortschreitende Form der dilatativen Kardiomyopathie. In einem Mausmodell verlängerte die gleichzeitige Überexpression von RKIP das Überleben und stellte die Herzfunktion in PLNR9C Mäusen wieder her. Zunächst beobachten wir einen reduzierten Sauerstoffverbrauch in kardialen Mitochondrien aus PLNR9C Mäusen. Nimmt man die Depolarisation des mitochondrialen Membranpotentials dazu, scheint die mitochondriale Fehlfunktion auf einem Defekt der Substratoxidation zu beruhen. Eine gleichzeitige Überexpression von RKIP normalisierte den mitochondrialen Phänotyp der PLNR9C Mäuse fast vollständig. Das legt nahe, dass Mitochondrien nicht nur Teil der PLNR9C-induzierten Kardiomyopathie sind, sondern auch des RKIP-abhängigen Schutzes. Da Mitochondrien in einer Vielzahl von kardialen Situationen eine zentrale Rolle einnehmen, war das nächste Ziel die mitochondriale Gesundheit als Parameter für die Testung von Substanztoxizität zu etablieren. Die Messung des mitochondrialen Membranpotentials wurde angewandt, um eine kleine Bibliothek von MEK-Inhibitoren auf ihre mitochondriale Toxizität zu testen. Die bekannten Nebenwirkungen der MEK-Inhibitoren auf Kardiomyozyten und die Rolle der ERK-Aktivierung bei der Apoptose veranlasste uns dazu. Tatsächlich brach das mitochondriale Membranpotential nach Behandlung mit MEK-Inhibitoren ein und verringerte sich unter oxidativem Stress noch weiter. Im Gegensatz dazu führte eine neue Interventionsstrategie für die Raf/MEK/ERK-Kaskade, die spezifisch mit der nukleären Akkumulation von ERK interferiert, die zytosolische ERK-Aktivität aber erhält, nicht zu einer Depolarisation des mitochondrialen Membranpotentials und schützte die Kardiomyozyten sogar unter Wasserstoffperoxidbehandlung. Zusammen genommen betont das Projekt die immens wichtige Rolle von Mitochondrien für neue Strategien zur Kontraktionskraftsteigerung, in pathologischen Situationen, wie Kardiomyopathien, und deren Interventionsstrategien und sogar für das Sicherheitsprofil von neuen therapeutischen Substanzen.

In dieser Arbeit wurde die Signaltransduktion und differentielle Genexpression der Liganden BMP2 und GDF5, wichtige Mitglieder der TGF-β-Superfamilie, in den Zelllinien ATDC5 und C2C12 untersucht. Die Analyse fokussierte sich auf deren unterschiedliche Wirkungen, Interaktionen mit Typ-I-Rezeptoren, den SMAD-Signalweg, unterschiedliche Geninduktion und biologische Funktionen. Zunächst wurde die osteogene Aktivität von BMP2 und GDF5 sowie der GDF5-Mutante GDF5-R57A mittels ALP-Assay bestimmt. Die Ergebnisse zeigten, dass BMP2 eine starke osteogene Wirkung in beiden Zelllinien aufwies, während GDF5 und GDF5-R57A unterschiedliche Aktivitäten zeigten, abhängig von der Zelllinie. Mittels Western Blot wurde die Phosphorylierung von SMAD1/5/8 analysiert, wobei ähnliche Phosphorylierungsmuster für GDF5-R57A und BMP2 beobachtet wurden, trotz unterschiedlicher Ergebnisse in der ALP-Analyse. Es wurde festgestellt, dass die drei Liganden denselben SMAD-Signalweg aktivieren. Die Genexpressionsanalyse mittels Affymetrix Arrays offenbarte signifikante Unterschiede zwischen BMP2 und GDF5. BMP2 löst eine breitere und intensivere Genaktivierung aus und fördert Prozesse wie enchondrale Ossifikation und osteogene Differenzierung. Zahlreiche Kandidatengene wurden identifiziert, die für die unterschiedliche Aktivität von BMP2 und GDF5 verantwortlich sein könnten. Zudem wurden neue biologische Funktionen für GDF5 definiert. In C2C12-Zellen zeigte GDF5 eine Tendenz zur Inhibition der Zellproliferation und Unterdrückung der Differenzierung. Weitere Untersuchungen mittels RT-PCR zeigten, dass GDF5-R57A sich in der Mehrheit der analysierten Gene ähnlich wie BMP2 verhielt, insbesondere bei Genen, die mit osteogener Differenzierung assoziiert sind. Zusammenfassend zeigt die Arbeit die komplexen Mechanismen der Signaltransduktion durch BMP2 und GDF5 in unterschiedlichen zellulären Kontexten und unterstreicht die Notwendigkeit weiterer Untersuchungen der spezifischen biologischen Funktionen und therapeutischen Anwendungen dieser Moleküle in der Knochenheilung und -regeneration.