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The objective of this thesis was the synthesis and characterisation of two linear multifunctional PEG-alternatives for bioconjugation and hydrogel formation: i) Hydrophilic acrylate based copolymers containing peptide binding units and ii) hydrophilic polyether based copolymers containing different functional groups for a physical crosslinking.
In section 3.1 the successful synthesis of water soluble and linear acrylate based polymers containing oligo(ethylene glycol) methyl ether acrylate with either linear thioester functional 2-hydroxyethyl acrylate, thiolactone acrylamide, or vinyl azlactone via the living radical polymerisation technique Reversible Addition Fragmentation Chain Transfer (RAFT) and via free-radical polymerisation is described. The obtained polymers were characterized via GPC, 1H NMR, IR and RAMAN spectroscopy.
The RAFT end group was found to be difficult to remove from these short polymer chains and accordingly underwent the undesired side reaction aminolysis with the peptide during the conjugation studies. Besides that, polymers without RAFT end groups did not show any binding of the peptide at the thioester groups, which can be improved in future by using higher reactant concentrations and higher amount of binding units at the polymer. Polymers containing the highly reactive azlactone group showed a peptide binding of 19 %, but unfortunately this function also underwent spontaneous hydrolysis before the peptide could even be bound. In all cases, oligo(ethylene glycol) methyl ether acrylate was used with a relatively high molecular weight (Mn = 480 Da) was used, which eventually was efficiently shielding the introduced binding units from the added peptide. In future, a shorter monomer with Mn = 300 Da or less or hydrophilic N,N’-dialkyl acrylamide based polymers with less steric hindrance could be used to improve this bioconjugation system. Additionally, the amount of monomers containing peptide binding units in the polymer can be increased and have an additional spacer to achieve higher loading efficiency.
The water soluble, linear and short polyether based polymers, so called polyglycidols, were successfully synthesized and modified as described in section 3.2. The obtained polymers were characterized using GPC, 1H NMR, 31P{1H} NMR, IR, and RAMAN spectroscopy. The allyl groups which were present up to 20 % were used for radical induced thiol-ene chemistry for the introduction of functional groups intended for the formation of the physically crosslinking hydrogels. For the positively charged polymers, first a chloride group had to be introduced for the subsequent nucleophilic substitution with the imidazolium compound. There, degrees of modifications were found in the range 40-97 % due to the repulsion forces of the charges, decreased concentration of active chloride groups, and limiting solution concentrations of the polymer for this reaction. For the negatively charged polymers, first a protected phosphonamide moiety was introduced with a deprotection step afterwards showing 100 % conversion for all reactions. Preliminary hydrogel tests did not show a formation of a three-dimensional network of the polymer chains which was attributed to the short backbone length of the used polymers, but the gained knowledge about the synthetic routes for the modification of the polymer was successfully transferred to longer linear polyglycidols. The same applies to the introduction of electron rich and electron poor compounds showing π-π stacking interactions by UV-vis spectroscopy.
Finally, long linear polyglycidyl ethers were synthesised successfully up to molecular weights of Mn ~ 30 kDa in section 3.3, which was also proven by GPC, 1H NMR, IR and RAMAN spectroscopy. This applies to the homopolymerisation of ethoxyethyl glycidyl ether, allyl glycidyl ether and their copolymerisation with an amount of the allyl compound ~ 10 %. Attempts for higher molecular weights up to 100 kDa showed an uncontrolled polymerisation behaviour and eventually can be improved in future by choosing a lower initiation temperature. Also, the allyl side groups were modified via radical induced thiol-ene chemistry to obtain positively charged functionalities via imidazolium moieties (85 %) and negatively charged functionalities via phosphonamide moieties (100 %) with quantitative degree of modifications. Hydrogel tests have still shown a remaining solution by using long linear polyglycidols carrying negative charges with long/short linear polyglycidols carrying positive charges. The addition of calcium chloride led to a precipitate of the polymer instead of a three-dimensional network formation representing a too high concentration of ions and therefore shielding water molecules with prevention from dissolving the polymer. These systems can be improved by tuning the polymers structure like longer polymer chains, longer spacer between polymer backbone and charge, and higher amount of functional groups.
The objective of the thesis was partly reached containing detailed investigated synthetic routes for the design and characterisation of functional polymers which could be used in future with improvements for bioconjugation and hydrogel formation tests.
In the field of biofabrication, biopolymer-based hydrogels are often used as bulk materials with defined structures or as bioinks. Despite their excellent biocompatibility, biopolymers need chemical modification to fulfill mechanical stability.
In this thesis, the primary alcohol of hyaluronic acid was oxidized using TEMPO/TCC oxidation to generate aldehyde groups without ring-opening mechanism of glycol cleavage using sodium periodate. For crosslinking reaction of the aldehyde groups, adipic acid dihydrazide was used as bivalent crosslinker for Schiff Base chemistry. This hydrogel system with fast and reversible crosslinking mechanism was used successfully as bulk hydrogel for chondrogenic differentiation with human mesenchymal stem cells (hMSC).
Gelatin was modified with pentenoic acid for crosslinking reaction via light controllable thiol-ene reaction, using thiolated 4-arm sPEG as multivalent crosslinker. Due to preservation of the thermo responsive property of gelatin by avoiding chain degradation during modification reaction, this gelatin-based hydrogel system was successfully processed via 3D printing with low polymer concentration. Good cell viability was achieved using hMSC in various concentrations after 3D bioprinting and chondrogenic differentiation showed promising results.
Die vorliegende Dissertation beschäftigt sich mit nichtlinearen Reaktions-Transport-Systemen, die in zweidimensionalen Medien chemische Wellen und propagierende Fronten ausbilden können. Grundlage dieser Art von räumlichen Mustern sind sogenannte erregbare Systeme. Ein Themengebiet der Arbeit umfasst die Untersuchung von Spiralwellen in der Belousov-Zhabotinsky-Reaktion (BZ-Reaktion). Ein weiterer Teilabschnitt behandelt die Wechselwirkung zwischen Polymersystemen und nichtlinearen chemischen Reaktionen. In den untersuchten, räumlich ausgedehnten Systemen spielt die Kopplung nichtlinearer chemischer Reaktionen an Transportprozesse eine wichtige Rolle. Die generischen Typen von chemischen Mustern sind Pulswellen in einer Raumdimension, kreisförmige Wellen und Spiralen in einem zweidimensionalen System und kugelschalen- bzw. schraubenförmige Wellen in drei Raumdimensionen. Auf theoretischer Basis werden Effekte von Spiralwellen bei Änderung der Erregbarkeit des Reaktionsmediums dargestellt.In der vorliegenden Arbeit ist es erstmals gelungen, eine Methode zu entwickeln, die es erlaubt die Erregbarkeit in der BZ-Reaktion sowie in einer Vielzahl weiterer nichtlinearer Reaktionen zu beeinflussen. Ein weiteres Themengebiet dieser Dissertation ist die Untersuchung von pH-Systeme in Hydrogelen. Dies sind hydrophile Gele, die ihr Volumen in wässrigen Lösungen verändern können. In der vorliegenden Arbeit wurden Gele auf der Basis von Acrylamid und Methacrylat als Copolymer verwendet und an die oben beschriebenen pH-Oszillatoren angekoppelt. Durch Polymerisation von Acrylamid zusammen mit Natriummethacrylat konnte ein mit einem pH-Oszillator beladenes Gel hergestellt werden, das nach Start der Reaktion durch eine kleine Menge Säure mit einer deutlichen Volumenkontraktion reagiert. Diese Kontraktion des Gels konnte ausgenutzt werden, um die chemische Energie eines pH-Reaktionssystems in eine mechanische Kraftwirkung umzuwandeln.
Zusammenfassung
In der Regenerativen Medizin sind polymerbasierte Biomaterialien von großer Bedeutung für
die Entwicklung und Anwendung verbesserter bzw. neuer Therapien. Die Erforschung der
Oberflächeneigenschaften von Biomaterialien, welche als Implantate eingesetzt werden, ist
eine grundlegende Voraussetzung für deren erfolgreichen Einsatz. Die Protein-Oberflächen-
Interaktion geschieht initial, sobald ein Implantat mit Körperflüssigkeiten oder mit Gewebe
in Kontakt kommt, und trägt maßgeblich zur direkten Wechselwirkung von Implantat und
umgebenden Zellen bei. Dieser Prozess wird in der vorliegenden Arbeit an Gelatine untersucht.
Daher bestand ein Ziel darin, stabile, nanometerdünne Gelatineoberflächen herzustellen
und darauf die Adsorption von humanen Plasmaproteinen und bakteriellen Proteinen zu
analysieren.
Die Abscheidung der Gelatinefilme in variabler Schichtdicke auf zuvor mit PPX-Amin modifizierten
Oberflächen wurde unter Verwendung eines Rotationsbeschichters durchgeführt.
Um stabile Hydrogelfilme zu erhalten, wurden die Amingruppen der disaggregierten Gelatinefibrillen
untereinander und mit denen der Amin-Modifizierung durch ein biokompatibles
Diisocyanat quervernetzt. Dieser Prozess lieferte einen reproduzierbaren und chemisch stabilen
Gelatinefilm, welcher durch die substratunabhängige Amin-Modifizierung kovalent auf
unterschiedlichste Oberflächen aufgebracht werden konnte. Die durch den Herstellungsprozess
präzise eingestellte Schichtdicke (Nano- bzw. Mikrometermaßstab) wurde mittels Ellipsometrie
und Rasterkraftmikroskopie ermittelt. Die ebenso bestimmte Rauheit war unabhängig
von der Schichtdicke sehr gering. Gelatinefilme, die auf funktionalisierte und strukturierte
Proben aufgebracht wurden, konnten durch Elektronenmikroskopie dargestellt werden. Mit
Hilfe der Infrarot-Reflexions-Absorptions-Spektroskopie wurden die Gelatinefilme im Hinblick
auf ihre Stabilität chemisch charakterisiert. Zur Quantifizierung der Adsorption humaner
Plasmaproteine (Einzelproteinlösungen) und komplexer Proteingemische aus steril filtrierten
Kulturüberständen des humanpathogenen Bakteriums Pseudomonas aeruginosa wurde die
Quarzkristall-Mikrowaage mit Dissipationsüberwachung eingesetzt. Hiermit konnte nicht
nur die adsorbierte Menge an Proteinen auf dem Gelatinehydrogel bzw. Referenzoberflächen
(Gold, PPX-Amin, Titan), sondern auch die viskoelastischen Eigenschaften des adsorbierten
Proteinfilms bestimmt werden. Allgemein adsorbierte auf dem Gelatinehydrogel eine geringere
Proteinmasse im Vergleich zu den Referenzoberflächen. Circa ein Viertel der adsorbierten
Proteine migrierte in die Poren des gequollenen Gels und veränderte dessen viskoelastische
Eigenschaften. Durch anschließende MALDI-ToF/MS- und MS/MS-Analyse konnten die bakteriellen
Proteine auf den untersuchten Oberflächen identifiziert und untereinander verglichen
werden. Hierbei zeigten sich nur geringfügige Unterschiede in der Proteinzusammensetzung.
Zudem wurde eine Sekundärionenmassenspektrometrie mit Flugzeitanalyse an reinen Gelatinefilmen
und an mit humanen Plasmaproteinen beladenen Gelatinefilmen durchgeführt.
Durch eine anschließende multivariante Datenanalyse konnte zwischen den untersuchten
Proben eindeutig differenziert werden. Dieser Ansatz ermöglicht es, die Adsorption von
unterschiedlichen Proteinen auf proteinbasierten Oberflächen markierungsfrei zu untersuchen
und kann zur Aufklärung der in vivo-Situation beitragen. Darüber hinaus bietet dieser
Untersuchungsansatz neue Perspektiven für die Gestaltung und das schnelle und effiziente
Screening von unterschiedlichen Proteinzusammensetzungen.
Biomaterialien können jedoch nicht nur als Implantate oder Implantatbeschichtungen eingesetzt
werden. Im Bereich des drug delivery und der Depotarzneimittel sind biologisch
abbaubare Polymere, aufgrund ihrer variablen Eigenschaften, von großem Interesse. Die
Behandlung von bakteriellen und fungalen Pneumonien stellt insbesondere bei Menschen mit
Vorerkrankungen wie Cystische Fibrose oder primäre Ziliendyskinesie eine große Herausforderung
dar. Oral oder intravenös applizierte Wirkstoffe erreichen die Erreger aufgrund der
erhöhten Zähigkeit des Bronchialsekretes oft nicht in ausreichender Konzentration. Daher
besteht ein weiteres Ziel der vorliegenden Arbeit darin, mittels electrohydrodynamic cojetting
mikrometergroße, inhalierbare, wirkstoffbeladene Partikel mit zwei Kompartimenten
(Janus-Partikel) herzustellen und deren Eignung für die therapeutische Anwendung bei
Lungeninfektionen zu untersuchen.
Durch das in dieser Arbeit entwickelte Lösungsmittelsystem können Janus-Partikel aus
biologisch abbaubaren Co-Polymeren der Polymilchsäure (Poly(lactid-co-glycolid), PLGA)
hergestellt und mit verschiedenen Wirkstoffen beladen werden. Darunter befinden sich ein
Antibiotikum (Aztreonam, AZT), ein Antimykotikum (Itraconazol, ICZ), ein Mukolytikum
(Acetylcystein, ACC) und ein Antiphlogistikum (Ibuprofen, IBU). Die Freisetzung der eingelagerten
Wirkstoffe, mit Ausnahme von ICZ, konnte unter physiologischen Bedingungen
mittels Dialyse und anschließender Hochleistungsflüssigkeitschromatographie gemessen werden.
Die Freisetzungsrate wird von der Kettenlänge des Polymers beeinflusst, wobei eine
kürzere Kettenlänge zu einer schnelleren Freisetzung führt. Das in die Partikel eingelagerte
Antimykotikum zeigte in vitro eine gute Wirksamkeit gegen Aspergillus nidulans. Durch das
Einlagern von ICZ in die Partikel ist es möglich diesen schlecht wasserlöslichen Wirkstoff in
eine für Patienten zugängliche und wirksame Applikationsform zu bringen. In Interaktion mit
P. aeruginosa erzielten die mit Antibiotikum beladenen Partikel in vitro bessere Ergebnisse
als der Wirkstoff in Lösung, was sich in einem in vivo-Infektionsmodell mit der Wachsmotte
Galleria mellonella bestätigte. AZT-beladene Partikel hatten gegenüber einer identischen
Wirkstoffmenge in Lösung eine 27,5% bessere Überlebensrate der Wachsmotten zur Folge.
Des Weiteren hatten die Partikel keinen messbaren negativen Einfluss auf die Wachsmotten.
Dreidimensionale Atemwegsschleimhautmodelle, hergestellt mit Methoden des Tissue Engineerings,
bildeten die Basis für Untersuchungen der Partikel in Interaktion mit humanen
Atemwegszellen. Die Untersuchung von Apoptose- und Entzündungsmarkern im Überstand
der 3D-Modelle zeigte diesbezüglich keinen negativen Einfluss der Partikel auf die humanen
Zellen. Diese gut charakterisierten und standardisierten in vitro-Testsysteme machen es
möglich, Medikamentenuntersuchungen an menschlichen Zellen durchzuführen. Hinsichtlich
der histologischen Architektur und funktionellen Eigenschaften der 3D-Modelle konnte eine
hohe in vitro-/in vivo-Korrelation zu menschlichem Gewebe festgestellt werden. Humane
Mucine auf den 3D-Modellen dienten zur Untersuchung der schleimlösenden Wirkung von
ACC-beladenen Partikeln. Standen diese in räumlichem Kontakt zu den Mucinen, wurde deren
Zähigkeit durch das freigesetzte ACC herabgesetzt, was qualitativ mittels histologischen
Methoden bestätigt werden konnte.
Die in dieser Arbeit entwickelten Herstellungsprotokolle dienen als Grundlage und können
für die Synthese ähnlicher Systeme, basierend auf anderen Polymeren und Wirkstoffen,
modifiziert werden. Gelatine und PLGA erwiesen sich als vielseitig einsetzbare Werkstoffe
und bieten eine breite Anwendungsvielfalt in der Regenerativen Medizin, was die erzielten
Resultate bekräftigen.
The aim of the work was the development of thiol-ene cross-linked hydrogels based on functionalized poly(glycidol)s (PG) and hyaluronic acid (HA) for extrusion based 3D bioprinting. Additionally, the functionalization of the synthesized PG with peptides and the suitability of these polymers for physically cross-linked gels were investigated, in a proof of principle study in order to demonstrate the versatile use of PG polymers in hydrogel development.
First, the precursor polymers of the different hydrogel systems were synthesized. For thiol-ene cross-linked hydogels, linear allyl-functionalized PG (P(AGE-co-G)) and three different thiol-(SH-)functionalized polymers, ester-containing PG-SH (PG SHec), ester-free PG-SH (PG-SHef) and HA-SH were synthesized and analysed, The degree of functionalization of these polymers was adjustable.
For physically cross-linked hydrogels, peptide-functionalized PG (P(peptide-co-G)), was synthesized through polymer analogue thiol-ene modification of P(AGE-co-G).
Subsequently, thiol-ene cross-linked hydrogels were prepared with the synthesized thiol- and allyl-functionalized polymers. Depending on the origin of the used polymers, two different systems were obtained: on the one hand synthetic hydrogels consisting of PG-SHec/ef and P(AGE-co-G) and on the other hand hybrid gels, consisting of HA-SH and P(AGE-co-G). In synthetic gels, the degradability of the gels was determined by the applied PG-SH. The use of PG-SHec resulted in hydrolytically degradable hydrogels, whereas the cross-linking with PG-SHef resulted in non-degradable gels.
The physical properties of these different hydrogel systems were determined by swelling, mechanical and diffusion studies and subsequently compared among each other. In swelling studies the differences of degradable and non-degradable synthetic hydrogels as well as the differences of synthetic compared to hybrid hydrogels were demonstrated.
Next, the stiffness and the swelling ratios (SR) of the established hydrogel systems were examined in dependency of different parameters, such as incubation time, polymer concentration and UV irradiation. In general, these measurements revealed the same trends for synthetic and hybrid hydrogels: an increased polymer concentration as well as prolonged UV irradiation led to an increased network density. Moreover, it was demonstrated that the incorporation of additional non-bound HMW HA hampered the hydrogel cross-linking resulting in gels with decreased stiffness and increased SR. This effect was strongly dependent on the amount of additional HMW HA.
The diffusion of different molecular weight fluorescein isothiocyanate-dextran (FITC-dextran) through hybrid hydrogels (with/without HMW HA) gave information about the mesh size of these gels. The smallest FITC-dextran (4 kDa) completely diffused through both hydrogel systems within the first week, whereas only 55 % of 40 kDa and 5-10 % HMW FITC-dextrans (500 kDa and 2 MDa) could diffuse through the networks.
The applicability of synthetic and hybrid hydrogels for cartilage regeneration purpose was investigated through by biological examinations. It was proven that both gels support the survival of embedded human mesenchymal stromal cells (hMSCs) (21/28 d in vitro culture), however, the chondrogenic differentiation was significantly improved in hybrid hydrogels compared to synthetic gels. The addition of non-bound HMW HA resulted in a slightly less distinct chondrogenesis.
Lastly the printability of the established hydrogel systems was examined. Therefore, the viscoelastic properties of the hydrogel solutions were adjusted by incorporation of non-bound HMW HA. Both systems could be successfully printed with high resolution and high shape fidelity.
The introduction of the double printing approach with reinforcing PCL allowed printing of hydrogel solutions with lower viscosities. As a consequence, the amount of additional HMW HA necessary for printing could be reduced allowing successful printing of hybrid hydrogel solutions with embedded cells. It was demonstrated that the integrated cells survived the printing process with high viability measured after 21 d. Moreover, by this reinforcing technique, robust hydrogel-containing constructs were fabricated.
In addition to thiol-ene cross-linked hydrogels, hydrogel cross-linking via ionic interactions was investigated with a hybrid hydrogel based on HMW HA and peptide-functionalized PG. Rheological measurements revealed an increase in the viscosity of a 2 wt.% HMW HA solution by the addition of peptide-functionalized PG. The increase in viscosity could be attributed to the ionic interactions between the positively charge PG and the negatively charge HMW HA.
In conclusion, throughout this thesis thiol-ene chemistry and PG were introduced as promising cross-linking reaction and polymer precursor for the field of biofabrication. Furthermore, the differences of hybrid and synthetic hydrogels as well as chemically and physically cross-linked hydrogels were demonstrated.
Moreover, the double printing approach was demonstrated to be a promising tool for the fabrication of robust hydrogel-containing constructs. It opens the possibility of printing hydrogels that were not printable yet, due to too low viscosities.
Articular cartilage damage caused by sports accidents, trauma or gradual wear and tear can lead to degeneration and the development of osteoarthritis because cartilage tissue has only limited capacity for intrinsic healing. Osteoarthritis causes reduction of mobility and chronic pain and is one of the leading causes of disability in the elderly population. Current clinical treatment options can reduce pain and restore mobility for some time, but the formed repair tissue has mostly inferior functionality compared to healthy articular cartilage and does not last long-term. Articular cartilage tissue engineering is a promising approach for the improvement of the quality of cartilage repair tissue and regeneration. In this thesis, a promising new cell type for articular cartilage tissue engineering, the so-called articular cartilage progenitor cell (ACPC), was investigated for the first time in the two different hydrogels agarose and HA-SH/P(AGE-co-G) in comparison to mesenchymal stromal cells (MSCs). In agarose, ACPCs´ and MSCs´ chondrogenic capacity was investigated under normoxic (21 % oxygen) and hypoxic (2 % oxygen) conditions in monoculture constructs and in zonally layered co-culture constructs with ACPCs in the upper layer and MSCs in the lower layer. In the newly developed hyaluronic acid (HA)-based hydrogel HA-SH/P(AGE-co-G), chondrogenesis of ACPCs and MSCs was also evaluated in monoculture constructs and in zonally layered co-culture constructs like in agarose hydrogel. Additionally, the contribution of the bioactive molecule hyaluronic acid to chondrogenic gene expression of MSCs was investigated in 2D monolayer, 3D pellet and HA-SH hydrogel culture. It was shown that both ACPCs and MSCs could chondrogenically differentiate in agarose and HA-SH/P(AGE-co-G) hydrogels. In agarose hydrogel, ACPCs produced a more articular cartilage-like tissue than MSCs that contained more glycosaminoglycan (GAG), less type I collagen and only little alkaline phosphatase (ALP) activity. Hypoxic conditions did not increase extracellular matrix (ECM) production of ACPCs and MSCs significantly but improved the quality of the neo-cartilage tissue produced by MSCs. The creation of zonal agarose constructs with ACPCs in the upper layer and MSCs in the lower layer led to an ECM production in zonal hydrogels that lay in general in between the ECM production of non-zonal ACPC and MSC hydrogels. Even though zonal co-culture of ACPCs and MSCs did not increase ECM production, the two cell types influenced each other and, for example, modulated the staining intensities of type II and type I collagen in comparison to non-zonal constructs under normoxic and hypoxic conditions. In HA-SH/P(AGE-co-G) hydrogel, MSCs produced more ECM than ACPCs, but the ECM was limited to the pericellular region for both cell types. Zonal HASH/P(AGE-co-G) hydrogels resulted in a native-like zonal distribution of ECM as MSCs in the lower zone produced more ECM than ACPCs in the upper zone. It appeared that chondrogenesis of ACPCs was supported by hydrogels without biological attachment sites such as agarose, and that chondrogenesis of MSCs benefited from hydrogels with biological cues like HA. As HA is an attractive material for cartilage tissue engineering, and the HA-based hydrogel HA-SH/P(AGE-co-G) appeared to be beneficial for MSC chondrogenic differentiation, the contribution of HA to chondrogenic gene expression of MSCs was investigated. An upregulation of chondrogenic gene expression was found in 2D monolayer and 3D pellet culture of MSCs in response to HA supplementation, while gene expression of osteogenic and adipogenic transcription factors was not upregulated. MSCs, encapsulated in a HA-based hydrogel, showed upregulation of gene expression for chondrogenic, osteogenic and adipogenic differentiation markers as well as for stemness markers. In a 3D bioprinting process, using the HA-based hydrogel, gene expression levels of MSCs mostly did not change. Nevertheless, expression of three tested genes (COL2A1, SOX2, CD168) was downregulated in printed in comparison to cast constructs, underscoring the importance of closely monitoring cellular behaviour during and after the printing process. In summary, it was confirmed that ACPCs are a promising cell source for articular cartilage engineering with advantages over MSCs when they were cultured in a suitable hydrogel like agarose. The performance of the cells was strongly dependent on the hydrogel environment they were cultured in. The different chondrogenic performance of ACPCs and MSCs in agarose and HA-SH/P(AGE-co-G) hydrogels highlighted the importance of choosing suitable hydrogels for the different cell types used in articular cartilage tissue engineering. Hydrogels with high polymer content, such as the investigated HA-SH/P(AGE-co-G) hydrogels, can limit ECM distribution to the pericellular area and should be developed further towards less polymer content, leading to more homogenous ECM distribution of the cultured cells. The influence of HA on chondrogenic gene expression and on the balance between differentiation and maintenance of stemness in MSCs was demonstrated. More studies should be performed in the future to further elucidate the signalling functions of HA and the effects of 3D bioprinting in HA-based hydrogels. Taken together, the results of this thesis expand the knowledge in the area of articular cartilage engineering with regard to the rational combination of cell types and hydrogel materials and open up new possible approaches to the regeneration of articular cartilage tissue.
Synthetic bone replacement materials have their application in non-load bearing defects with the function of (re-)construction or substitution of bone. This tissue itself represents a biological composite material based on mineralized collagen fibrils and combines the mechanical strength of the mineral with the ductility of the organic matrix. By mimicking these outstanding properties with polymer-cement-composites, an imitation of bone is feasible. A promising approach for such replacement materials are dual setting systems, which are generated by dissolution-precipitation reaction with cement setting in parallel to polymerization and gelation of the organic phase forming a coherent hydrogel network. Hereby, the high brittleness of the pure inorganic network was shifted to a more ductile and elastic behavior.
The aim of this thesis was focused on the development of different dual setting systems to modify pure calcium phosphate cements’ (CPCs’) mechanical performance by incorporation of a hydrogel matrix.
A dual setting system based on hydroxyapatite (HA) and cross-linked 2-hydroxyethyl methacrylate (HEMA) via radical polymerization was advanced by homogenous incorporation of a degradable cross-linker composed of poly(ethylene glycol) (PEG) as well as poly(lactic acid) (PLA) with reactive terminal methacrylate functionalities (PEG-PLLA-DMA). By integration of this high molecular weight structure in the HEMA-hydrogel network, a significant increase in energy absorption (toughness) under 4-point bending testing was observed. An addition of only 10 wt% hydrogel precursor (referred to the liquid phase) resulted in a duplication of stress over a period of 8 days. Additionally, the calculated elasticity was positively affected and up to six times higher compared to pure HA. With a constantly applied force during compressive strength testing, a deformation and thus strain levels of about 10 % were reached immediately after preparation.
For higher degradability, the system was modified in a second approach regarding organic as well as inorganic phase. The latter component was changed by brushite forming cement that is resorbable in vivo due to solubility processes. This CPC was combined with a hydrogel based on PEG-PLLA-DMA and other dimethacrylated PEGs with different molecular weights and concentrations. Hereby, new reaction conditions were created including a shift to acidic conditions. On this ground, the challenge was to find a new radical initiator system. Suitable candidates were ascorbic acid and hydrogen peroxide. that started the polymerization and successful gelation in this environment. These highly flexible dual set composites showed a very high ductility with an overall low strength compared to HA-based models. After removal of the applied force during compressive strength testing, a complete shape recovery was observed for the samples containing the highest polymeric amount (50 wt%) of PEG-PLLA-DMA.
Regarding phase distribution in the constructs, a homogenously incorporated hydrogel network was demonstrated in a decalcifying study with ethylenediaminetetraacetic acid. Intact, coherent hydrogels remained after dissolution of the inorganic phase via calcium ion complexation.
In a third approach, the synthetic hydrogel matrix of the previously described system was replaced by the natural biopolymer gelatin. Simultaneously to brushite formation, physical as well as chemical cross-linking by the compound genipin was performed in the dual setting materials. Thanks to the incorporation of gelatin, elasticity increased significantly, in which concentrations up to 10.0 w/v% resulted in a certain cohesion of samples after compressive strength testing. They did not dissociate in little pieces but remained intact cuboid specimens though having cracks or fissures. Furthermore, the drug release of two active pharmaceutical ingredients (vancomycin and rifampicin) was investigated over a time frame of 5 weeks. The release exponent was determined according to Korsmeyer-Peppas with n = 0.5 which corresponds to the drug liberation model of Higuchi. A sustained release was observed for the antibiotic vancomycin encapsulated in composites with a gelatin concentration of 10.0 w/v% and a powder-to-liquid ratio of 2.5 g/mL.
With respect to these developments of different dual setting systems, three novel approaches were successfully established by polymerization of monomers and cross-linking of precursors forming an incorporated, homogenous hydrogel matrix in a calcium phosphate network. All studies showed an essential transfer of mechanical performance in direction of flexibility and bendability.
Der Kehlkopf ist ein stimmerzeugendes knorpelhaltiges Organ und spielt eine wichtige Rolle in der Atemfunktion und beim aspirationsfreien Schluckakt. Funktionsstörungen des Kehlkopfs wie Stimmbandlähmungen werden durch Schädigungen des Kehlkopfnervs nach operativen Eingriffen und Halsverletzungen hervorgerufen. Des Weiteren führen durch Traumen, Teil- und komplette Resektionen verursachte Substanzdefekte des Kehlkopfs zu Funktionsverlusten. Die hierfür notwendigen und komplexen Rekonstruktionen werden durch das schlechte Regenerationspotential von Knorpelgewebe eingeschränkt und können nur bedingt durch synthetische Ersatzmaterialen oder körpereigenes Ersatzgewebe bewerkstelligt werden. Ist es möglich, mit Hilfe des Tissue Engineerings aus körpereigenen Stammzellen und biokompatiblen Trägermaterialien implantierbares Knorpelersatzgewebe herzustellen, welches zur dauerhaften Wiederherstellung der Kehlkopffunktionen eingesetzt werden kann? Die zusätzliche Markierung von Stammzellen mit superparamagnetischen Eisenoxidnanopartikeln (VSOP) als Zellmarker bietet die Möglichkeit der Detektion und der Verfolgung der Zellen mittels nicht-invasiver Nachweismethoden nach deren Implantation. Ist die Verwendung dieser Nanopartikel ohne negative Folgen für die Stammzellen möglich und sind diese für den Einsatz in der Laryngologie geeignet?
Fettgewebsstammzellen (ASC) wurden aus humanem Liposuktionsmaterial und Kaninchen-Nackenfett isoliert und expandiert. Die Zellen wurden in Hydrogelkombinationen aus Kollagen Typ-I, Agarose, Fibrin und Hyaluronsäure eingebettet und mit den chondrogenen Wachstumsfaktoren TGF-β3, BMP-6 und IGF-I über 14 Tage differenziert. Anschließend wurden diese Zell-Hydrogelkonstrukte bezüglich Morphologie, extrazellulärer Matrixanreicherung und knorpelspezifischer Genexpression histologisch, immunhistochemisch und molekularbiologisch analysiert. In einem weiteren Schritt wurden die Integration der Zell-Hydrogelkonstrukte in natives Knorpelgewebe sowie die Defektdeckung in einem in vitro- und einem in vivo-Knorpeldefektmodell mit vor- und nicht-vordifferenzierten Zell-Hydrogelkonstrukten untersucht. Die Analyse möglicher zyto- und genotoxischer Effekte von VSOP sowie des Einflusses der Markierung von ASC mit VSOP auf die Proliferation, Migration und das Multidifferenzierungspotential erfolgte nach der Markierung der Zellen mit unterschiedlichen VSOP-Konzentrationen. Außerdem wurden VSOP-markierte ASC in Kaninchenstimmlippen injiziert und die Nachweisbarkeit dieser Zellen im Injektionsareal histologisch und mittels Magnetresonanztomographie (MRT) untersucht.
Nach 14-tägiger chondrogener Differenzierung wurde in den Zell-Hydrogelkonstrukten eine knorpelähnliche Morphologie, die Anreicherung knorpelspezifischer Matrixproteine und die Expression chondrogener Markergene nachgewiesen. Die Kombination der chondrogenen Wachstumsfaktoren zeigte keinen verstärkenden Einfluss auf die Chondrogenese von ASC. Hydrogele aus Kollagen Typ I und Hyaluronsäure wiesen die stärkste extrazelluläre Matrixanreicherung auf. Bei den agarosefreien Hydrogelen war eine ausgeprägte Gelschrumpfung auffällig. In den beiden Knorpeldefektmodellen konnte weder eine Integration der Zell-Hydrogelkonstrukte in den Nativknorpel noch eine vollständige Defektdeckung nachgewiesen werden. Nach der Markierung von ASC mit VSOP zeigte sich bei der höchsten Konzentration von 1,5 mM eine genotoxische Wirkung. Zytotoxische Effekte sowie Einflüsse der Markierung auf die Proliferation, Migration und das Multidifferenzierungspotential von ASC waren nicht nachweisbar. VSOP-markierte ASC konnten nach deren Injektion in Kaninchenstimmlippen im Injektionsareal nur vereinzelt mittels MRT und histologisch nachgewiesen werden.
Es ist möglich, mit Hilfe des Tissue Engineerings aus körpereigenen Stammzellen und biokompatiblen Trägermaterialien implantierbares knorpelähnliches Gewebe herzustellen. Dabei begünstigen agarosefreie Trägermaterialien die chondrogene Differenzierung von ASC. Diese könnte durch die jeweilige Erhöhung der Zelldichte und Wachstumsfaktorkonzentrationen sowie die Verlängerung der Induktionszeit verstärkt werden. Eine mögliche klinische Anwendung dieser knorpelähnlichen Gewebe in der Laryngologie ist jedoch durch deren Schrumpfung wie auch mangelnde Integration und Defektdeckung noch weit entfernt. Aufgrund ihrer genotoxischen Wirkung kann eine Verwendung von VSOP als Zellmarker auch unterhalb von 1,5 mM ohne negative Folgen für den Organismus nicht sicher ausgeschlossen werden. Der inhomogene Gewebekontrast im Kehlkopf, die schlechte Auflösung im MRT und die geringe Größe von VSOP erschweren die Nachweisbarkeit und Verfolgung markierter Zellen mittels MRT. Daher sind andere nicht-invasive Nachweismethoden für die Verwendung von VSOP im Kehlkopf zu evaluieren. Der möglichen Anwendung dieser knorpelähnlichen Gewebe und VSOP in der rekonstruktiven Laryngologie muss eine erfolgreiche Optimierung und ausführliche positive Validierung in klinischen Tests vorausgehen.
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Für die Rekonstruktion von Gelenkknorpeldefekten des Kniegelenkes in Folge eines Traumas oder einer Osteochondrosis dissecans (OD) stehen verschiedene operative Verfahren zur Verfügung. Die Autologe Chondrozytentransplantation (ACT) hat sich als zuverlässiges Rekonstruktionsverfahren erwiesen. In der vorliegenden Arbeit wurde eine prospektive Fallseriestudie für eine neue Form der ACT mit einem Kollagen I Hydrogel (CaReS-Technologie) durchgeführt. Die Vorteile der Technologie liegen zum Einen darin, dass sich die Zellen homogen im Gel verteilen und zum Anderen, dass die Zellen unmittelbar nach dem Herauslösen aus dem Gelenkknorpel in das Gel eingebracht werden und dadurch eine geringere Dedifferenzierung der Chondrozyten stattfindet. Von März 2003 bis Ende 2006 wurden 29 Patienten in die Studie eingeschlossen. Die Ein- und Ausschlusskriterien erfüllten die Kriterien der Arbeitsgruppe ACT und Tissue Engineering der Deutschen Gesellschaft für Orthopädie und Unfallchirurgie. Die Eingangs- und Nachuntersuchungsbögen wurden an die IKDC Form 2000 angelehnt. Insgesamt zeigte sich ein signifikanter Anstieg des IKDC Scores im mittleren follow-up von 30,7 Monaten von 47,3 auf 74,9 bei den 29 Patienten. Bei Aufschlüsselung der Patienten bzgl. Diagnose, Defektgröße, Lokalisation und Defektanzahl zeigte sich bei den Behandlungsgruppen OD, Trauma/degenerativ, > 4 cm2, mediale Femurkondyle und Einzeldefekte eine signifikante Zunahme des IKDC Scores im zeitlichen Verlauf. Der postoperative Schmerz zeigte einhergehend mit dem Anstieg des IKDC Scores eine signifikante Abnahme der Schmerzintensität in den Behandlungsgruppen OD, Trauma/degenerativ, > 4 cm2, mediale Femurkondyle und Einzeldefekte. Nachgewiesen wurde ebenfalls ein Anstieg des SF36 Scores, der den gegenwärtigen Gesundheitszustand sowohl körperlich als auch psychisch beurteilt. Zusammen mit einer globalen Patientenzufriedenheit von 80% und einem IKDC Funktionsstatus von I und II bei 77% der Patienten spiegeln die gewonnenen Daten die Ergebnisse der klassischen ACT bzw. anderer matrixgekoppelten Verfahren wieder. Die CaReS-Technologie stellt somit ein gleichwertiges Verfahren zu den bisher auf dem Markt befindlichen Techniken der ACT dar.