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Das Secosterid Vitamin D3 wird durch die Nahrung aufgenommen oder im Organismus synthetisiert, wobei eine Reaktion in der Haut durch einen photochemischen Prozess katalysiert wird.Durch zwei Hydroxylierungsschritte in Leber und Niere wird Vitamin D3 über 25(OH) Vitamin D3 zum aktiven 1,25(OH)2 Vitamin D3-Hormon. 1,25(OH)2 Vitamin D3 hat eine wichtige Funktion im Knochenstoffwechsel, es reguliert die Ca2+-Resorption im Dünndarm. Die 1,25(OH)2 Vitamin D3-Synthese in der Niere wird durch Parathormon (PTH) kontrolliert. Ist die Serum Ca2+-Konzentration niedrig, wird PTH ausgeschüttet und die 1a-Hydroxylase, das 25(OH) Vitamin D3-aktivierende Enzym, stimuliert. Das Prinzip der (Seco)steroid-Aktivierung und -Inaktivierung in glandulären Organen, wie Leber und Niere mit anschließender Freisetzung der aktiven Hormone und Transport zu den jeweiligen Zielgeweben gilt heute nicht mehr uneingeschränkt. Auch Einzelzellen sind in der Lage Steroid-modifizierende Enzyme, die Hydroxylasen und Dehydrogenasen, zu exprimieren. Monozytäre Zellen exprimieren das 1,25(OH)2 Vitamin D3-aktivierende und das -inaktivierende Enzym, die 1a-Hydroxylase und die 24-Hydroxylase. Sie sind somit in der Lage, 1,25(OH)2 Vitamin D3 zu sezernieren, welches parakrin auf Nachbarzellen wirken kann. In diesem Zusammenhang wurde die Expression und Regulation der 1a-Hydroxylase in peripheren Blutmonozyten (PBM) und monozytären THP1-Zellen untersucht. Durch Supplementation der Zellen mit dem Substrat 25(OH) Vitamin D3 konnte die Produktion an aktivem 1,25(OH)2 Vitamin D3-Hormon in PBM signifikant gesteigert werden. In PBM konnte im Gegensatz zum systemischen Ca2+-Stoffwechsel nur ein geringer Einfluss auf die 1a-Hydroxylase-Aktivität beobachtet werden. Durch RT-PCR-Amplifikation konnte eine Expression des PTH Rezeptors Typ 1 (PTHR1) in PBM und Dendritischen Zellen nachgewiesen werden. Ein weiterer Ligand des PTHR1 ist PTH related Protein (PTHrP), ein Faktor der die Tumorhyperkalzämie propagiert. Durch Markierungsexperimente mit fluoreszenz-markiertem PTHrP konnte gezeigt werden, dass PTHrP an die Zellmembran von PBM und Dendritischen Zellen bindet und in den Zellkern von Dendritischen Zellen transportiert wird. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Expression 1,25(OH)2 Vitamin D3-responsive Gene in Monozyten/Makrophagen untersucht. Die Expression der 24-Hydroxylase wird innerhalb der Differenzierung von myeloischen THP1-Zellen zu Makrophagen- bzw. Osteoklasten-ähnlichen Zellen transient induziert. Als weiteres 1,25(OH)2 Vitamin D3-responsives Gen wurde die Expression von Osteopontin (OPN) untersucht. OPN ist ein vor allem in Knochen vorkommendes Matrixprotein, das wesentlich an der Zelladhäsion beteiligt ist. OPN wird in THP1-Zellen im Zuge der Differenzierung zunehmend exprimiert. Durch immunhistochemische Untersuchungen konnte OPN in Granulomen von Morbus Crohn- und Leberschnitten detektiert werden. Es spielt hier eine wesentliche Rolle bei der Granulomentstehung. Die Thioredoxin Reduktase 1 (TR1) ist ein Selenoenzym, welches maßgeblich an der Reduktion von Disulfidbindungen in Proteinen beteiligt ist. Es moduliert Protein/Protein- und Protein/DNA-Interaktionen wie die Bindung der Transkriptionsfaktoren AP1 und NFkB an DNA-responsive Elemente. Die Expression der TR1 wird in THP1-Zellen im Rahmen der Differenzierung induziert und ist in differenzierten Zellen maximal. Aktivitätsmessungen deckten sich mit dieser Beobachtung. In peripheren Blutmonozyten steigt die TR-Aktivität alleine durch Adhäsion der Zellen an das Kulturgefäß und nach Behandlung mit 1,25(OH)2 Vitamin D3. Die Untersuchungen der vorliegenden Arbeit zeigten eine Abhängigkeit der TR-Aktivität vom Differenzierungsgrad der Zellen und der Supplementation des Mediums mit dem Spurenelement Selen. Die Expression weiterer Selenoproteine in monozytären Zellen wurde nachgewiesen. So konnten durch 75Selenit-Markierungsexperimente neun Selenoproteine in THP1-Zellen detektiert werden, von denen fünf sezerniert werden. Ein weiteres, in monozytären Zellen charakterisiertes Selenoprotein ist die zelluläre Glutathionperoxidase. Ihre Aktivität konnte in Selenit-supplementierten Zellen um das 70fache gesteigert werden. Die Kultivierung monozytärer Zellen unter Selenit-Supplementation beeinflusst die Funktion dieser Zellen wesentlich. So konnte beobachtet werden, dass die Anzahl an phagozytierenden, zu Makrophagen differenzierten THP1-Zellen nach Selenit-Supplementation abnahm, während die Phagozytoserate der einzelnen Zellen anstieg. Die erzielten Ergebnisse zeigen, dass monozytäre Zellen mit Komponenten des 1,25(OH)2 Vitamin D3 Stoffwechsels ausgestattet sind und aktives 1,25(OH)2 Vitamin D3-Hormon produzieren, sezernieren und inaktivieren können. Die lokale Kontrolle der 1,25(OH)2 Vitamin D3 Stoffwechsels ausgestattet sind und aktives 1,25(OH)2 Vitamin D3-responsiver Gene, wie die Expression des Selenoproteins TR1, das einen direkten Einfluss auf den Redoxstatus und den Abbau reaktiver Sauerstoffverbindungen in diesen und Nachbarzellen ausübt.
Die vorliegende Arbeit präsentiert neue Erkenntnisse zur Biosynthese von 2,5-Dimethyl-4-hydroxy-3(2H)-furanon (DMHF) und 2,5-Dimethyl-4-methoxy-3(2H)-furanon (DMMF), zwei wichtigen Aromakomponenten in Erdbeeren. Potentielle, mit stabilen Isotopen markierte Vorläufersubstanzen wurden an Erdbeeren appliziert und drei Tage bei Raumtemperatur inkubiert. Der Nachweis über den erfolgreichen Einbau erfolgte mittels Gaschromatographie-Massenspektrometrie. Anhand der Massenspektren von DMHF und DMMF, die aus den behandelten Erdbeeren mittels Festphasenextraktion isoliert wurden, konnte der Markierungsgrad der Verbindungen ermittelt werden und somit Rückschlüsse über die Effizienz der Metabolisierung der applizierten Zucker zu den beiden Furanonen DMHF und DMMF gezogen werden. Als mögliche Ausgangsstoffe dienten unterschiedlich markierte D-Glucose und D-Fructose, sowie Desoxyzucker, da diese als direkte Vorläufersubstanzen von DMHF und DMMF diskutiert werden. Isotopenmarkierte Desoxy-D-glucose oder Desoxy-D-fructose sind kommerziell nicht erhältlich, weshalb die Verbindungen [1-13C]-1-Desoxy-D-fructose, [6-2H1]-6-Desoxy-D-glucose und [5,6,6,6-2H4]-6-Desoxyhexulose-1-phosphat zuerst synthetisiert werden mussten. Nach Applikation der Desoxyzucker wurde keine Erhöhung des Markierungsgrades an stabilen Isotopen gegenüber dem natürlichen Isotopenverhältnis festgestellt. Somit können 6-Desoxy-D-glucose, 1-Desoxy-D-fructose und 6-Desoxy-D-fructose-1-phosphat als Prekursoren von DMHF und DMMF ausgeschlossen werden. Als gute Vorläufersubstanzen erwiesen sich D-Glucose und D-Fructose. Markierungen (13C und 2H) an Position C-1 oder C-6 der beiden Verbindungen wurden sowohl in DMHF als auch in dessen Methoxyderivat DMMF detektiert, wobei die Applikation von D-Fructose im Gegensatz zur D-Glucose einen höheren Markierungsgrad der Zielverbindungen zur Folge hatte. Durch den Einsatz positionsspezifisch markierter D-Glucose (2H-Markierung an Position C-1, C-2 oder C-4) sollten Aufschlüsse über den Metabolisierungsmechanismus gewonnen werden. Die Markierung der D-[2-2H]Glucose befand sich wie die der D-[1-2H]Glucose in den Methylgruppen der Furanone, was nur durch eine intramolekulare Verschiebung von C-2 nach C-1 erklärbar ist. Diese wurde bei der Glucosephosphatisomerase-katalysierten Umwandlung von D-Glucose-6-phosphat zu D-Fructose-6-phosphat beobachtet. Somit muss D-Glucose bei der Biosynthese von DMHF und DMMF zuerst in diese Intermediate überführt werden. Im Gegensatz zu an Position C-2 markierter D-Glucose ging das Proton an Position C-4 im Laufe der Metabolisierung verloren. Demzufolge findet der in der Natur verbreitete Desoxygenierungsmechanismus von Monosacchariden nicht statt und schließt die Beteiligung von Desoxyzuckern an der Biosynthese von DMHF und DMMF gänzlich aus. Nach Einsatz von uniform markierter D-Fructose konnte sechsfach markiertes DMHF und DMMF identifiziert werden, was durch den Einbau der intakten Kohlenstoffkette zu erklären ist. Dieser Befund und weitere Untersuchungen mit verschiedenen Glykolyse-regulierenden Substanzen deuteten darauf hin, dass die Furanone dem zentralen Kohlenhydratstoffwechsel, der Glykolyse, entspringen. Vor der Aldolase-katalysierten Spaltung in zwei C3-Einheiten muss jedoch eine Abzweigung erfolgen, da sonst die Kohlenstoffkette nicht unverändert vorliegen könnte. Im zweiten Teil der Arbeit ist erstmals mit Hilfe von molekularbiologischen Techniken die vollständige cDNA einer O-Methyltransferase (OMT) aus Erdbeeren isoliert worden. Hierfür wurde mRNA aus reifenden Erdbeeren extrahiert und eine cDNA Bibliothek hergestellt. Diese wurde mit einer OMT-spezifschen Sonde durchmustert, welche durch PCR mit degenerierten Primern synthetisiert worden war. Nach mehreren Vereinzelungs-Zyklen konnte die vollständige cDNA einer O-Methyltransferase (STOMT, Strawberry OMT) erhalten werden. Northern-Analysen ergaben, dass die entsprechende RNA ausschließlich in den verschiedenen Reifestadien der Frucht akkumuliert, mit den höchsten Transkriptmengen in der rot-werdenden und reifen Frucht. In anderen Gewebeteilen wie Wurzel, Blätter, Stängel und Blüte konnte keine STOMT-RNA nachgewiesen werden. Das korrespondierende Protein zeigte hohe Homologien zu Kaffeesäure-OMTs aus Weidengewächsen der Gattung Populus. Nach erfolgreicher, heterologer Expression von STOMT in E. coli wurde die Substratspezifität des Enzyms untersucht, dessen Temperaturoptimum bei 30°C lag. Alle eingesetzten Substrate mit phenolischem Grundgerüst, wie Brenzcatechin, Kaffeesäure, Kaffeeoyl-CoA und 3,4-Dihydroxybenzaldehyd, aber auch das Furanonderivat DMHF wurden von der rekombinanten O-Methyltransferase umgesetzt. Als bestes Substrat erwies sich 3,4-Dihydroxybenzaldehyd, das, im Gegensatz zu dessen Methylierungsprodukt Vanillin, bisher in Erdbeeren nicht nachgewiesen werden konnte. Kaffeesäure wurde ebenfalls effektiv methyliert, worin vermutlich die Hauptaufgabe von STOMT in der Pflanze liegt. Die Methylierung von Kaffeesäure oder 5-Hydroxyferulasäure ist ein wichtiger Prozess in der Entstehung von Lignin. Die Tatsache, dass Erdbeeren teilweise in den Leitbündeln und verstärkt in den Achenen lignifiziert sind, erklärt das Vorhandensein eines solchen Enzyms. DMHF, das als Dienol-Tautomer eine aromatische Struktur mit Hydroxylgruppen aufweist und somit strukturelle Ähnlichkeiten zu phenolischen Verbindungen zeigt, wurde ebenfalls von STOMT als Substrat akzeptiert. Die Bildung von DMMF, dem Methoxyderivat von DMHF erfolgte vergleichsweise langsam, war aber eindeutig auf die Methyltransferase-Aktivität zurückzuführen. STOMT ist aufgrund des Expressionsmusters als fruchtspezifisch und reifeinduziert einzustufen. Primäre Funktion ist vermutlich zu Beginn der Fruchtreifung die Lignifizierung der Leitbündel und später die der Achenen. Gleichzeitig scheint STOMT wesentlich an der Bildung der Aromastoffe DMMF und Vanillin in Erdbeeren beteiligt zu sein.
Aufgrund seiner potentiell gesundheitsfoerdernden Wirkung wurde das Falvonol Quercetin in den letzten Jahren intensiv untersucht. Daten zur Bioverfuegbarkeit nach oraler Applikation sind jedoch selten und widerspruechlich. Fruehere Untersuchungen deuteten darauf hin, dass die Disposition von Quercetin von der Zuckerkomponente des Glykosids oder der Pflanzenmatrix abhaengen koennte. Um den Einfluss der Zuckerkomponente oder der Matrix auf die Resorption von Quercetin festzustellen, wurden zwei isolierte Quercetinglykoside sowie zwei Pflanzenextrakte in einer vierarmigen, randomisierten cross-over Studie an 12 gesunden Probanden getestet. Jeder Proband erhielt eine Zwiebelzubereitung oder Quercetin-4'-O-glucosid, jeweils entsprechend 100 mg Quercetinaglykon, sowie Quercetin-3-O-rutinosid oder Buchweizenkrauttee entsprechend 200 mg Quercetinaglykon. Die Proben wurden mittels HPLC und Coulometrischer Arraydetektion analysiert. Im Plasma wurden ausschliesslich Quercetinglucuronide detektiert. Freies Quercetin und die Glykoside waren nicht nachweisbar. Die Bioverfuegbarkeit und Pharmakokinetik nach Applikation von Zwiebeln und Quercetin-4'-glucosid zeigte keine signifikanten Unterschiede. Maximale Plasmakonzentrationen von 2.3±1.5 µg·mL-1 and 2.1±1.6 µg·mL-1 (MW±SD) wurden nach 0.7±0.2 h und 0.7±0.3 h erreicht. Nach Einnahme von Buchweizenkraut und Rutin wurden maximale Plasmakonzentrationen (trotz der doppelten Dosis) von nur 0.6±0.7 µg·mL-1 und 0.3±0.3 µg·mL-1 nach 4.3±1.8 h bzw. 7.0±2.9 h erreicht. Die terminale Halbwertszeit lag bei ca. 11 h fuer alle vier Pruefpraeparate. Die Disposition von Quercetin ist daher primaer von der Zuckerkomponente abhaengig. Zu einem geringern Anteil beeinflusst die Pflanzenmatrix im Falle von Buchweizenkrauttee sowohl Geschwindigkeit als auch Ausmass der Resorption. Der Resorptionsort scheint fuer Quercetin-4‘-O-glucoside und Quercetin-3-O-rutinoside unterschiedlich zu sein. Die bedeutung spezifischer carrier fuer die Resorption von Quercetinglykosiden sowie von intestinalen ß-Glucosidasen muss in weiteren Untersuchungen geklaert werden.
Das erste Ziel der vorliegenden Arbeit war, ein Modell zu etablieren, mit dessen Hilfe Interaktionen zwischen Flavonoiden und Dickdarmbakterien schnell und zuverlaessig erfasst werden koennen, ohne hierzu aufwendige Humanstudien einzusetzen. Zu diesem Zweck wurde Schweine-Caecum eingesetzt; Mensch und Schwein weisen eine grosse Aehnlichkeit hinsichtlich der Anatomie und Physiologie des Gastrointestinaltraktes auf. In einer speziell entwickelten Anaerobenkammer erfolgte unter anoxischen Bedingungen die Inkubation von Modellverbindungen wie Quercetin (3,5,7,3',4'-Pentahydroxyflavon), ein hinsichtlich seiner Metabolisierung schon ausfuehrlich untersuchtes Flavonol, Chrysin (5,7-Dihydroxyflavon), Naringenin (5,7,4'-Trihydroxyflavanon) und Hesperetin (5,7,3'-Trihydroxy-4'-methoxyflavanon) mit dem Caecum-Inhalt. Die Identifizierung und Strukturaufklaerung der im Zeitraum von 24 h gebildeten Metabolite erfolgte mittels Hochleistungs-fluessigchromatographie-Diodenarray-Detektion (HPLC-DAD), HPLC-Elektrospray-Ionisierung-Tandemmassenspekrometrie (ESI-MS/MS) und Kapillargaschromatographie-Massenspektrometrie (HRGC-MS). Unter den gewaehlten experimentellen Bedingungen wandelte die Schweine-Caecum-Mikroflora Quercetin in Phloroglucin, 3,4-Dihydroxyphenylessigsaeure und 3,4-Dihydroxytoluol um. Das Flavon Chrysin wurde hingegen nicht abgebaut. Naringenin wurde zu 3-(4-Hydroxyphenyl)-propionsaeure und 3-Phenylpropionsaeure metabolisiert; aus Hesperetin entstanden via Eriodictyol Phloroglucin und 3-(3-Hydroxyphenyl)-propionsaeure. Der mittels HPLC-DAD-Analytik untersuchte zeitliche Verlauf des mikrobiellen Abbaus von Quercetin, Naringenin und Hesperetin zeigte einen langsamen Abbau von Naringenin im Gegensatz zur schnellen Metabolisierung von Quercetin und Hesperetin. Die erhaltenen Resultate stimmten mit Literaturergebnissen sehr gut ueberein und belegten somit die Anwendbarkeit von Schweine-Caecum als geeignetes ex-vivo-Modell zur Untersuchung des intestinalen Metabolismus von Flavonoiden. Mit dem entwickelten Modell wurde in weiteren Studien die Biotransformation ausgewaehlter Flavonoide im Dickdarm simuliert. Neben Ringspaltungen, Hydrolyse, Demethylierungs- und Dehydroxylierungsreaktionen entstanden bevorzugt aromatische Carbonsaeuren. So wurde beispielhaft das erstmals auf seine intestinale Metabolisierung untersuchte Hispidulin (5,7,4'-Trihydroxy-6-methoxyflavon) – ein hoch wirksamer Benzodiazepinrezeptor-Ligand – durch die Schweine-Caecum-Mikroflora rasch zu Scutellarein O-demethyliert, welches dann langsam zu 3-(4-Hydroxyphenyl)-propionsaeure weiter abgebaut wurde. Anhand der beobachteten Abbaukinetik ergab sich der Hinweis, dass Flavonoide in Abhaengigkeit von ihrem jeweiligen Substitutionsmuster unterschiedlich schnell von den Darmbakterien umgesetzt werden. Da auch Ausmass und Geschwindigkeit des Abbaus von Flavonoiden deren Bioverfuegbarkeit beeinflussen, war es ein weiteres Ziel dieser Arbeit zu ueberpruefen, inwieweit ein Zusammenhang zwischen Hydroxylierungsgrad des B-Ringes von Flavonoiden und deren mikrobiellen Abbaurate besteht. Hierzu wurden Flavonole, d.h. Galangin (3,5,7-Trihydroxyflavon), Kaempferol (3,5,7,4'-Tetrahydroxyflavon) und erneut Quercetin sowie Flavone, d.h. Chrysin, Apigenin (5,7,4'-Trihydroxyflavon) und Luteolin (5,7,3',4'-Tetrahydroxyflavon), die sich jeweils lediglich im Hydroxylierungsgrad des B-Ringes unterscheiden, ausgewaehlt und als Substrate (in jeweils gleicher Konzentration) fuer die Umsetzung durch Schweine-Caecum-Mikroflora gleicher Donoren eingesetzt. Der mikrobielle Abbau wurde ueber einen Zeitraum von 24 Stunden mittels HPLC-DAD-Analysen verfolgt. Ein Vergleich der mikrobiellen Umsetzungsraten der geprueften Flavonole und Flavone liess den Schluss zu, dass unabhaengig von der Flavonoid-Unterklasse eine Hydroxylierung in Position C-4' des B-Ringes den Abbau von Flavonoiden foerdert (bei den Flavonen sogar erst ermoeglicht) und dass eine zusaetzliche Hydroxylierung des B-Ringes keinerlei Einfluss auf den Abbau hat. Die Ergebnisse dieser Studie lassen weiterhin vermuten, dass die Hydroxylierung in Position C-3 des C-Ringes eine foerdernde Rolle im Abbau von Flavonoiden durch caecale Mikroflora spielt. Im Rahmen dieser Arbeit erfolgten ferner Untersuchungen zur Interaktion von Flavonoiden mit alpha-Glucosidase aus Schweine-Caecum. Als potentielle Hemmstoffe kamen die Flavone Scutellarein, Baicalein und Luteolin zur Verwendung; als Substrate wurden p-Nitrophenyl-alpha-D-glucopyranosid und Saccharose eingesetzt. Fuer keines der eingesetzten Flavonoide war ein Einfluss auf die Aktivitaet der alpha-Glucosidase festzustellen. Diese Ergebnisse weisen auf strukturelle Unterschiede zwischen bakteriellen alpha-Glucosidasen und solchen aus dem Duenndarm der Saeugetiere hin, bei denen fuer u. a. Scutellarein und Baicalein hohe alpha-Glucosidase-Inhibitor-Aktivitaet beschrieben worden ist.
Im gleichen Maße wie informatisches Wissen mehr und mehr in den wissenschaftlichen Alltag aller Lebenswissenschaften Einzug gehalten hat, hat sich der Schwerpunkt bioinformatischer Forschung in stärker mathematisch und informatisch-orientierte Themengebiete verschoben. Bioinformatik heute ist mehr als die computergestützte Verarbeitung großer Mengen an biologischen Daten, sondern hat einen entscheidenden Fokus auf der Modellierung komplexer biologischer Systeme. Zur Anwendung kommen hierbei insbesondere Theorien aus dem Bereich der Stochastik und Statistik, des maschinellen Lernens und der theoretischen Informatik. In der vorliegenden Dissertation beschreibe ich in Fallstudien die systematische Modellierung biologischer Systeme aus einem informatisch - mathematischen Standpunkt unter Anwendung von Verfahren aus den genannten Teilbereichen und auf unterschiedlichen Ebenen biologischer Abstraktion. Ausgehend von der Sequenzinformation über Transkriptom, Metabolom und deren regulatorischer Interaktion hin zur Modellierung von Populationseffekten werden hierbei aktuelle biologische Fragestellungen mit mathematisch - informatischen Modellen und einer Vielzahl experimenteller Daten kombiniert. Ein besonderer Augenmerk liegt dabei auf dem Vorgang der Modellierung und des Modellbegriffs als solchem im Rahmen moderner bioinformatischer Forschung. Im Detail umfassen die Projekte (mehrere Publikationen) die Entwicklung eines neuen Ansatzes zur Einbettung und Visualisierung von Multiplen Sequenz- und Sequenz-Strukturalignments, illustriert am Beispiel eines Hemagglutininalignments unterschiedlicher H5N1 Varianten, sowie die Modellierung des Transkriptoms von A. thaliana, bei welchem mit Hilfe einer kernelisierten nicht-parametrischen Metaanalyse neue, an der Infektionsabwehr beteiligten, Gene ausfindig gemacht werden konnten. Desweiteren ist uns mit Hilfe unserer Software YANAsquare eine detaillierte Untersuchung des Metabolismus von L. monocytogenes unter Aktivierung des Transkriptionsfaktors prfA gelungen, dessen Vorhersagen durch experimentelle 13C Isotopologstudien belegt werden konnten. In einem Anschlußprojekt war der Zusammenhang zwischen Regulation des Metabolismus durch Regulation der Genexpression und der Fluxverteilung des metabolischen Steady- State-Netzwerks das Ziel. Die Modellierung eines komplexen organismischen Phänotyps, der Zellgrößenentwicklung der Diatomee Pseudo-nitzschia delicatissima, schließt die Untersuchungen ab.
Identifizierung und Strukturaufklärung von Anthocyanen und ihrer Metabolite erfolgten mit Hilfe der mittels Hochleistungsflüssigchromatographie-Diodenarray-Detektion-Elektro-spray-Tan¬dem¬massen¬spektrometrie (HPLC-DAD-ESI-MS/MS). Quantitative Analysen wurden via HPLC-DAD durchgeführt. Die hierzu erforderlichen Referenzverbindungen wurden mittels präparativer HPLC aus Heidelbeeren isoliert (Reinheit zwischen 85,8% und 99,4%). Der Gehalt an Anthocyanen in den untersuchten Heidelbeerfrüchten lag bei 6 g/kg. Bezüglich der mengen¬mäßigen Verteilung dominierten Delphinidin- und Cyanidin¬glykoside vor den Glykosiden von Malvidin, Petunidin und Peonidin. Als konjugierte Zucker¬reste kamen vor allem Glukose und Galaktose vor, der Gehalt an Arabinosiden war weit geringer. Bei oraler Aufnahme erfolgt ein erster Kontakt der Anthocyane mit Speichel. Daher wurde dessen Wirkung auf die Heidelbeeranthocyane in ex vivo-Studien über einen (unphysio-logisch langen) Zeitraum von bis zu 30 Minuten untersucht. Dabei konnte wurde ins-besondere der Einfluß des pH-Wertes auf die Stabilität der Anthocyane aufgezeigt werden. Zur Simulation des Verhaltens von Anthocyanen im Magen wurden die einzelnen Heidelbeeranthocyane mit künstlichem Magensaft (pH 1,81) über vier Stunden inkubiert. Hier erwiesen sich alle untersuchten Verbindungen als stabil. Die anschließend von uns mit simuliertem Duodenalsekret (pH 7,2) über einen Zeitraum von 24 Stunden durchgeführten Studien zeigten, dass die Anthocyane unterschiedlich starken Modifizierungen unterlagen. Unter den schwach alkalischen Bedingungen wurden vor allem die Glykoside des Delphinidins schnell abgebaut, aber auch die übrigen Anthocyane erwiesen sich unter diesen Bedingungen als nicht stabil; nach 24 h war kein Anthocyan mehr nachweisbar. Um die Metabolisierungsvorgänge der Anthocyane im Dünn- und Dickdarm zu untersuchen, wurden ex vivo-Inkubationen jeweils mit frischem Ileo- bzw. Kolo¬stoma-beutel¬inhalt durchgeführt. Während die Abbaugeschwindigkeit in der ilealen Flüssigkeit vor allem von der pH-Stabilität des Aglykons abhänig war, konnten im Dickdarm einzig die Arabinoside nach einer Stunde noch alle in geringen Konzentrationen identifiziert werden. Die meisten Glukoside und Galaktoside waren zu diesem Zeitpunkt schon vollständig abgebaut. Da im Darm von einer hydrolytischen Spaltung der Anthocyane in Anthocyanidin und Zucker ausgegangen wird, wurde die Metabolisierung von Anthocyanidinen unter physio-logischen pH-Bedingungen untersucht. Neben der jeweiligen Spaltung in das Benzoe¬säure-derivat des B-Ringes sowie Phloroglucinessigsäure traten verschiedene Poly¬merisierungs¬-produkte auf, deren Strukturen nicht aufgeklärt werden konnten. In einer weiteren Versuchsreihe wurde die renale Ausscheidung von Anthocyanen bei Ileostomieprobanden nach oraler Applikation von 300 g Heidelbeeren über einen Zeitraum von acht Stunden untersucht. Es zeigte sich, dass ein Stoma des terminalen Ileums keinen Einfluss auf die Absorption und Metabolisierung der Anthocyane hatte. Die Bilanzierung der Anthocyane im Urin erfolgte als Äquvalente von Malvidin-3-O-glukosid, da nicht alle Anthocyanmetabolite zur Verfügung standen. Der Zeitpunkt der maximalen renalen Anthocyanausscheidung sowie die Menge der ausgeschiedenen Anthocyane waren starken interindividuellen Schwankungen unterworfen. Das Aus¬sscheidungs¬maximum (tmax) lag zwischen 0,5 und zwei Stunden. Bei der ausge¬schiedenen Menge wurden Werte zwischen 0,007% und 0.019% der auf¬ge¬nommenen Anthocyane ermittelt. Aufgrund der literaturbekannten Unterschiede zwischen den in Serum und Urin gefunden Anthocyanmengen ist davon auszugehen, dass es nach Anthocyanverzehr zu Inter-aktionen mit Proteinen in Blut oder Geweben kommt. Mittels Blutfraktionierung wurde das humane Serumalbumin (HSA) als wichtigster Bindungspartner der Anthocyane im Blut identifiziert. Anhand spektroskopischer Methoden war es möglich, die Bindungs¬parameter zu berechnen. Als Bindungsort wurde der hydrophile Eingang der lipophilen Warfarin-Bindungstasche in der Subdomäne IIA des HSA-Moleküls mittels "molecular modelling" identifiziert. Nasschemische Untersuchungen ergaben, dass die Bindung der Anthocyane an HSA diese vor ihrem pH-abhängigen Abbau schützt. Eine signifikante Herab¬setzung der chemischen Abbaugeschwindig¬keit konnte auch für bovines Serumalbumin beobachtet werden. Diese Erkenntnis ließ sich auf andere, mit dem HSA-Molekül nicht strukurverwandte lebensmittelrelevante Albumine übertragen. So zeigten Anthocyane große Stabilität in Milch und Eiklar, wobei die Stabilisierung auf eine Wechselwirkung mit den Proteinen Laktalbumin und Ovalbumin zurückgeführt werden konnte. Die in dieser Arbeit erlangten Erkenntnisse hinsichtlich Absorption, Metabolisierung und systemischer Verfügbarkeit im menschlichen Organismus leisten einen Beitrag zum besseren Verständnis der Wirkungen von Anthocyanen. Die neuen Erkenntnisse der Protein¬bindung sind vor allem für die Bewertung der Verfügbarkeit der Anthocyane in humanem Gewebe relevant.
Identifizierung und Testung spezifischer Inhibitoren des Energiestoffwechsels von Tumorzellen
(2011)
Charakteristisch für viele maligne Tumorzellen ist eine erhöhte Aufnahme von Glucose und die Bildung großer Mengen Milchsäure auch in Anwesenheit von Sauerstoff (Warburg Effekt) und eine verminderte Nutzung des Zitratzyklus. Als Grund werden Defekte in der mitochondrialen Atmungskette diskutiert. Aber auch eine durch Onkogene gesteigerte Glykolyserate, könnte ursächlich sein. Ein weiterer für Tumorzellen wichtiger Stoffwechselweg, in dem Glucose abgebaut wird, ist der Pentosephosphatweg, dessen Blockade das Wachstum der Krebszellen hemmen könnte. Zudem stellt die Manipulation derjenigen Signalwege, die in den Tumorstoffwechsel involviert und in Tumorzellen überaktiviert (Ras/PI3K/Akt/mTOR- und Raf/MEK/ERK-Signalweg) oder unterdrückt (oxidative Phosphorylierung) sind, mögliche Ansatzpunkte dar. In dieser Arbeit wurde daher in vitro die Wirkung von 15 Substanzen an drei verschiedenen Tumorzelllinien und vier verschiedenen benignen Zellen untersucht, welche in die oben genannten charakteristischen Stoffwechselwege von Tumorzellen eingreifen und gegenwärtig intensiv als mögliche Tumortherapeutika diskutiert werden. Ziel war es, geeignete Kandidaten für eine zielgerichtete Therapie zu identifizieren. Der Schwerpunkt dieser Arbeit war die Beeinflussung des Glucosestoffwechsels in Tumorzellen. Da Glucose sowohl aerob als auch anaerob verstoffwechselt werden kann, wurden in einem ersten Ansatz zum einen Substanzen gestestet, die die Glykolyse auf verschiedenen Ebenen hemmen, zum anderen wurden Substanzen untersucht, die den mitochondrialen Stoffwechsel beeinflussen. Die Wirkung aller 15 Substanzen wurde zunächst jeweils als Einzelbehandlung getestet. Hierbei führten nur sehr hohe Konzentrationen in Tumorzellen zu einem drastisch verminderten ATP-Gehalt, die für benigne Zellen aber ebenfalls toxisch waren. Daher wurde in einem zweiten Schritt untersucht, ob durch die gleichzeitige Manipulation des Glucosestoffwechsels und des mitochondrialen Stoffwechsels mit jeweils subtoxischen Konzentrationen eine tumorselektive Wirkung erreicht werden kann. Bei der Kombination der Substanzen Oxythiamin/NaDCA bzw. 2-DG/Rotenon ergaben sich zwar synergistische Effekte auf die Verminderung des ATP-Gehaltes in den getesteten Tumorzellen, eine generelle tumorselektive Wirkung konnte jedoch durch die kombinierte Behandlung nicht erreicht werden. In jüngster Zeit mehren sich die Hinweise, dass die Glutaminolyse einen sehr wichtigen Stoffwechselweg für Energiegewinnung und Syntheseprozesse von Tumorzellen darstellt. Deshalb wurde in einem dritten Schritt untersucht, ob durch die Hemmung der Glutaminolyse mit der Substanz 6-Diazo-5-oxo-L-norleuzin (DON) eine tumorspezifische Wirkung erreicht werden kann. In der Tat konnte durch DON eine andeutungsweise tumorselektive Wirkung auf den ATP-Gehalt der Zellen erzielt werden, jedoch war das therapeutische Fenster sehr eng. Durch die Hemmung der oxidativen Phosphorylierung wurde in allen drei untersuchten Tumorzelllinien eine gesteigerte Milchsäureproduktion nachgewiesen. Dies ist ein eindeutiger Hinweis dafür, dass in diesen Tumorzellen die Mitochondrien keine Defekte aufweisen. Die hier untersuchten benignen und malignen Zellen wurden hinsichtlich des Glucosestoffwechsels mit verschiedenen Methoden näher charakterisiert, um zu beurteilen, ob sich die Zellen in ihrem Stoffwechselphänotyp unterscheiden. Bei der Quantifizierung der Glucoseaufnahme wurde deutlich, dass auch manche benigne Zellen deutliche Mengen an Glucose aufnehmen, welche allerdings nur der Tumorzelllinie mit der niedrigsten Aufnahme glich. Mittels immunhistochemischer Färbungen wurden charakteristische Proteine des Zuckerstoffwechsels dargestellt. Zudem wurde die Expression von zentralen Genen des Stoffwechsels auf mRNA- bzw. Proteinebene untersucht. Hierbei wurde deutlich, dass sowohl Tumorzellen als auch manche benigne Zellen für die Glykolyse typische Proteine bzw. mRNA stark exprimieren. Fazit der Charakterisierung ist, dass es zwischen den hier verwendeten malignen und benignen Zellen keine eindeutige Differenzierung aufgrund des Stoffwechselprofils gibt, sondern sich die getesteten Zellen nur graduell unterscheiden. Dieses Ergebnis erklärt möglicherweise die geringe Tumorspezifität der getesteten Substanzen. Im Vergleich mit den vielversprechenden Ergebnissen aus der Literatur zeigten die hier gewonnenen in vitro-Daten eindeutig, dass die Wirkung von potenziell tumorhemmenden Substanzen je nach Tumorzelltyp extrem verschieden war. Dies beruht darauf, dass der vorherrschende Stoffwechseltyp (oxidativ bzw. glykolytisch) für jede Tumorentität verschieden ist. Daher muss vermutlich für jede Tumorentität bzw. sogar für jeden Patienten individuell die Wirkung und der Nutzen einer Hemmung des Tumorstoffwechsels untersucht werden, bevor künftig an eine zielgerichtete Therapie gedacht werden kann.
Computer Science approaches (software, database, management systems) are powerful tools to boost research. Here they are applied to metabolic modelling in infections as well as health care management. Starting from a comparative analysis this thesis shows own steps and examples towards improvement in metabolic modelling software and health data management. In section 2, new experimental data on metabolites and enzymes induce high interest in metabolic modelling including metabolic flux calculations. Data analysis of metabolites, calculation of metabolic fluxes, pathways and their condition-specific strengths is now possible by an advantageous combination of specific software. How can available software for metabolic modelling be improved from a computational point of view? A number of available and well established software solutions are first discussed individually. This includes information on software origin, capabilities, development and used methodology. Performance information is obtained for the compared software using provided example data sets. A feature based comparison shows limitations and advantages of the compared software for specific tasks in metabolic modeling. Often found limitations include third party software dependence, no comprehensive database management and no standard format for data input and output. Graphical visualization can be improved for complex data visualization and at the web based graphical interface. Other areas for development are platform independency, product line architecture, data standardization, open source movement and new methodologies. The comparison shows clearly space for further software application development including steps towards an optimal user friendly graphical user interface, platform independence, database management system and third party independence especially in the case of desktop applications. The found limitations are not limited to the software compared and are of course also actively tackled in some of the most recent developments. Other improvements should aim at generality and standard data input formats, improved visualization of not only the input data set but also analyzed results. We hope, with the implementation of these suggestions, metabolic software applications will become more professional, cheap, reliable and attractive for the user. Nevertheless, keeping these inherent limitations in mind, we are confident that the tools compared can be recommended for metabolic modeling for instance to model metabolic fluxes in bacteria or metabolic data analysis and studies in infection biology. ...
Der Fluoreszenz-Resonanz-Energie-Transfer ist ein Phänomen, welches erstmals 1948 von Theodor Förster beschrieben wurde. Mit der Entwicklung von Fluoreszenzproteinen konnten in Kombination mit Mikroskopietechniken Einblicke in zellbiologische Vorgänge gewonnen werden, die durch biochemische oder physiologische Experimente nicht möglich sind. Dabei spielt die hohe zeitliche und räumliche Auflösung eine wichtige Rolle. Auf dem Forschungsgebiet der GPCR, welche die größte Gruppe von Membranproteinen bei den Säugetieren darstellen, wurden insbesondere Erkenntnisse über Konformationsänderungen der Rezeptoren, die Kinetik der Rezeptoraktivierung und die Interaktion mit intrazellulären Signalproteinen gewonnen. Der µ-Opioidrezeptor gehört zur Familie der GPCR und stellt aufgrund seiner analgetischen Wirkungen eine wichtige pharmakologische Zielstruktur dar. Das Ziel dieser Arbeit war sowohl den Rezeptor als auch seine Signalwege mittels FRET-Mikroskopie zu untersuchen. Zunächst sollte ein intramolekularer FRET-Sensor des µ-Opioidrezeptors entwickelt werden, dazu wurden basierend auf den Kenntnissen über die Tertiärstruktur und dem Aufbau bereits bekannter GPCR-Sensoren verschiedene Rezeptorkonstrukte kloniert. Bei den Konstrukten wurden entweder zwei Fluoreszenzproteine oder ein Fluoreszenzprotein und ein Fluorophor-bindendes Tetracysteinmotiv kombiniert. Auch die Positionen der eingefügten Sequenzen wurden in den intrazellulären Domänen variiert, da der Rezeptor auf die Modifikationen mit beeinträchtigter Membranlokalisation reagierte. Durch die Optimierung wurden Rezeptoren konstruiert, die an der Zellmembran lokalisiert waren. Jedoch zeigte keines der Rezeptorkonstrukte Funktionalität im Hinblick auf die Rezeptoraktivierung. Im zweiten Teil wurden die pharmakologischen Effekte der Metabolite von Morphin am humanen µ-Opioidrezeptor systematisch analysiert. Dazu wurde die Fähigkeit der Metabolite, Gi-Proteine zu aktivieren und β-Arrestin2 zu rekrutieren, mittels FRET-basierter Messungen an lebenden Zellen untersucht. Außerdem wurde die Affinität der Metabolite zum humanen µ Opioidrezeptor anhand der Verdrängung eines radioaktiven Liganden analysiert. Meine Experimente identifizierten eine Gruppe mit stark agonistischen und eine mit schwach agonistischen Eigenschaften. Die starken Partialagonisten aktivieren den Rezeptor bereits bei nanomolaren Konzentrationen, während die schwachen Metabolite den Rezeptor erst bei Konzentrationen im mikromolaren Bereich aktivieren. Die Metabolite Normorphin, Morphin-6-Glucuronid und 6-Acetylmorphin zeigen geringere Potenz als Morphin bei der Gi-Aktivierung aber überraschenderweise höhere Potenz und Effizienz für die β-Arrestin-Rekrutierung. Dies deutet auf eine bevorzugte Aktivierung von β-Arrestin2 hin. Die aus diesen Studien gewonnenen Ergebnisse liefern Hinweise darauf, welche Metabolite bei der Signalverarbeitung am µ Opioidrezeptor in vivo beteiligt sind.
Durch das Auftreten neuer Stämme resistenter Krankheitserreger ist die Suche nach neuartigen Wirkstoffen gegen diese, sich ständig weiter ausbreitende Bedrohung, dringend notwendig. Der interdisziplinäre Sonderforschungsbereich 630 der Universität Würzburg stellt sich dieser Aufgabe, indem hier neuartige Xenobiotika synthetisiert und auf ihre Wirksamkeit getestet werden. Die hier vorgelegte Dissertation fügt sich hierbei nahtlos in die verschiedenen Fachbereiche des SFB630 ein: Sie stellt eine Schnittstelle zwischen Synthese und Analyse der Effekte der im Rahmen des SFB630 synthetisierten Isochinolinalkaloid-Derivaten. Mit den hier angewandten bioinformatischen Methoden wurden zunächst die wichtigsten Stoffwechselwege von S. epidermidis R62A, S. aureus USA300 und menschlicher Zellen in sogenannten metabolischen Netzwerkmodellen nachgestellt. Basierend auf diesen Modellen konnten Enzymaktivitäten für verschiedene Szenarien an zugesetzten Xenobiotika berechnet werden. Die hierfür benötigten Daten wurden direkt aus Genexpressionsanalysen gewonnen. Die Validierung dieser Methode erfolgte durch Metabolommessungen. Hierfür wurde S. aureus USA300 mit verschiedenen Konzentrationen von IQ-143 behandelt und gemäß dem in dieser Dissertation vorgelegten Ernteprotokoll aufgearbeitet. Die Ergebnisse hieraus lassen darauf schließen, dass IQ-143 starke Effekte auf den Komplex 1 der Atmungskette ausübt – diese Resultate decken sich mit denen der metabolischen Netzwerkanalyse. Für den Wirkstoff IQ-238 ergaben sich trotz der strukturellen Ähnlichkeiten zu IQ-143 deutlich verschiedene Wirkeffekte: Dieser Stoff verursacht einen direkten Abfall der Enzymaktivitäten in der Glykolyse. Dadurch konnte eine unspezifische Toxizität dieser Stoffe basierend auf ihrer chemischen Struktur ausgeschlossen werden. Weiterhin konnten die bereits für IQ-143 und IQ-238 auf Bakterien angewandten Methoden erfolgreich zur Modellierung der Effekte von Methylenblau auf verschiedene resistente Stämme von P. falciparum 3D7 angewandt werden. Dadurch konnte gezeigt werden, dass Methylenblau in einer Kombination mit anderen Präparaten gegen diesen Parasiten zum einen die Wirkung des Primärpräparates verstärkt, zum anderen aber auch in gewissem Maße vorhandene Resistenzen gegen das Primärpräparat zu verringern vermag. Somit konnte durch die vorgelegte Arbeit eine Pipeline zur Identifizierung der metabolischen Effekte verschiedener Wirkstoffe auf unterschiedliche Krankheitserreger erstellt werden. Diese Pipeline kann jederzeit auf andere Organismen ausgeweitet werden und stellt somit einen wichtigen Ansatz um Netzwerkeffekte verschiedener, potentieller Medikamente aufzuklären.