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Die Natur eröffnet mit der strukturellen Vielfalt ihrer Sekundärmetaboliten einen nahezu unerschöpflichen Pool in der Leit- und Wirkstoffsuche nach pharmazeutisch wirksamen Substanzen. Insbesondere die Alkaloide zeichnen sich durch ihre biologischen Wirksamkeiten aus. Eine noch junge, sehr vielversprechende Substanzklasse stellen die sogenannten Naphthylisochinolin-Alkaloide dar, die bislang ausschließlich in den beiden Pflanzenfamilien der Ancistrocladaceae und Dioncophyllaceae gefunden wurden. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Extrakte von Ancistrocladus congolensis (A.c.), Triphyophyllum peltatum (T.p.) und Dioncophyllum thollonii (D.t.) untersucht. Hierbei gelang die Isolation und Strukturaufklärung des bereits bekannten Korupensamin A (A.c.) sowie von sechs bislang unbekannten Alkaloiden: Ancistrocongolin A-D (A.c.), Habropetalin A (T.p.) und Dioncophyllin E (D.t.). Zu dem letztgenannten wurde ein synthetischer Zugang evaluiert. Alle neu isolierten Naturstoffe wurden einer biologischen Aktivitätstestung zugeführt. Im analytischen Bereich der Arbeit gelang die vollständige Strukturzuordnung des bereits seit mehreren Jahren bekannten Tetralons Isoshinanolon, was somit nun ein einfache Analytik für die Bestimmung der absoluten Konfiguration an die Hand gibt. Des Weiteren wurde die HPLC-CD-Kopplung als schnelle und praktikable chirale on-line-Analytik an mehreren Beispielen (Phyllin, TaClo, Murrastifolin F, Cyclorocaglamid, Thalidomid) sowohl im phytochemischen als auch synthetischen Bereich eingeführt und etabliert.
Bei der Malignen Hyperthermie (MH) handelt es sich um eine autosomal-dominant vererbbare Erkrankung mit variabler Penetranz und Expressivität. Es kommt zu einem übermäßigen Calciumeinstrom in die Skelettmuskelzelle nach Triggerexposition aufgrund einer Fehlfunktion des verantwortlichen Ryanodinrezeptors (RYR1). Bei den bekannten Triggern handelt es sich um depolarisierende Muskelrelaxantien und volatile Anästhetika wie Halothan, aber auch andere Stoffe können diese Triggerfunktion ausüben. Das Phenolderivat Chlorocresol, ein in vielen Medikamenten gebräuchliches Konservierungsmittel, wird als fragliche Triggersubstanz bezüglich ihres Effektes auf die Skelettmuskulatur von MHS gegenüber MHN-Patienten im In-Vitro-Kontraktur-Test (IVCT) getestet. Zudem wurden mit der high pressure liquid chromatography (HPLC) die Serumkonzentrationen an Chlorocresol von Patienten gemessen, welche vor einer Bypassoperation eine definierte Menge eines chlorocresolhaltigen Heparinpräparates erhalten haben. Chlorocresol zeigt im IVCT eine signifikante Differenz zwischen MHN- und MHS-Patienten. Somit ließe sich dieser Stoff auch in der Diagnostik der MH einsetzen. Die Serumwerte von Chlorocresol bei Patienten, die eine definierte Dosis an chlorocresolhaltigen Heparin erhalten haben, lagen unter der Nachweisgrenze, welche wiederum deutlich unter der im IVCT gefundenen für eine Muskelkontraktur erforderlichen Mindestkonzentration an Chlorocresol lag. Folglich scheint keine Gefahr für MH-Träger, durch Gaben von üblichen Mengen an chlorocresolhaltigen Medikamenten eine MH-Krise auszulösen.
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurden analytische Methoden zur Bestimmung des Verunreinigungsprofils von Erythromycin entwickelt, die der bestehenden Ph.Eur.-Methode überlegen sind. Die neue HPLC-Methode ist in der Lage, alle verwandten Verbindungen mit angemessener Präzision nachzuweisen und zu quantifizieren. Mit Hilfe der Massenspektrometrie konnten alle Hauptkomponenten und verwandten Verbindungen der Base, ihrer Ester und Salze eindeutig identifiziert und quantifiziert werden. Zudem konnten zwei neue verwandte Verbindungen von Erythromycin gefunden und als N,N-Didemethylerythromycin A und Anhydroerythromycin F identifiziert werden.
Die Qualitätskontrolle von pharmazeutisch verwendeten Substanzen ist eine Voraussetzung für die sichere Anwendung von Arzneimitteln. Sie ist eng mit der Bestimmung der Verunreinigungen einer Substanz im Rahmen der Reinheitsanalytik verknüpft. Dabei spielt das Europäische Arzneibuch (Ph. Eur.) eine wichtige Rolle. Die in der vorliegenden Arbeit durchgeführten Untersuchungen zur Bestimmung des Verunreinigungsprofils waren auf die Neuerarbeitung oder Überarbeitung der im Ph. Eur. beschriebenen Prüfungen auf „Verwandte Substanzen“ ausgerichtet. Im Rahmen der Neuerarbeitung einer Monographie für Trimebutin und Trimebutin-Maleat wurde eine RP-HPLC-Methode entwickelt. Neben den bekannten Verunreinigungen war ein weiterer Peak nachweisbar, der N-Desmethyltrimebutin zugeordnet wurde. Die Trennung zwischen N-Desmethyltrimebutin und dem Hauptpeak sowie zwischen zwei bekannten Verunreinigungen ist kritisch. Für beide Peakpaare wurden Systemeignungskriterien festgelegt. Zur Definition von Akzeptanzkriterien in den erarbeiteten Monographieentwürfen wurden Chargen untersucht. Die Quantifizierung erfolgte über die „Externer-Standard“-Methode mit einer Verdünnung der Untersuchungslösung als Referenz. Falls erforderlich, wurden die Korrekturfaktoren in die Berechnung des Gehaltes einbezogen. Die DC-Methode zur Prüfung auf „Verwandte Substanzen“ von Adenosin sollte gegen eine HPLC-Methode ausgetauscht werden. In Übereinstimmung mit Ergebnissen des EDQM-Labors haben die Untersuchungen bestätigt, dass mit einer Ionenpaar-HPLC-Methode die Anwesenheit von Inosin, Guanosin, Uridin und Adenin in Adenosin kontrolliert werden kann. Durch die Festlegung einer Auflösung > 1.5 zwischen Adenin und Inosin als Systemeignungskriterium werden nicht geeignete HPLC-Säulen erkannt. Durch die DC-Prüfung des Ph. Eur. können verschiedene Nucleotide nachgewiesen werden. Die vorgeschlagene HPLC-Methode wurde durch Einführung eines Gradienten so geändert, dass Nucleotide, Nucleoside und Adenin gleichzeitig nachgewiesen werden konnten. Die Analyse der Proben bestätigte die Ergebnisse der DC, dass kleine Mengen Adenosin-5’-monophosphat in den Chargen vorhanden waren. Eine CE-Methode zur Reinheitsprüfung von Glutathion wurde entsprechend der Kommentare zum in Pharmeuropa veröffentlichten Monographievorschlag überarbeitet. Die kritischen Trennungen zwischen dem internen Standard und Cystein sowie zwischen L-γ-Glutamyl-L-cystein und dem Hauptpeak, die durch den Systemeignungstest überprüft werden, waren durch den pH-Wert des Trennpuffers kontrollierbar. Glutathion zeigt beispielhaft, dass das Verunreinigungsprofil fermentativ gewonnener Produkte komplex ist und von den Herstellungs- und Aufreinigungsprozessen abhängt. Gleiches gilt für Aminosäuren, die vermehrt biotechnologisch gewonnen werden. In den Aminosäure-Monographien ist zur Reinheitsprüfung eine DC auf „Ninhydrin-positive Substanzen“ vorgeschrieben. Diese Methode ist auf den Nachweis anderer Aminosäuren, die durch unvollständige Abtrennung bei der Extraktion aus Proteinhydrolysaten stammen können, ausgelegt. Die Analyse von Aminosäuren mittels CE nach Derivatisierung mit FMOC-Cl ermöglicht einen sensitiven und selektiven Nachweis anderer Aminosäuren. Durch den Einsatz von CBQCA als Derivatisierungsreagenz können auch Aminozucker und kleine Peptide erfasst werden. Mit beiden Methoden wurde das Verunreinigungsprofil von Histidin, Isoleucin, Phenylalanin und Serin bestimmt. Während in den Phe- und Ser-Proben keine Verunreinigungen erfasst wurden, wurden in den Ile-Proben nach Derivatisierung mit FMOC-Cl andere Aminosäuren gefunden. Alle untersuchten Aminosäuren zeigten nach Derivatisierung mit CBQCA viele Verunreinigungen. Wegen Peaküberlagerungen konnten Aminosäuren mit dem verwendeten Trennpuffer (25 mM Boratpuffer pH 9.20; 25 mM SDS) nicht bestimmt werden. Durch eine Variation des Puffers (20 mM Tetraboratpuffer pH 9.3; 100 mM SDS) war es möglich, die CBQCA-derivatisierten Aminosäuren zu trennen und zuzuordnen. Im Hinblick auf die Anwesenheit anderer Aminosäuren waren die Ergebnisse der beiden Verfahren vergleichbar. Insbesondere wurden in den Ile-, Phe- und Ser-Proben keine basischen Aminosäuren sowie Cystein gefunden. Deren FMOC-Derivate comigrierten mit einem Peak, der nach Strukturaufklärung mittels NMR-Spektroskopie als Nebenprodukt der Derivatisierungsreaktion mit FMOC-Cl identifiziert wurde. Als Verunreinigungen von biotechnologisch hergestellten Aminosäuren kommen organische Säuren in Frage. Durch eine RP-HPLC unter Zusatz von Heptafluorbuttersäure als Ionenpaarreagenz wurden Aminosäuren und organische Säuren getrennt. Die Detektion erfolgte mittels ELSD. Nach dem Hauptpeak wurden Störsignale detektiert, weshalb sich die Anwendung der Methode zur Reinheitsprüfung als schwierig herausstellte. Die durchgeführten Experimente deuten darauf hin, dass der ELSD mit der großen Substanzmenge überlastet ist und es zur Verschleppung von Substanz kommt.
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, den Umfang der gastrointestinalen Absorption und Metabolisierung von mit der Nahrung aufgenommenen Polyphenolen in vivo zu ermitteln. Darüber hinaus sollte deren systemische Verfügbarkeit anhand von humanen Serum- und Urinproben bestimmt werden. Lebensmittel der Wahl war dabei Apfelsaft. Die Identifizierung und Strukturaufklärung der Polyphenole und ihrer Metabolite erfolgte mittels Hochleistungsflüssigchromatographie-Diodenarray-Detektion (HPLC-DAD), HPLC-Elektrospray-Tandemmassenspektrometrie (HPLC-ESI-MS/MS) sowie Kapillargaschromatographie-Massenspektrometrie (HRGC-MS). Quantitative Analysen wurden mittels HPLC-DAD durchgeführt; für die Bestimmung der Polyphenolgehalte in Urinproben sowie von D-(-)-Chinasäure wurde die HPLC-ESI-MS/MS im Single Reaction Monitoring (SRM) Modus eingesetzt. Zur Etablierung der Polyphenolanalytik und zur Auswahl eines für die Studien geeigneten Saftes wurden die Polyphenolprofile verschiedener Presssäfte aus Most- und Tafeläpfeln sowie kommerziell erhältlicher Apfelsäfte ausgewertet. Für die Säfte aus Tafeläpfeln wurden Polyphenolmengen zwischen 154 und 178 mg/L bestimmt, wohingegen die Säfte aus Mostäpfeln Gehalte zwischen 261 und 970 mg/L aufwiesen. Bei den Säften des Handels wiesen die naturtrüben Apfelsäfte mit 182 bis 459 mg/L höhere Polyphenolgehalte auf als die klaren Produkte (120 - 173 mg/L). Bei oraler Aufnahme kommen die Polyphenole zuerst mit Speichel in Kontakt. Umsetzungen mit zentrifugiertem Speichel führten zu keiner Modifikation der Substanzen. In Gegenwart von nativem Speichel wurden für die ß-glycosidisch gebundenen Flavonoidglycoside hydrolytische Abbaureaktionen in Abhängigkeit der Struktur ihres Zuckerrestes beobachtet. Nach Antibiotikumzugabe wurden deutlich geringere Abbauraten ermittelt. Die Hydrolyse erfolgt demnach hauptsächlich durch Enzyme der bakteriellen Mundflora. Im Weiteren gelangen die Polyphenole über die Speiseröhre in den stark sauren Magen. Zur Überprüfung ihrer Stabilität wurden die Apfelpolyphenole mit künstlichem Magensaft (pH 1,81) über vier Stunden inkubiert. Einzig für Procyanidin B2 wurde ein nahezu vollständiger Abbau nachgewiesen. Nach Passage des Magens erreichen die Polyphenole das neutrale bis leicht alkalische Duodenum. Die Inkubation erfolgte mit simuliertem Duodenalsekret (pH 7,2) über einen Zeitraum von 24 Stunden. Für 5-Kaffeoylchinasäure wurde eine 37%ige Abnahme beobachtet. Dabei wurden 3- und 4-Kaffeolychinasäure, Kaffeesäure, D-(-)-Chinasäure sowie Kaffeesäuremethylester generiert. Vergleichbare Ergebnisse wurden bei der Inkubation von 4-p-Cumaroylchinasäure erhalten. Kaffeesäure unterlag einer 26,3%igen Umsetzung zu Ferulasäure, Dihydrokaffeesäure und Kaffeesäuremethylester. Bei den monomeren Flavan-3-olen wurden mittels HPLC-Analytik an chiraler Phase Epimerisierungen nachgewiesen. Procyanidin B2 war nach vier Stunden nur noch in Spuren erfassbar. Quercetin wurde vollständig in Phloroglucin, 3,4-Dihydroxybenzoesäure und 2,4,6-Trihydroxybenzoesäure gespalten. Um die Verfügbarkeit der Polyphenole im Dickdarm zu untersuchen, wurde eine Interventionsstudie mit naturtrübem Apfelsaft bei Probanden mit einem Stoma des terminalen Ileums durchgeführt. Nach oraler Aufnahme von einem Liter Saft wurde der Ileostomaausfluss über einen Zeitraum von acht Stunden gesammelt. In den Ileostomabeuteln wurden zwischen Null und 33,1% der einzelnen aus dem Apfelsaft aufgenommenen phenolischen Substanzen wiedergefunden. Der ausgeschiedene Anteil der Flavonoidglycoside war dabei abhängig von der Struktur des jeweiligen Zuckerrestes. Als Metabolite waren D-(-)-Chinasäure, 1- und 3-Kaffeoylchinasäure, Phloretin und dessen 2´-O-Glucuronid sowie die Methylester der Kaffee- und p-Cumarsäure nachweisbar. Für die höhermolekularen Procyanidine wurden Wiederfindungen von 90,3% sowie deren partieller Abbau ermittelt. Die systemische Verfügbarkeit der Polyphenole sowie ihre renale Ausscheidung wurden in zwei weiteren Humanstudien mit gesunden Probanden untersucht. Nach Konsum von einem Liter naturtrüben Apfelsaft erfolgten Blutabnahmen über einen Zeitraum von acht Stunden; Urin wurde über einen Zeitraum von 24 Stunden untersucht. Die Bilanzierung der Apfelpolyphenole erfolgte sowohl vor als auch nach enzymatischer Hydrolyse. Kaffeesäure, 5-Kaffeoylchinasäure, 4-p-Cumaroylchinasäure, (-)-Epicatechin, Phloretin und Quercetin waren sowohl im Serum als auch im Urin detektierbar. Insgesamt wurden 5,3% (Serum) bzw. 23% (Urin) der mit dem Saft aufgenommenen phenolischen Verbindungen wiedergefunden. Davon waren im Urin 19,5% in Form hydroxylierter phenolischer Säuren nachweisbar.
In der Promotion wird die Entwicklung, Optimierung und Validierung einer Reversed-phase-Chromatography Methode zur Messung des Ribavirinplasmaspiegels beschrieben. Diese wurde mit einer Solid Phase Extraction zur Probenvorbereitung kombiniert. Zudem finden sich zahlreiche Auswertungen von gemessenen Patienenchromatogrammen zu ausgewählten, klinisch relevanten Fragestellungen, wie beispielsweise die Darstellung des Ribavirinplasmaspiegels im Tagesverlauf, im Verlauf der ersten sechs Therapiewochen, im Vergleich von Männern und Frauen, sowie bei einem niereninsuffizienten Patienten. Zu den erhobenen Ergebnissen wird Stellung genommen, und daraus resultierende Schlussfolgerungen bezüglich einer zukünftigen Optimierung der Hepatitis-C-Therapie kommentiert.
Seit der Strukturaufklärung der grünen Blattpigmente Chlorophyll a und Chlorophyll b sowie des roten Blutfarbstoffes Häm durch Richard Willstätter und Hans Fischer zu Beginn des 20. Jahrhunderts stehen tetrapyrrolische Naturstoffe weltweit im Fokus unzähliger biologischer, medizinischer, physikalischer und chemischer Forschungsarbeiten. Heute spielen insbesondere Porphyrine – die prominentesten Vertreter der synthetischen Tetrapyrrol-Makrocyclen – eine bedeutende Rolle in der modernen angewandten Chemie, etwa als metallorganische Katalysatoren, als Photosensibilisatoren in der photodynamischen Krebstherapie oder auf dem Gebiet der Materialwissenschaften. Neben monomeren Porphyrinen sind dabei v.a. Multiporphyrine mit maßgeschneiderten photophysikalischen Eigenschaften und definierter dreidimensionaler Struktur höchst attraktive Syntheseziele. Im Gegensatz zum immensen Forschungsinteresse an achiralen Porphyrin-Systemen wurde der Darstellung und stereochemischen Charakterisierung chiraler Porphyrinoide bislang vergleichsweise wenig Beachtung geschenkt. Insbesondere optisch aktive Vertreter mit stereo-genen Porphyrin-Aryl-Achsen und intrinsisch axial-chirale Oligoporphyrine wurden bislang kaum untersucht. Aufgrund eines Mangels an geeignet funktionalisierten tetrapyrrolischen Vorläufern sind hierbei Strukturmotive mit β-Verknüpfung besonders unterrepräsentiert. Die generell spärliche Beschreibung axial-chiraler Porphyrin-Systeme und ihrer chiroptischen Eigenschaften liegt hauptsächlich in der oft extrem schweren Zugänglichkeit entsprechender Verbindungen – insbesondere in optisch reiner Form – begründet. Aufgrund der derzeit rapide ansteigenden Bedeutung chiraler Porphyrinoide sind die Synthese und stereochemische Analyse sowie eine Erweiterung des bis dato mehr als begrenzten methodischen Repertoires zur stereoselektiven Darstellung von chiralen Porphyrin-Derivaten von größtem Interesse. Ziel der vorliegenden Arbeit war daher die Etablierung effizienter und vielseitig ein-setzbarer Verfahren zum Aufbau komplexer axial-chiraler Mono- und Multiporphyrine mit maßgeschneiderten chemischen, physikalischen und chiroptischen Eigenschaften sowie unter-schiedlicher räumlicher Anordnung der Chromophore. Desweiteren sollten erstmals verschiedene Konzepte zur stereoselektiven Synthese axial-chiraler Porphyrin-Systeme entwickelt und vergleichend erprobt werden. Bei allen bearbeiteten Fragestellungen standen ein tieferes Verständnis stereochemischer Aspekte sowie die eingehende Untersuchung der chiroptischen Eigenschaften (z.B. unter Anwendung moderner HPLC-Kopplungstechniken) der neuartigen synthetisierten Verbindungen im Vordergrund.
The work presented in this thesis was mainly targeted at exploring the capabilities of evaporation based LC detectors as well as further alternatives for the control of impurities in substances not exhibiting a suitable chromophore for UV-detection. In the course of the work carried out, several new methods for the identification, impurities control and composition testing of APIs were elaborated. An evaporation based detector that entered into the field of pharmaceutical analysis in the recent years was the Evaporative Light Scattering Detector (ELSD). However, non-reproducible spikes were reported when injecting concentrated test solutions as they are usually required for the control of impurities. The reasons, for the appearance of these spikes as well as possibilities for their avoidance were explored in a systematic study. Moreover, the dependence of the detector sensitivity on different eluent composition, eluent flow-rate and ELSD settings was investigated. In the course of the revision of the Ph.Eur. monographs for aspartic acid and alanine, a C18 reversed phase ion-pair LC method using 1 mmol/L of perfluoroheptanoic acid as an ion-pair reagent and a charged aerosol detector (CAD) was developed and fully validated for the purity control of Asp. The method was capable of separating the organic acids and major amino acids known to occur as process related impurities. With a slight modification, the method was also applicable for the purity control of Ala. Based on the developed LC-CAD method for the impurity control of alanine, a comparative study of the performance characteristics of different evaporation based LC detectors, i.e. ELSD, CAD and the recently developed Nano Quantity Analyte Detector (NQAD) was carried out. Additionally, an MS detector and qNMR were included in this study. It was found that the control of impurities in Alanine at an ICH conform level could be ensured using LC coupled to CAD, MSD and NQAD detection as well as by the use of qNMR. In terms of performance, prize and ease of use CAD and NQAD were found to be the most suitable alternatives. In terms of repeatability and sensitivity, the CAD appeared slightly superior to the NQAD. The quality of streptomycin sulfate is not sufficiently controlled by the current Ph.Eur. monograph in that an appropriate test for the control of the related substances is missing. A study was carried out to develop a C18 reversed phase ion-pair LC method using pentafluoropropionic acid as an ion-pair reagent and a CAD for the identification and control of the related substances. The developed method allowed the separation of 21 impurities from streptomycin. Moreover, coupling of the method to MS allowed the identification of the separated impurities. The method was shown to be sufficiently sensitive to control the related substances with a disregard limit of 0.1% as it is normally applied in the Ph.Eur. for products derived from fermentation. Currently, the aescin content of horse-chestnut standardized dry extract is determined using a complex and laborious photometric determination. A more selective LC-UV assay determination for beta-aescin has been proposed for the Ph.Eur. draft monograph of horse-chestnut standardized dry extract. Possibilities were explored to further improve the LC-method using detection by CAD. It was demonstrated that by the use of a modified LC-CAD method several problems related to the differences in the UV-response of the various components contained in the active aescin fraction could be eliminated. Moreover the proposed reference standard strategy was reviewed. Eventually, it was demonstrated on the example of two different clusters of pharmacologically active peptides how low energy collision induced dissociation mass spectrometry (low energy CID-MS) can successfully be used for identification testing in pharmacopoeial monographs. In this respect, the combination of a direct confirmation of the molecular mass via the m/z-ratio of the molecule ions with structural sequence information obtained by low energy CID-MS experiments was found to deliver a higher degree of certainty of the identity of a given substance than the set of tests currently described in the monographs. A significant gain in efficiency and throughput and important reduction of the amount of sample consumed during testing were identified as being additional advantages of this approach. Taken together, it could be demonstrated on various examples how recent technological advancements in the field of analytical chemistry can contribute to improve the quality control of APIs.
Superoxidanionen (O2˙‾) sind eine von mehreren sogenannten reaktiven Sauerstoffspezies, die im menschlichen Körper intra-, aber auch extrazellulär vorkommen. Verschiedene Enzyme, z.B. in der mitochondrialen Atmungskette, die NADPH-Oxidase oder endotheliale NO-Synthasen bilden O2˙‾. Da es sich um eine sehr reaktive Substanz handelt, die mit der DNA sowie mit Proteinen und Lipiden interagiert und diese schädigen kann, spielt sie bei kardiovaskulären Erkrankungen wie etwa der chronischen Herzinsuffizienz, Hypertonie oder Arteriosklerose eine große Rolle, ist aber auch an vielen anderen Erkrankungen wie z.B. dem Diabetes mellitus pathophysiologisch beteiligt. Dies macht verständlich, dass es für die Forschung von entscheidender Bedeutung ist, Methoden zu entwickeln, die zur Erkennung und Quantifizierung von O2˙‾ geeignet sind. Bereits heute gibt es verschiedene Methoden, O2˙‾ nachzuweisen. Jede dieser Methoden hat jedoch ihre ganz spezifischen Vor- aber auch Nachteile. Wir haben eine neue, einfache, sehr schnelle und sensitive HPLC-Methode mit einem internen Standard entwickelt, mit der die O2˙‾-Produktion in Endothelzellen und aortalem Gewebe gut zu messen ist. Sie beruht auf der Tatsache, dass Dihydroethidium (DHE) mit O2.- zu 2-Hydroxyethidium (2-OH-E+) reagiert. Nach Trennung mittels HPLC wurde die Menge an entstandenem 2-OH-E+ durch einen elektrochemischen Detektor gemessen. Die Proben wurden durch isokrate Elution aufgetrennt, was bisher bei der Detektion von 2-OH-E+, DHE und O2˙‾ mit vielen Nachteilen verbunden war. Durch eine spezielle mobile Phase, die ein Ionen-Paar-Reagens enthielt, konnte diese Form der Elution nun auch zur Erkennung von O2˙‾ angewandt werden. DHE und seine Reaktionsprodukte konnten nicht nur eindeutig aufgetrennt werden, sondern die Auftrennung erfolgte auch sehr schnell in nur etwa 15min, was gegenüber älteren Methoden einen eindeutigen Zeitvorteil bringt. Anstatt zwei benötigten wir darüber hinaus nur eine Pumpe, was ebenfalls ein Vorteil der isokraten Elution ist. Wir erreichten auch über längere Messreihen stabile Bedingungen, da für die isokrate Elution die mobile Phase nicht verändert werden muss. Des Weiteren haben wir 3,4-Dihydroxyzimtsäure als internen Standard eingeführt, der sich hinsichtlich seiner Retentionszeit als sehr geeignet erwies und mit einem elektrochemischen Detektor klar und eindeutig nachweisbar war. Dies bietet große Vorteile gegenüber Methoden ohne internen Standard. Veränderungen der Konzentrationen von DHE, 2-OH-E+ und Ethidium aufgrund von Verdampfen des Lösungsmittels Methanol können ebenso erkannt werden wie Ungenauigkeiten während der Präparation sowie Schwankungen im HPLC-System, wie sie etwa bei langen Messreihen durch Auswaschungs-Effekte oder Verunreinigungen auftreten können. Da sich die Konzentration des internen Standards 3,4-Dihydroxyzimtsäure stets mitverändert, können die Messwerte normalisiert werden und somit die Verfälschungen aufgehoben werden. Dem zu Folge sind Messungen mit einem internen Standard gegenüber solchen ohne internen Standard deutlich valider. Sowohl die Stimulation von humanen aortalen Endothelzellen (HAEC) mit Glukose bzw. Tumornekrosefaktor α, als auch die Infusion von Angiotensin II bei männlichen Mäusen mit anschließender Untersuchung der Aorta führt bekanntermaßen zu einem Anstieg von O2˙‾. Dieser Effekt konnte nun auch mit unserer neu etablierten HPLC-Methode nachgewiesen werden. Ebenfalls war ein Anstieg des aortalen O2˙‾-Spiegels bei Ratten nach induziertem Myokardinfarkt bereits in mehreren früheren Arbeiten beschrieben worden. Dieser lag auch bei Messung mit unserer neu etablierten HPLC-Methode eindeutig vor. Die Signale waren hierbei für die untersuchten Substanzen 2-OH-E+, DHE sowie für den internen Standard 3,4-Dihydroxyzimtsäure eindeutig und gut voneinander getrennt. Zusammenfassend konnte somit gezeigt werden, dass sich anhand mehrerer etablierter in vitro und in vivo Modelle erhöhter Sauerstoffradikal-Produktion der Anstieg von O2˙‾ auch mit unserer neuen Variante der HPLC mit isokrater Elution, internem Standard und Messung mittels elektrochemischem Detektor nachweisen ließ. Es handelt sich um eine zuverlässige und sensitive Methode, die zusätzliche Vorteile für die Messung von O2˙‾ mit sich bringt.
Tropische Infektionskrankheiten wie Malaria, Leishmaniose oder auch die Afrikanische Trypanosomiase sind aufgrund von zunehmenden Resistenzen der Erreger, globaler Erwärmung, aber auch von Versäumnissen in der Vergangenheit bei der kontinuierlichen Weiterentwicklung bestehender sowie der Erforschung neuer Medikamente auch im 21. Jahrhundert noch eine große Bedrohung für Millionen von Menschen. Die Suche nach neuartigen Wirkstoffen und deren Weiterentwicklung zu potenziellen Medikamenten ist daher zwingend erforderlich. Insbesondere Produkte des Sekundärstoffwechsels wie etwa die Alkaloide bilden wichtige Grundlagen als Leitstrukturen für pharmazeutische Wirkstoffe. Eine solche Klasse phytochemischen Ursprungs sind die Naphthylisochinolin-Alkaloide mit interessanten strukturellen Eigenschaften sowie pharmakologischen Wirksamkeiten. Einige Vertreter zeigen ausgeprägte In-vitro-Aktivitäten gegen protozoische Erreger wie Plasmodien, Leishmanien und Trypanosomen. Besonders die neuartige Unterklasse ionischer N,C-verknüpfter Naphthylisochinolin-Alkaloide, wie z.B. Ancistrocladinium A und Ancistrocladinium B, zeichnen sich durch gute antileishmaniale Wirkungen aus. In Vorarbeiten zeigten erste Studien zu Struktur-Aktivitäts-Beziehungen (SAR-Studien) mit vereinfachten N,C-gekuppelten Arylisochinolinen, dass sich durch gezielte Strukturvariation die Aktivität gegen einen Erreger verbessern lässt. Zusätzlich wurde mit ersten Untersuchungen zum Wirkmechanismus dieser interessanten Verbindungen begonnen. Darüber hinaus ermöglicht die kontinuierliche Verbesserung der analytischen Methoden inzwischen die schnelle und gezielte Suche nach neuen Verbindungen aus der Natur. Durch die Anwendung von Online-Analyse-Verfahren, wie z.B. die Kopplung von HPLC mit NMR und MS, gelingt die Aufklärung der Konstitution von Substanzen direkt aus Extrakten. Ziel der vorliegenden Arbeit war die Verbesserung der biologischen Aktivitäten der N,C-verknüpften Arylisochinoline durch strukturelle Derivatisierung sowie Beiträge zur Aufklärung des Wirkmechanismus mittels markierter Verbindungen. Zusätzlich sollten Naturstoffe unter Verwendung moderner HPLC-Kopplungstechniken untersucht und strukturell aufgeklärt werden.