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Veränderung der Tumorimmunumgebung muriner Mamma-Karzinome durch Inhibierung der Kollagensynthese
(2023)
Das Mamma-Karzinom gehört zu den sogenannten desmoplastischen Tumorarten. Hierbei handelt es sich um Tumoren mit erhöhter Ansammlung von Bindegewebszellen und einer Akkumulation von Extrazellulärer Matrix (EZM). Diese verdichtete EZM wirkt sowohl auf mechanischer als auch auf Signalweg-vermittelter Ebene als eine Barriere, welche die therapeutische Wirksamkeit erheblich vermindert.
Einer der Hauptbestandteile der EZM ist Kollagen. Durch Anwendung von Präparaten, welche die Kollagensynthese und -reifung inhibieren, kann die rigide Struktur aufgelockert werden. Daraus ergibt sich eine verbesserte Versorgung mit Nährstoffen und eine verbesserte Infiltrationsmöglichkeit für Immunzellen. Dies ist für die Effizienz der Immuntherapie, welche sich in den letzten Jahren als vielversprechende Alternative zu den Grundsäulen der Krebstherapie entwickelt hat, unabdinglich.
In der vorliegenden Arbeit wurden murine Mamma-Karzinome der 4T1-Linie nach Behandlung mit EZM-destabilisierenden Kollageninhibitoren auf ihre Immunumgebung hin untersucht.
Verwendet wurden drei Wirkstoffe, welche an unterschiedlichen Punkten in die Kollagensynthese und -reifung eingreifen: βAPN als LOX(L)-Inhibitor, 1,4-DPCA als P4HA-Inhibitor und Minoxidil als LH-Inhibitor. Die Behandlung führte zu einem deutlichen Anstieg aller untersuchten Immunzellen und deutet somit auf eine verbesserte Infiltrationsmöglichkeit hin. Zudem wurde die Expression maligner Signalwege, wie die der Angiogenese, Hypoxie, Metastasierungsneigung, Invasivität und Immunsuppression, verringert und tumorsuppressive Immunantworten verstärkt.
Die Kollageninhibition hatte zusätzlich ein verringertes Tumorwachstum und eine Reduktion der Blutgefäßdichte zufolge.
Als Fazit gilt es festzuhalten, dass die Verwendung von Kollageninhibitoren in der Immuntherapie eine vielversprechende Option zur Verbesserung der Effizienz dieser Therapeutika darstellt. Diese Erkenntnis gilt es im Rahmen künftiger wissenschaftlicher Untersuchungen weiterzuentwickeln.
After implementing a reliable mass spectrometry based kinetic study the indole conjugation with different organometallic indoles led to questions about the electronical and sterical influences on reactivity. The substitution pattern of the ferrocene functionalized indoles at the six-membered ring determines the electron density on the C3 atom, which reacts with the formed Schiff base. Since the experimental results showed the exact opposite trend, covalent docking studies were performed elucidating the importance of surface interactions. These studies were in harmony with the experimental results and determined lysine 33 as most preferable conjugation site as well as substitution in 6-position as most favourable pattern. The amine motif in compounds 6, 7 and 8 proofed to be easily fragmented by the ESI method used. The amide linker in 10 remains intact but shows a lower conversion. Those two inherent characteristics are however preferable for well-defined and site-specific bioconjugation. The synthesis and evaluation of piano stool complex derivatives with manganese and rhenium metal centre 15, 16, 18 and 22 gave additional guidance by the interpretation of applicable structural motifs. The electron-withdrawing carbonyl groups lead to the hindrance of fulvene formation and thus to no fragmentation as seen with the ferrocene group. The total conversion is low compared to 8, only 22 shows a good enough conversion to mainly monoconjugate of 45% and a possible radio-labelling application as 99mTc analogue. As consequence manganese complexes with a stable facial tricarbonyl unit and a tridentate chelator with 4-, 5- and 6-substituted aminomethylindole conjugated through an amide bond were synthesized and consecutively evaluated. The resulting organometallic indole derivatives 29, 30 and 31 all showed a total conversion around 40% similar to 16, but at the same time a rate constant in the range of 10-4 s-1 like the organic indole. Besides the similar conversion, the rate constants followed the trend of the 6-substituted derivative as fastest and then 5- and 4- substituted derivative with decreasing reactivity. For underlining the usage as technetium label for the best out of the series 31, a rhenium analogue was prepared. The resulting compound 32 was especially interesting, because the conversion was even higher than the 70% of 8 with a total of 88%. Additionally, the rate constant was a tenfold higher as well. This rendered compound 32 as best possible 99mTc analogue for further application as radio-label. After the success of 32 and realizing the sterical benefits resulting from the flexible tridentate ligand-system, substitution at the five-membered ring was explored. The complexes 33, 34 and 35 are based on indole-2-carboxylic acid and with the difference of the length of the alkyl spacer between amide and complex to probe for the influence and sterical hindrance, but all three derivatives showed no conjugation which excludes functionalization in 2-position. As the C3 is used for the actual bioconjugation, the last possible derivatization was realized on the indole-N1 by using 1-(3-bromopropyl)indole as building block during the synthesis of the ligand-system. The corresponding manganese 36 and rhenium 37 complexes both showed similar properties of a moderate conversion like 22 and a rate constant in the range of 10-5 s-1. In conclusion the rhenium complex 32 with the 6-substitution pattern at the tridentate indole-bearing ligand remains the most promising structure.
The here developed liquid chromatography coupled mass spectrometry-based assay for the determination of inhibitory activity of drug candidates against the 3CLpro of the sever acute respiratory syndrome coronavirus type 2 was successfully implemented and especially designed to give, due to the available absorption spectra and corresponding mass traces, further insight in the otherwise through fluorescence resonance energy transfer-based assays neglected influences on the inhibition results. Starting with a literature-known quinolone containing covalent inhibitor 42 an N1-methylated derivative 43 and their analogues 44 and 45 in which the benzoic acid was exchanged for ferrocene carboxylic acid were synthesized. The inhibition of 3CLpro was evaluated by the concentration of initial 15mer peptide left after incubation and for that purpose the for 280 nm defined molar attenuation coefficient of (26.41±0.59) L*mol-1*cm-1 determined and used. The results showed a reaction of DL dithiothreitol with the less stable benzoic acid esters leading to a moderate inhibitory effect. The methylation in N1-position showed an increase in stability. The methylated and with ferrocene carboxylic acid functionalized derivative showed a complete inhibition during the timeframe of the assay. In search of a fluorescent and therefore traceable inhibitor, 4 hydroxycoumarin was used to synthesize the analogue with benzoic acid 49 and ferrocene carboxylic acid 50. Both derivatives were less stable than their analogues but exhibited the same trend of a more stable ferrocene-derived compound, which exerted a higher inhibition as well. After preparing and testing the model thioester 53 and showing an inactivation of the established inhibitor ebselen, it was concluded that the reaction with DL dithiothreitol reduces the concentration of active intact inhibitor and therefore decreases the inhibition rate during the assay. The next step was proofing the reducing agent as non-essential for the fast assay conducted in a timeframe of 5 min to circumvent the negative influence of DL dithiothreitol. By excluding every inhibition-altering part, the resulting method is the perfect tool for precise statements in relation of inhibitory activity. Then the inhibition assay was repeated for ebselen and the best out of the here introduced organometallic inhibitors 45. Both give equivalent results of a complete inhibition during the measurement. The implemented liquid chromatography coupled mass spectrometry-based assay has many advantages over the fluorescence resonance energy transfer-based assays in which all the information and insight accumulated by the evaluation of uv/vis traces and mass spectra are not available leading to wrong or deviating results regarding the inhibitory capacity of inhibitor candidates.
Es erfolgte eine elektrochemische Abscheidung von Bruschitschichten auf Titan in Gegenwart von Kristallisationsinhibitoren. Dabei wurden die Kristallisationsinhibitoren Zitronensäure, treta-Natriumdiphosphat-Decahydrat und Phytinsäure verwendet und die entstandenen Schichten mit denen ohne Inhibitorzugabe verglichen. Um das Ausmaß der Inhibierung zu verifizieren, wurde die Masse aller Schichten gemessen, welche für die Inhibition mit Zitronensäure und Phytinsäure abnahm und für Natriumdiphosphat zunahm. Die kristallographische Zusammensetzung der mit und ohne Inhibierung abgeschiedenen Schichten wurde mit Hilfe der Röntgendiffraktometrie bestimmt und zeigte, dass sich reine Bruschitschichten mit unterschiedlichem amorphem Anteil abschieden. Die daraus entstandenen Werte lieferten zugleich die Informationen über die einzelnen Kristallitgrößen innerhalb der Schichten. Über den Einfluss der Inhibitoren auf die Schichtmorphologie gaben rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen weiteren Aufschluss. Die Inhibition verursachte teils mit Rissen durchzogene Schichten, deren Kristallformationen sich von Standardelektrolyt unterschieden. Ausgewählte Proben wurden unter verschiedenen Bedingungen desinfiziert bzw. sterilisiert und nachfolgend erneut gewogen und mittels Röntgendiffraktogrammetrie und Rasterelektronenmikroskopie analysiert. Nach der Desinfektion entstanden reine Bruschitschichten, die an Masse verloren aber trotzdem die typischen Kristallformationen zeigten. Die Sterilisation führte zur Umwandlung von Bruschit in Monetit und Hydroxylapatit. Des Weiteren wurde die biologische Reaktion der Schichten auf humane fötale Osteoblasten-Zelllinien zur Überprüfung der Zellverträglichkeit ermittelt. Die entstandenen Ergebnisse waren nicht verwertbar und enthielt sehr hohe Standardabweichungen.
Durch Phosphorylierung inaktiviert GRK2 kardiale ß-Adrenorezeptoren und vermindert dadurch die Kontraktilität von neonatalen Rattenkardiomyozyten. Als natürlicher Inhibitor der GRK2 beeinflusst RKIP die Signalweiterleitung bei Stimulation von ß-Adrenorezeptoren. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass eine Überexpression von RKIP die Kontraktilität von neonatalen Rattenkardiomyozyten erhöht. Es wurde die Anzahl auftretender Spontankontraktionen vor und nach Stimulation mit Isoproterenol erfasst sowie eine zeitliche Analyse der Calciumfreisetzung und –aufnahme nach elektrischer Stimulation durchgeführt. Im unstimulierten Zustand zeigten neonatale Rattenkardiomyozyten, die Wildtyp-RKIP überexprimierten, verglichen mit der Kontrollgruppe, keine signifikanten Unterschiede hinsichtlich auftretender Spontankontraktionen. Nach Stimulation mit Isoproterenol zeigten neonatale Rattenkardiomyozyten, in denen Wildtyp-RKIP überexprimiert wurde, eine signifikant höhere Anzahl auftretender Spontankontraktionen. Eine Analyse der Calciumtransienten zeigte bei RKIP-Wildtyp überexprimierenden neonatalen Rattenkardiomyozyten eine erhöhte Calciumfreisetzung während der Systole sowie eine beschleunigte Calciumwiederaufnahme während der Diastole. Zudem wurden die RKIP-Mutanten RKIPS51V und RKIPS52V im Hinblick auf ihre Kontraktilität untersucht. Neonatale Rattenkardiomyozyten welche RKIPS51V und RKIPS52V überexprimierten zeigten weder im Hinblick auf auftretende Spontankontraktionen noch bei der Analyse der Calciumtransienten signifikante Unterschiede zur Kontrollgruppe. Da auch eine Phosphorylierung an Aminosäureposition 51 bzw. Aminosäureposition 52 ohne direkte Auswirkung auf die Kontraktilität möglich ist, wurde in einem in vitro Kinase Assay analysiert, ob neben der bekannten Phosphorylierungsstelle S153 eine weitere Phosphorylierung von RKIP durch PKA oder PKC erfolgt. Bei Einsatz der an Aminosäureposition 153 phosphorylierungsdefizienten RKIP Mutante RKIPS153A konnte keine Phosphorylierung beobachtet werden. In der vorliegenden Arbeit konnte neben einer Phosphorylierung an S153 keine weitere Phosphorylierung von RKIP durch PKC oder PKA beobachtet werden.
G protein coupled receptor kinases (GRK) phosphorylate and thereby desensitize G protein coupled receptors (GPCR) including β-adrenergic receptors (βAR), which are critical regulators of cardiac function. We identified the Raf kinase inhibitor protein (RKIP) as an endogenous inhibitor of GRK2 that leads to increased cardiac contractility via βAR activation. RKIP binds to the N-terminus (aa1-185) of GRK2, which is important for the GRK2/receptor interaction. Thereby it interferes with the GRK2/receptor interaction without interference with cytosolic GRK2 target activation. In this project, the RKIP/GRK interface was investigated to develop strategies that simulate the effects of RKIP on βAR.
RKIP binding to different isoforms of GRK expressed in the heart was analyzed by protein interaction assays using full-length and N-termini of GRK2, GRK3 and GRK5: 1-53, 54-185 and 1-185. Co-immunoprecipitation (Co-IPs) and pull-down assays revealed that RKIP binds to the peptides of GRK2 and GRK3 but not to the ones of GRK5, which suggests the existence of several binding sites of RKIP within the N-termini of GRK2 and GRK3. To analyze whether the peptides of GRK2 and GRK3 are able to simulate the RKIP mediated interference of the GRK2/receptor interaction, we analyzed the β2-AR phosphorylation in the absence and presence of the peptides. Interestingly, N-termini (aa1-185) of GRK2 and GRK3 reduced β2AR phosphorylation to a comparable extent as RKIP. In line with reduced receptor phosphorylation, the peptides also reduced isoproterenol-stimulated receptor internalization as shown by [3H] CGP-12177 radioligand binding assay and fluorescence microscopy compared to control cells. Subsequently, these peptides increased downstream signaling of β2AR, i.e. the phosphorylation of the PKA substrate phosducin. In an attempt to elucidate the mechanism behind the observed effects, Co-IPs were performed in order to investigate whether the peptides bind directly to the β2-AR and block its phosphorylation by GRK2. Indeed, GRK2 1-185 and GRK3 1-185 could bind the receptor, suggesting that this way GRK2 is prevented from inhibiting the receptor. To investigate the physiological effect of GRK2 1-185, GRK3 1-185 and GRK5 1-185, their effect on neonatal mouse cardiomyocyte contractility and hypertrophy was analyzed. After long-term isoproterenol stimulation, in the presence of GRK2 1 185 and GRK3 1-185 the cross-sectional area of the cardiomyocytes showed no significant increase in comparison to the unstimulated control cells. In addition, upon isoproterenol stimulation, GRK2 1-185 and GRK3 1-185 increased the beat rate in cardiomyocytes, mimicking RKIP while the base impedance, an indicator of viability, remained stable.
The N-termini (1-185) of GRK2 and GRK3 simulated RKIP’s function and had a significant influence on β2AR phosphorylation, on its downstream signaling and internalization, could bind β2-AR, increased beat rate and did not significantly induce hypertrophy, suggesting that they may serve as a model for the generation of new and more specific targeting strategies for GRK mediated receptor regulation.
Mechanistic Insights into the Inhibition of Cathepsin B and Rhodesain with Low-Molecular Inhibitors
(2019)
Cysteine proteases play a crucial role in medical chemistry concerning various fields reaching from more common ailments like cancer and hepatitis to less noted tropical diseases, namely the so-called African Sleeping Sickness (Human Arfican Trypanosomiasis). Detailed knowledge about the catalytic function of these systems is highly desirable for drug research in the respective areas. In this work, the inhibition mechanisms of the two cysteine proteases cathepsin B and rhodesain with respectively one low-molecular inhibitor class were investigated in detail, using computational methods. In order to sufficiently describe macromolecular systems, molecular mechanics based methods (MM) and quantum mechanical based method (QM), as well as hybrid methods (QM/MM) combining those two approaches, were applied.
For Cathespin B, carbamate-based molecules were investigated as potential inhibitors for the cysteine protease. The results indicate, that water-bridged proton-transfer reactions play a crucial role for the inhibition. The energetically most favoured pathway (according to the calculations) includes an elimination reaction following an E1cB mechanism with a subsequent carbamylation of the active site amino acid cysteine.
Nitroalkene derivatives were investigated as inhibitors for rhodesain. The investigation of structurally similar inhibitors showed, that even small steric differences can crucially influence the inhibition potential of the components. Furthermore, the impact of a fluorination of the nitroalkene inhibitors on the inhibition mechanism was investigated. According to experimental data measured from the working group of professor Schirmeister in Mainz, fluorinated nitroalkenes show – in contrast to the unfluorinated compounds – a time dependent inhibition efficiency. The calculations of the systems indicate, that the fluorination impacts the non-covalent interactions of the inhibitors with the enzymatic environment of the enzyme which results in a different inhibition behaviour.
Background:
Single drug use has not achieved satisfactory results in the treatment of prostate cancer, despite application of increasingly widespread targeted therapeutics. In the present study, the combined impact of the mammalian target of rapamycin (mTOR)-inhibitor RAD001, the dual EGFr and VGEFr tyrosine kinase inhibitor AEE788 and the histone deacetylase (HDAC)-inhibitor valproic acid (VPA) on prostate cancer growth and adhesion in vitro was investigated.
Methods:
PC-3, DU-145 and LNCaP cells were treated with RAD001, AEE788 or VPA or with a RAD-AEE-VPA combination. Tumor cell growth, cell cycle progression and cell cycle regulating proteins were then investigated by MTT-assay, flow cytometry and western blotting, respectively. Furthermore, tumor cell adhesion to vascular endothelium or to immobilized extracellular matrix proteins as well as migratory properties of the cells was evaluated, and integrin alpha and beta subtypes were analyzed. Finally, effects of drug treatment on cell signaling pathways were determined.
Results:
All drugs, separately applied, reduced tumor cell adhesion, migration and growth. A much stronger anticancer effect was evoked by the triple drug combination. Particularly, cdk1, 2 and 4 and cyclin B were reduced, whereas p27 was elevated. In addition, simultaneous application of RAD001, AEE788 and VPA altered the membranous, cytoplasmic and gene expression pattern of various integrin alpha and beta subtypes, reduced integrin-linked kinase (ILK) and deactivated focal adhesion kinase (FAK). Signaling analysis revealed that EGFr and the downstream target Akt, as well as p70S6k was distinctly modified in the presence of the drug combination.
Conclusions:
Simultaneous targeting of several key proteins in prostate cancer cells provides an advantage over targeting a single pathway. Since strong anti-tumor properties became evident with respect to cell growth and adhesion dynamics, the triple drug combination might provide progress in the treatment of advanced prostate cancer.
Ziel der vorliegenden Arbeit waren pharmakologische Untersuchungen zum antiproliferativen Effekt der beiden Laktatdehydrogenase (LDH)-Inhibitoren Natriumoxamat und Galloflavin sowie des MRP1-Inhibitors Reversan einzeln und in Kombination bei verschiedenen Sauerstoffkonzentrationen in vitro zu untersuchen. Zusätzlich wurde der antiproliferative Effekt der drei Inhibitoren mit dem antiproliferativen Effekt von 5-FU verglichen.
Das Konzept zu dieser Arbeit basiert auf Gemeinsamkeiten zwischen LDH und MRP1 in malignen Zellen. Eine ist, dass beide Moleküle von zahlreichen Tumoren überexprimiert werden. Weiter sind beide an der Ausbildung von Chemoresistenz beteiligt und beide werden auch in Hypoxie exprimiert. Zudem wird das für die Funktion von MRP1 notwendige ATP in malignen Zellen hauptsächlich mit der hyperaktiven Glykoloyse gebildet, deren Stoffumsatz auch von der LDH-Aktivität abhängig ist. Eine kombinierte Inhibition beider Zielstrukturen scheint somit geeignet zu sein, um die Proliferation maligner Zellen gezielt zu hemmen. Da in großen Teilen solider Tumoren hypoxische bzw. anoxische Bedingungen vorherrschen, wurde die Wirksamkeit der drei Inhibitoren auch bei 5 % und 1 % Sauerstoff, die als tumorphysiologisch gelten, untersucht.
Die wichtigsten Ergebnisse aus dieser Arbeit sind, dass die beiden LDH-Inhibitoren Natriumoxamat und Galloflavin und der MRP1-Inhibitor Reversan einen antiproliferativen Effekt bei kolorektalen Karzinomzellen auslösen, der auch für tumorphysiologische Sauerstoffkonzentrationen nachzuweisen war. So verringerte sich durch Natriumoxamat bzw. Galloflavin der Anteil vitaler Zellen um bis zu 45 % und durch Reversan um bis zu 60 % bei 5 % und 1 % Sauerstoff im Vergleich zur unbehandelten Kontrolle.
Auch unterschiedliche Kombination aus Natriumoxamat, Galloflavin und Reversan führten zu einer Steigerung des antiproliferativen Effektes, der auch immer bei tumorphysiologischen Konzentrationen nachzuweisen war. Den stärksten antiproli-ferativen Effekt wies die Dreifachkombination aus Galloflavin, Natriumoxamat und Reversan auf. So verringerte sich der Anteil vitaler Zellen bei 1 % Sauerstoff durch diese Kombination auf bis zu 28 % bei vier der fünf kolorektalen Karzinomzelllinien. Die Dreifachkombination wies einen gleichstarken bzw. stärkeren antiproliferativen Effekt auf als das Chemotherapeutikum 5-FU und zwar ebenfalls bei 5 % und 1 % Sauerstoff.
Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit zum antiproliferativen Effekt von Natriumoxamat, Galloflavin (beides LDH-Inhibitoren) und Reversan (MRP1-Inhibitor) in vitro lassen den Schluss zu, dass das Konzept der Arbeit, einen antiproliferativen Effekt auch bei tumorphysiologischen Sauerstoffkonzentrationen zu induzieren, grundsätzlich bestätigt wurde. Auch löste die gemeinsame Hemmung von LDH und MRP1 einen teilweise stärkeren antiproliferativen Effekt aus als 5-FU. Weitere Untersuchungen sind aber ohne Frage nötig, um die molekularen Interaktion zwischen LDH und MRP1 sowie ihrer Inhibition im Detail zu verstehen.
Das Raf kinase inhibitor protein (RKIP) ist ein Kinaseregulator, der im Herzen eine Präferenz für die G-Protein-gekoppelte Rezeptorkinase 2 (GRK2) zeigt. Die Regulation erfolgt durch direkte Interaktion beider Proteine, wird durch eine PKC-Phosphorylierung an Serin 153 des RKIP induziert und inhibiert die GRK2-vermittelte Phosphorylierung von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCR). Die GRK2 desensitiviert GPCR und eine Hemmung der GRK2-Aktivität wirkt sich so positiv auf die Ansprechbarkeit von GPCR aus. Die \textbeta-adrenergen Rezeptoren (\textbeta AR) sind im Herzen maßgeblich an der Regulation der kardialen Kontraktilität beteiligt. Erste Zusammenhänge zwischen der RKIP-Expression und der kontraktilen Antwort von Kardiomyozyten wurden bereits in einer früheren Arbeit untersucht und bestätigt. Sie begründen die Fragestellung nach Effekten einer verstärkten RKIP-Expression auf \textbeta-adrenerge Rezeptorsignale, Herzfunktion und die Entwicklung der Herzinsuffizienz.
Im Rahmen dieses Projektes konnten die Effekte des RKIP auf \textbeta-adrenerge Signalwege detaillierter beschrieben werden. Dabei erwies sich die inhibitorische Funktion auf die GRK2 als rezeptorspezifisch ohne Einfluss auf zytosolische Angriffspunkte der GRK2 zu nehmen. Verstärkte \textbeta-adrenerge Signale zeigten sich in neonatalen Kardiomyozyten an Hand der erhöhten cAMP-Level, PKA-Aktivität, sowie Kontraktionsrate und Relaxationsgeschwindigkeit nach \textbeta-adrenerger Stimulation. Im Einklang damit konnte eine erhöhte PKA- und CaMKII-Aktivität und eine positive Inotropie in transgenen Tieren, mit herzspezifischer Überexpression von RKIP, beobachtet werden. Durch Messung des Calcium-\textit{Cyclings} in Kardiomyozyten konnte der Phänotyp auf eine verbesserte Rückführung des Calciums, einer daraus resultierenden erhöhten Calciumbeladung des sarkoplasmatischen Retikulums und einem gesteigerten systolischen Calciumspiegel, zurückgeführt werden. Die Untersuchung der Phosphorylierung von Calciumkanälen, L-Typ-Calciumkanal und Ryanodin-Rezeptor 2, die den einwärtsgerichteten Calciumstrom vermitteln konnte ihre Beteiligung an der positiv inotropen Wirkung ausschließen.
Neben dem kontraktilen Phänotyp konnten zusätzliche protektive Effekte beobachtet werden. In Modellen, die eine chronische \textbeta-adrenerge Stimulation imitieren, bzw. eine Nachlasterhöhung induzieren konnte eine Verringerung der interstitiellen Fibrose und der damit assoziierten Marker, gezeigt werden. Mit Hilfe von \textit{in vivo} EKG-Messungen konnte die Neigung zur Ausbildung von Arrhythmien untersucht werden. Auch im Hinblick auf die Anzahl der Extrasystolen waren RKIP-transgene Tiere geschützt. Infolge der Untersuchung der Phänotypen in Deletionshintergründen der einzelnen \textbeta AR-Subtypen (\textbeta\textsubscript{1}AR, \textbeta\textsubscript{2}AR) konnte die positive Inotropie mit den spezifischen Signalwegen des \textbeta\textsubscript{1}AR assoziiert und die protektiven Effekte gegenüber den Umbauprozessen und der Arrhythmieneigung dem \textbeta\textsubscript{2}-adrenergen Signalen zugeschrieben werden. Zusätzlich bestätigt sich eine besondere Rolle der G\textalpha\textsubscript{i}-Kopplung des \textbeta\textsubscript{2}AR, durch die er einen hemmenden Einfluss auf die \textbeta\textsubscript{1}AR-Singale nehmen kann.
Die Untersuchung einiger Marker, die eine physiologische von einer pathologischen Hypertrophie unterscheiden, konnte das in den RKIP-transgenen Mäusen auftretende Wachstum der Kardiomyozyten als kompensatorische und physiologische Hypertrophie charakterisieren. Zusammengenommen weisen diese Ergebnisse auf eine ausgeglichene Aktivierung der beiden Rezeptoren hin, die sich gegenseitig regulieren und durch die Inhibition der GRK2 in ihrer Anregbarkeit erhalten bleiben. Mittels einer AAV9-vermittelten Gentherapie konnte das therapeutische Potential dieses Prinzips weiter bestätigt werden, da es die prominentesten Veränderungen während der Herzinsuffizienzentwicklung, wie die Verschlechterung der linksventrikulären Funktion, die Dilatation des linken Ventrikels, die Ausbildung von Lungenödemen und interstitieller Fibrose sowie die Expression von Herzinsuffizienz-assoziierten Genen, verhindern konnte. Auch konnten die Auswirkungen der Deletion des RKIP, die sich durch eine beschleunigte und gravierendere Herzinsuffizienzentwicklung auszeichnet, durch Reexpression von RKIP verhindert werden.
Diese Arbeit kann somit zeigen, dass das RKIP eine ausgeglichene Verstärkung von \textbeta-adrenergen Signalwegen verursacht, die positiv inotrop und gleichzeitig protektiv wirkt. Dieses Wirkprinzip könnte ferner eine Strategie zur Erhöhung der Kontraktilität in der Herzinsuffizienz darstellen, die entgegen etablierter Theorien auf der Stimulation beider \textbeta AR basiert.
Das Multiple Myelom (MM) ist eine durch monoklonale Vermehrung terminal differenzierter Antikörper-produzierender B-Lymphozyten (Plasmazellen) im Knochenmark charakterisierte maligne Krankheit, die sich v.a. in osteolytischen Knochendestruktionen, hämatopoetischer und Niereninsuffizienz äußert. Verbesserte Therapieansätze wie die Hochdosis-Chemotherapie mit Melphalan und anschließender autologer Stammzelltransplantation sowie die Einführung neuer pharmakologischer Substanzklassen (Proteasom-Inhibitoren, Cereblon-bindende Thalidomidderivate) führten zu einer Verlängerung der durchschnittlichen Überlebenszeit, für die meisten der Patienten ist die Erkrankung jedoch derzeit unheilbar. Die Erforschung neuer potenzieller therapeutischer Angriffspunkte auf Grund pathobiologischer Erkenntnisse bleibt daher unabdingbar. Ein Ansatz zur Verbesserung des Verständnisses der Pathogenese ist die funktionelle, molekulare und genetische Analyse des Signalnetzwerkes im MM. Im Zusammenhang mit diesem Konzept wurde entdeckt, dass wachstums-regulierende Signalwege in MM Zellen aktiviert oder dereguliert sind und zum Überleben und der Proliferation des Tumors beitragen. So konnte beispielsweise von unserer Arbeitsgruppe bereits gezeigt werden, dass onkogenes Ras essentiell zum Überleben der MM Zellen beiträgt. Da Ras derzeit mangels spezifischer Inhibitoren pharmakologisch nicht angreifbar ist, stellen weitere funktionelle Bestandteile des Signalweges eine potenzielle therapeutische Zielstruktur dar. Während die Blockade von MEK1/2 in MM Zellen keinen Einfluss auf das Überleben hatte, konnte durch die Blockade von Raf in ersten Tests unserer Arbeitsgruppe Apoptose hervorgerufen werden. Aus diesem Grund habe ich in der vorliegenden Arbeit zur Evaluation eines neuen Therapieansatzes die Rolle der Raf-abhängigen Signaltransduktion eingehend untersucht. Als Grundlage diente dabei die Hypothese, dass die Raf-Kinasen entscheidende Effektoren der durch onkogenes Ras vermittelten apoptotischen Effekte darstellen. In einem ersten Schritt konnte ich nachweisen, dass alle drei Raf-Isoformen (A-, B- und C-Raf) in humanen MM Zelllinien und in primären MM Zellen aktiviert sind. Mittels shRNA-vermittelter, Isoform-spezifischer Raf-Knockdown-Experimente konnte ich zeigen, dass nur ein simultaner Knockdown aller Isoformen, d.h. ein Pan-Raf-Knockdown, zu einer De-Phosphorylierung von MEK1/2 und ERK1/2 führte. Dieser Versuch ließ sich mittels pharmakologischer Raf-Inhibition, bei der ebenfalls nur eine Pan-Raf-Blockade zu einer Herunterregulation von MEK1/2 und ERK1/2 in MM Zellen führte, bestätigen. Das MEK/ERK-Modul stellte somit einen hervorragenden Surrogat- und Biomarker für die Pan-Raf-Aktivität dar. Im Gegensatz zur Blockade des MEK/ERK-Moduls führte eine Hemmung der Pan-Raf-Aktivität mittels shRNA oder pharmakologischer Inhibitoren in allen untersuchten Zelllinien und in der Mehrheit der primären MM Zellen zu einer starken Induktion von Apoptose. Da das Ansprechen auf eine Pan-Raf-Blockade nicht mit dem Ras-Mutationsstatus korrelierte, könnten die Raf-Kinasen eine von onkogenem Ras unabhängie Qualität als therapeutische Zielstruktur aufweisen. Zur Untersuchung möglicher MEK/ERK-unabhängiger Effektormechanismen der Pan-Raf-Inhibition habe ich die mRNA-basierten Genexpressionsprofile von INA-6 Zellen nach pharmakologischer Pan-Raf- oder MEK-Inhibition verglichen. Dabei führte die Pan-Raf-Inhibition zu einer Regulation von wesentlich mehr Genen, wobei sich auch die Art der regulierten Gene unterschied, darunter Gene mit tumorrelevanten Funktionen wie Regulation von Proliferation, Zellzyklus und Apoptose. Für eine dieser Gengruppen, die Gruppe der PI3K-abhängigen, mTOR-assoziierten Gene, konnte ich eine Regulation auch auf der Proteinebene nachweisen: die Phosphorylierungen von mTOR, p70S6K, Rb und AKT und die Expression von CyclinD1 und PDK1 waren nach Pan-Raf-Inhibition, nicht jedoch nach MEK-Blockade herunterreguliert. Dieses Ergebnis deutet auf eine Ko-Regulation der PI3K-abhängigen Signaltransduktion durch die Raf-kinasen hin. Mittels spezifischer PI3K-Inhibitoren ließ sich sowohl bei der Regulation der untersuchten Proteine als auch bei der Induktion von Apoptose eine deutliche Verstärkung der Pan-Raf-Inhibition in HMZL und in primären Zellen erzielen. Zusammengefasst zeigt diese Arbeit, dass die Pan-Raf-Blockade eine neue Therapiemöglichkeit darstellt, die durch Kombination mit einer PI3K/AKT-Inhibition noch verstärkt werden kann.