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Notch Proteine gehören zu einer Familie hochkonservierter Transmembranrezeptoren, die bei Entwicklungsprozessen, beispielsweise im hämatopoetischen System, eine bedeutende Rolle spielen. So konnte eine Beteiligung von Notch und seinen Liganden bei der Differenzierung lymphatischer Zellen im Knochenmark, Thymus sowie in peripheren Organen gezeigt werden. Insbesondere unterdrückt Notch1 nach Ligandenbindung die Bildung von B-Zellen im Thymus und fördert stattdessen die Entwicklung von T-Zellen. Durch Aktivierung der γ-Sekretase wird die intrazelluläre Domäne von Notch1 freigesetzt und transloziert in den Kern. Dort wirkt Notch1 zusammen mit Proteinen der CSL Familie als Transkriptionsfaktor und reguliert so die Expression von Zielgenen wie beispielsweise HES1. Weiterhin kann die Signaltransduktion von Notch1 im Zytosol durch Wechselwirkung mit Proteinen wie Numb oder Deltex1 moduliert werden. Angesichts der Fähigkeit, die Proliferation unreifer Zellen aufrecht zu erhalten, kann eine aberrante Expression von Notch1 zur Entstehung von Neoplasien beitragen. Numb wird eine wichtige Rolle in der Regulation von Notch1 zugeschrieben, doch seine genaue Funktion in der T-Zellentwicklung ist unklar. Die Klonierung aller vier in der Ratte exprimierten Isoformen erlaubte erstmals deren detaillierte Charakterisierung. Die differentielle Expression und die preferentielle Interaktion von Numb i/o mit Notch1 deuten darauf hin, dass den verschiedenen Splice-Varianten nicht nur in der T-Zellentwicklung sondern auch in der Kontrolle von Notch1 unterschiedliche Funktionen zukommen. Diese Schlussfolgerung wird durch eine spezifische Expression der Numb Isoformen in humanen T-ALL Zelllinien weiter unterstützt. Transgene Ratten welche die intrazelluläre Domäne von Notch1 (N1IC) unter der Kontrolle des proximalen lck-Promoters überexprimieren (NICA), sind ein geeignetes Werkzeug, um die Rolle von Notch1 für die Genexpression und die Lymphomgenese zu untersuchen. Junge NICA-Ratten exprimieren N1IC spezifisch in Thymozyten, nicht jedoch in peripheren T-Zellen. In Folge dessen kommt es zu einer starken Expression bekannter Notch1 Zielgene, unter anderem dem präTα Rezeptor. Dies wiederum führt zur Substitution klassischer T-Zellrezeptor-Komplexe durch den präT-Zellrezeptor, was in adulten Tieren zur Entwicklung von thymischen Lymphomen beiträgt. Die Lymphomzellen in NICA-Ratten exprimieren das N1IC-Transgen sowohl im primären Tumor als auch nach Infiltration peripherer Organe. Dabei könnte die beobachtete Hochregulation von Notch3 ein möglicher Mechanismus der Tumorgenese in NICA-Ratten darstellen. Um die Ursache der Lymphomgenese besser zu verstehen, wurde eine genomweite Expressionsanalyse der Tumore mittels SAGE und Affymetrix DNA-Chips durchgeführt. Dabei wurden zahlreiche potentiell bedeutende Gene identifiziert, welche bei der Notch1-vermittelten Lymphomgenese eine Rolle spielen könnten. Die Beobachtung, dass ein Teil dieser Gene auch in humanen T-ALL-Zelllinien verändert ist, unterstreicht deren Bedeutung auch für die Pathogenese des Menschen. Eines der in NICA-Lymphomen am stärksten veränderten Gene wurde bislang weder in der Literatur noch in Sequenzdatenbanken beschrieben. Dieses von uns als Nip1 bezeichnete Protein ähnelt einem Enzym aus dem Isoprenoid-Stoffwechsel und ist vor allem im Thymus exprimiert. Ein anderes interessantes Kandidatengen ist CD30, ein Transmembran-Rezeptor welcher bei Hodgkin Lymphomen beschrieben wurde. Neben T-ALL wurde auch bei Hodgkin Lymphomen eine wichtige Rolle von Notch1 berichtet. Dabei könnte dessen hohe Expression im Zusammenhang mit der Transformation und dem Verlust der B-Zell-Identität dieser Tumore stehen. Um dies näher zu untersuchen, wurde Notch1 mittels RNAi bzw. durch Überexpression des negativen Regulators Deltex1 in Hodgkin-Zelllinien inaktiviert. Die hierbei erhaltenen Ergebnisse unterstützen die These, dass nach Repression der Notch1 Aktivität die Expression B-Zellspezifischer Marker wieder gewonnen werden kann. Zusammengefasst deuten die Ergebnisse dieser Arbeit auf eine bedeutende Funktion von Notch1 bei der T-Zellentwicklung und der Entstehung von Lymphomen hin. Dabei scheint insbesondere die Interaktion mit Proteinen wie Numb und Deltex1 sowie die Regulation der Genexpression wichtig zu sein. Die gewonnenen Daten könnten in Zukunft einen neuen Ansatzpunkt zur Entwicklung verbesserter Strategien zur Therapie von Krebserkrankungen des hämatopoetischen System bilden.
To analyze the role of protein kinase B(PKB)on developmental and functional aspects of T cells, we have generated transgenic mouse lines expressing a constitutively active form of PKB (myrPKB) in early stages of T cell development.Peripheral CD4+ T cells from PKB tg mice are hyperreactive, more efficient in producing th1 and th2 cytokines and show faster and CD28 co-stimulation independent cell cycle progression.Interestingly PKB tg T cells are resistant to CsA treatment in proliferation and cytokine production.Further analysis show PKB tg CD4+ T cells have a drastically reduced nuclear translocation of NFAT proteins and this is due to a direct interaction between PKB and NFAT. To study whether the negative regulatiopn of NFATs by PKB affects T cell development, we analyzed double tg mice expressing both, a constitutively active version of calcineurin (dCam) and myrPKB. dCam tg mice have a severe block in thymocyte development at the DN3 stage.But in the dCam/PKB double tg mice this developmental block is significantly rescued.This rescue of thymocyte development by PKB is due to the expression of RAG1 and subsequent TCRb chain expression. CsA treatment of neonatal thymic lobes from dCam mice restores normal thymocyte development, indicating involvement of NFATs in the severe block in dCam thymocyte development.Confocal studies clearly established that compared to dCam DN cells there is a significant reduction in the nuclear levels of NFATc1 and NFATc3 in dCam/PKB cells.Downregulation of nuclear NFAT levels by myrPKB thus seems to be an essential parameter in dCam cells to proceed with normal differentiation. In summary, the data from PKB tg peripheral CD4+ T cells and dCam/PKB double tg thymocytes clearly establish PKB as an important modulator of T cell development and function and PKB as a novel negative regulator of NFAT activation.
We examined the regulation of NFATc1 in different lymphomas and observed an inversed correlation between the methylation status and expression of NFATc1. Our data demonstrate that aberrant DNA methylation associated with chromatin remodeling within nfatc1 locus is a major mechanism for the repression of NFATc1 expression, suggesting that the DNA methylation-mediated transcriptional silencing of NFATc1 may be a critical event in the tumorogenesis of ALCLs and cHLs. Furthermore, the DNA methylation of human nfatc1 promoter region could be used as a novel biomarker of tumor progression. Our results indicate a close link between the loss of immunoreceptor signaling and NFATc1 expression in human lymphomas. For both ALCLs and cHLs, defects in immunoreceptor signaling have been described which result in a loss of receptor-mediated gene expression programs (Schwering et al., 2003; Bonzheim et al., 2004; Marafioti et al., 2004). In T cells, one indicator gene of these programs appears to be the nfatc1 gene whose expression is controlled by TCR signals (Chuvpilo et al., 2002a). In contrast, in T cells NFATc1 expression is unaffected by TCR signals, and NFATc2 was found to be expressed at normal levels in ALCLs and cHLs (L.K., unpubl. data). Moreover, the activity of NF-kappaB factors which can bind to certain NFAT binding sites and share a distantly-related DNA binding domain with NFATs is strongly elevated in cHL cells (Bargou et al., 1997; Hinz et al., 2001; Hinz et al., 2002) suggesting that NFATs and NF-kappaBs exert very different effects on generation and maintenance of Hodgkin’s lymhomas. However, it should be mentioned that in Burkitt’s and further B cell lymphomas in which NFATc1 proteins are strongly expressed and controlled by receptor signals (Kondo et al., 2003), they could exert a promoting function in tumor development. The genes of p53 family members p63 and p73 are prominent examples for mammalian genes whose products can act both as oncoproteins and tumor suppressor genes (Hibi et al., 2000; Stiewe and Putzer, 2002), and it is likely that more genes exist which encode both tumor suppressors and oncoproteins. It remains to be shown whether the nfatc1 gene is one of them.