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Die Herzhypertrophie ist eine der bedeutendsten und schwerwiegendsten klinischen Komplikationen vieler kardiovaskulärer Erkrankungen. Sie stellt eine Anpassungsreaktion des Herzens an erhöhte kardiale Belastungen dar. Jedoch kommt es dabei an einem nicht definierten Punkt der Hypertrophie- Genese zu einer Verselbstständigung der daran beteiligten Mechanismen und die Hypertrophie ist progredient. Durch das Versagen reaktiver Kompensationsmöglichkeiten kommt es durch eine relative Koronarinsuffizienz vermehrt zu ischämischen Ereignissen und einer daraus resultierenden erhöhten Mortalität. Das Interesse viel versprechende Therapieansätze aufzuspüren ist bei Medizinern und Pharmazeuten immens groß, da die Zahl betroffener Patienten von Tag zu Tag wächst. Um die Präventionsmöglichkeiten der Herzhypertrophie zu verbessern, ist es daher essentiell, ihren molekularen und biochemischen Entstehungsmechanismus und dessen Aufrechterhaltung zu verstehen. Die vorliegende Arbeit beschäftigte sich mit dem Einfluss mechanischer Dehnung und anderer Stressoren, wie beispielsweise Phorbol-Ester an der Entstehung der kardialen Hypertrophie im humanen Myokard. Dabei wurden einige Proteinkinasen möglicher beteiligter Signaltransduktionskaskaden untersucht und besonderes Augenmerk auf den Einfluss der MAP- Kinasen gelegt. Zum ersten Mal wurde für derartige Untersuchungen mit humanem atrialen Herzmuskelgewebe gearbeitet, das im Rahmen von kardiochirurgischen Operationen gewonnen wurde. Das Modell der isolierten und intakten Muskelfaser erwies sich in der Versuchsdurchführung als überaus geeignet, da es zum einen eine elektrische Stimulation der humanen Herzmuskelstreifen ermöglichte und es zum anderen die Gelegenheit bot, dehnungsabhängige Versuche an den Muskelstreifen durchzuführen. Dabei wurden mehrere Versuchsgruppen gebildet, welche sich vor allem im Dehnungsgrad und der Versuchszeit unterschieden. Als weiteres Unterscheidungsmerkmal wurden einige Muskelstreifen- Gruppen sowohl elektrisch stimuliert und somit zur isometrischen Kontraktion gebracht und zusätzlich mechanisch gedehnt während bei anderen Muskelstreifen nur der Einfluss der mechanischen Dehnung ohne zusätzliche elektrische Stimulation untersucht wurde. Die Dehnungsgrade wurden in drei Stufen unterteilt: in den ungedehnten Zustand, den optimal vorgedehnten Zustand und den Überdehnungszustand. Die Versuchszeit differierte zwischen zehnminütigen bis hin zu sechzigminütigen Versuchen. Die dehnungsabhängigen Veränderungen der, an den untersuchten Signaltransduktionswegen beteiligten Proteinkinasen wurden in Western Blot- Analysen gezeigt. Dabei erwies sich die Stress- aktivierte p38 MAP- Kinase als ausgesprochen dehnungsabhängig im humanen Myokard. Speziell auf die Überdehnungsreize reagierte die p38 MAP- Kinase mit einer signifikanten Aktivitätssteigerung. Da es derzeit noch widersprüchliche Angaben über die Beteiligung der aktivierten p38 MAP- Kinase an der Entstehung der Herzhypertrophie gibt, handelt es sich bei den vorliegenden Ergebnissen um relevante neue Aspekte im Bereich des humanen kardialen Gewebes. Als weiteres wichtiges Ergebnis der vorliegenden Arbeit gilt die dehnungsinduzierte Aktivierung der p70S6- Kinase im humanen Myokard. Da sie eine wichtige Rolle in der Regulation der Transkription und besonders der Translation von Proteinen spielt und somit einen entscheidenden Einfluss auf die Proteinexpression in der Zelle hat, kann die p70S6-Kinase vermutlich als wichtiger Baustein in der Entstehung der Herzhypertrophie angesehen werden. Die Auswirkungen der mechanischen Dehnung auf die Aktivierung der ERKs 1/2, die in bereits veröffentlichten Untersuchungen an Kardiomyozyten als eindeutig Hypertrophie auslösend beschrieben wurden, waren in der vorliegenden Arbeit am humanen Herzmuskelgewebe nicht verifizierbar.
Kationenkanäle der Canonical Transient Receptor (TRPC)-Familie spielen eine wichtige Rolle in der pathologischen Herzhypertrophie. Neben anderen Isoformen besitzt TRPC4 die Potenz, den strukturellen und funktionellen Umbau des Herzens im Rahmen der pathologischen Hypertrophie über Ca2+-Transienten zu bestärken. TRPC4-Kanäle sind nicht-selektive Kationenkanäle, die für Na+ und Ca2+ durchlässig sind. Sie setzen sich in der Plasmamembran zu Homo- oder Heterotetrameren zusammen. Die TRPC4-Kanalaktivität wird durch die Stimulation von Gq-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCR) reguliert und führt zu einem Ca2+-Einstrom, der für die Aktivierung von Calcineurin und des nuclear factor of activated T-cells (NFAT) notwendig ist. Eine weitere Aktivierungsform lässt sich über die Entleerung von intrazellulären Ca2+-Speichern (SOCE) aus dem Sarkoplasmatischen Retikulum (SR) nachweisen. Die funktionelle Wirkung des TRPC4 ist von der Expression der beiden Splice-Varianten TRPC4α und TRPC4β abhängig.
Um diese funktionelle Abhängigkeit der Splice-Variante C4β genauer zu charakterisieren, wurden in der vorliegenden Studie zytosolische Ca2+-Signale und deren Aktivierungsmechanismen analysiert. Für die Untersuchungen wurden neonatale Rattenkardiomyozyten (NRC) verwendet, die mit adenoviralen Vektoren infiziert wurden und TRPC4beta (Ad-TRPC4β), TRPC4alpha (Ad-TRPC4α) und beta-Galaktosidase (Ad-ßgal) als Kontrolle exprimierten. Es erfolgte eine Auswertung der Ca2+-Transienten, in der gezeigt werden konnte, dass TRPC4β den Ca2+-Einstrom in schlagenden Kardiomyozyten beeinflusst. Dies machte sich in einer erhöhten Ca2+-Amplitude unter basalen Bedingungen bemerkbar. Ebenfalls konnte deutlich gemacht werden, dass eine Ca2+-Entleerung des SR TRPC4β als sogenannten SOC (speicher-regulierten Kanal, store-operated channel) aktiviert. Außerdem reagierten TRPC4β-infizierte NRCs mit einem gesteigerten Ca2+-Maximalspitzenwert (peak) unter Stimulation mit dem GPCR-Agonisten Angiotensin II. Die Amplitude der Ca2+-Transienten bei Überexpression von Ad-TRPC4β war im Vergleich zur Ad-ßgal-Kontrollgruppe deutlich gesteigert. Darüber hinaus war der Abfall der Ca2+-Transienten der TRPC4β-exprimierenden Zellen beschleunigt. Dies lässt einen kompensatorischen Mechanismus vermuten, mit dem Ziel, einer Ca2+-Überladung der Zelle durch den TRPC4β-induzierten Ca2+-Einstrom entgegenzuwirken. In zusätzlichen Experimenten zeigte sich TRPC4β ebenfalls deutlich sensitiver gegenüber der Angiotensin II-Stimulation als TRPC4α. Weiterführende Untersuchungen ließen erkennen, dass TRPC4β, im Gegensatz zu anderen TRPC-Isoformen, keinen pro-hypertrophen, sondern vielmehr einen pro-apoptotischen Einfluss auf Kardiomyozyten ausübt.
Zusammenfassend zeigt die vorliegende Studie, dass eine erhöhte Aktivität der Splice-Variante TRPC4β mit kritischen Veränderungen zytosolischer Ca2+-Signale verbunden ist und somit ein entscheidender Faktor für die Entstehung und Progression kardialer Pathologien sein könnte.
Kationenkanäle der Canonical Transient Receptor (TRPC)-Familie spielen eine wichtige Rolle in der pathologischen Herzhypertrophie. Neben anderen Isoformen besitzt TRPC4 die Potenz, den strukturellen und funktionellen Umbau des Herzens im Rahmen der pathologischen Hypertrophie über Ca2+-Transienten zu bestärken. TRPC4-Kanäle sind nicht-selektive Kationenkanäle, die für Na+ und Ca2+ durchlässig sind. Sie setzen sich in der Plasmamembran zu Homo- oder Heterotetrameren zusammen. Die TRPC4-Kanalaktivität wird durch die Stimulation von Gq-Protein-gekoppelten Rezeptoren (GPCR) reguliert und führt zu einem Ca2+-Einstrom, der für die Aktivierung von Calcineurin und des nuclear factor of activated T-cells (NFAT) notwendig ist. Eine weitere Aktivierungsform lässt sich über die Entleerung von intrazellulären Ca2+-Speichern (SOCE) aus dem Sarkoplasmatischen Retikulum (SR) nachweisen. Die funktionelle Wirkung des TRPC4 ist von der Expression der beiden Splice-Varianten TRPC4α und TRPC4β abhängig.
Um diese funktionelle Abhängigkeit der Splice-Variante C4β genauer zu charakterisieren, wurden in der vorliegenden Studie zytosolische Ca2+-Signale und deren Aktivierungsmechanismen analysiert. Für die Untersuchungen wurden neonatale Rattenkardiomyozyten (NRC) verwendet, die mit adenoviralen Vektoren infiziert wurden und TRPC4beta (Ad-TRPC4β), TRPC4alpha (Ad-TRPC4α) und beta-Galaktosidase (Ad-ßgal) als Kontrolle exprimierten. Es erfolgte eine Auswertung der Ca2+-Transienten, in der gezeigt werden konnte, dass TRPC4β den Ca2+-Einstrom in schlagenden Kardiomyozyten beeinflusst. Dies machte sich in einer erhöhten Ca2+-Amplitude unter basalen Bedingungen bemerkbar. Ebenfalls konnte deutlich gemacht werden, dass eine Ca2+-Entleerung des SR TRPC4β als sogenannten SOC (speicher-regulierten Kanal, store-operated channel) aktiviert. Außerdem reagierten TRPC4β-infizierte NRCs mit einem gesteigerten Ca2+-Maximalspitzenwert (peak) unter Stimulation mit dem GPCR-Agonisten Angiotensin II. Die Amplitude der Ca2+-Transienten bei Überexpression von Ad-TRPC4β war im Vergleich zur Ad-ßgal-Kontrollgruppe deutlich gesteigert. Darüber hinaus war der Abfall der Ca2+-Transienten der TRPC4β-exprimierenden Zellen beschleunigt. Dies lässt einen kompensatorischen Mechanismus vermuten, mit dem Ziel, einer Ca2+-Überladung der Zelle durch den TRPC4β-induzierten Ca2+-Einstrom entgegenzuwirken. In zusätzlichen Experimenten zeigte sich TRPC4β ebenfalls deutlich sensitiver gegenüber der Angiotensin II-Stimulation als TRPC4α. Weiterführende Untersuchungen ließen erkennen, dass TRPC4β, im Gegensatz zu anderen TRPC-Isoformen, keinen pro-hypertrophen, sondern vielmehr einen pro-apoptotischen Einfluss auf Kardiomyozyten ausübt.
Zusammenfassend zeigt die vorliegende Studie, dass eine erhöhte Aktivität der Splice-Variante TRPC4β mit kritischen Veränderungen zytosolischer Ca2+-Signale verbunden ist und somit ein entscheidender Faktor für die Entstehung und Progression kardialer Pathologien sein könnte.
b-adrenergic receptors (b-ARs) participate strongly in the development of cardiac hypertrophy and human heart failure. Stimulation of b-adrenergic receptors with catecholamines as well as cardiac overexpression of b1-ARs or of Gas-proteins in transgenic mice induces cardiac hypertrophy. However, direct activation of their downstream targets, such as adenylyl cyclase (AC) or protein kinase A do not promote a significant degree of cardiac hypertrophy. These findings suggest that additional events may occur and that these events require Gas-protein activation. A hypertrophic pathway involving Gaq-protein coupled receptors has recently been described. Upon activation of Gaq-coupled receptors Gbg-subunits are released from Gaq and bind directly to the activated Raf/Mek/Erk cascade. Direct interaction between bg-subunits and activated Erk1/2 leads to an additional autophosphorylation of Erk2 at threonine 188, which mediates cardiac hypertrophy. Murine hearts, as well as isolated cardiomyocytes present an increase in Erk2Thr188-phosphorylation upon b-AR activation. Similarly overexpression of phosphorylation deficient Erk2 mutants (Erk2T188S and Erk2T188A) reduces b-AR mediated cardiomyocyte hypertrophy. Increase in left ventricular wall thickness, fibrosis and up-regulation of natriuretic peptide synthesis, which are physiological features for cardiac hypertrophy, are strongly inhibited in transgenic mice with a cardiac expression of Erk2T188S after two weeks of sustained isoproterenol treatment. It could further be shown in this work that b-AR mediated cardiac hypertrophy requires two distinct pathways initiated by Gs-protein activation: the canonical phosphorylation of Erk1/2 via adenylyl cyclase and the direct interaction of released bg-subunits with activated Erk1/2. Coincidence of both events leads to Erk2Thr188-phosphorylation, which activates then different transcription factors responsible for cardiac hypertrophy. Sequestration of bg-subunits by overexpression of the C-terminus of GRK2 bark-ct and inhibition of adenylyl cyclase efficiently reduced the hypertrophic response to isoproterenol, whereas direct activation of AC by forskolin failed to induce Erk2Thr188-phosphorylation and cardiomyocyte hypertrophy. These findings may help to develop new therapeutic strategies for the prevention of cardiac hypertrophy and maladaptive remodeling of the heart.
Bis heute ist es mit keiner in der klinischen Routine verwendeten Untersuchungsmethode möglich, nichtinvasiv pathologische von physiologischer linksventrikulärer Herzhypertrophie zu unterscheiden. Mittels Strain Rate Imaging gelang es uns, über die Erfassung der regionalen systolischen und diastolischen myokardialen Funktion, linksventrikuläre Herzhypertrophie von Athleten und linksventrikuläre Herzhypertrophie von Hypertonikern zu unterscheiden. Wir konnten sowohl radial als auch longitudinal in Systole und Diastole eine signifikant schlechtere regionale myokardiale Funktion auf Seiten der Hypertonikern im Vergleich zu den Athleten feststellen. Strain Rate Imaging bietet eine verläßliche, kostengünstige und ubiquitär verfügbare Methode für die nichtinvasive Differentialdiagnose linksventrikuläre Herzhypertrophie.
Die Mitogen-aktivierten Proteinkinasen ERK1/2 (extrazellulär Signal-regulierte Kinase 1 und 2) sind die Effektorkinasen der Raf/MEK/ERK-Kaskade und verknüpfen externe Stimuli mit der intrazellulä-ren Antwort, wodurch sie wichtige Schlüsselmoleküle der zellulären Signaltransduktion darstellen. Zahlreiche Studien belegen die Beteiligung von ERK1/2 an der Entstehung pathologischer kardialer Hypertrophie. Genauso ist bekannt, dass ERK1/2 anti-apoptotische, kardioprotektive Eigenschaften besitzen.
So führte, wie in dieser Arbeit gezeigt, eine Hemmung der katalytischen ERK1/2-Aktivität durch den MEK-Inhibitor PD98059 zu einer signifikanten Reduktion der hypertrophen Antwort von Kardiomy-ozyten auf den Stimulus Phenylephrin. Dies war allerdings mit einem Anstieg der Apoptoserate in diesen Zellen verbunden, wodurch sich eine Hemmung der totalen ERK-Aktivität als nicht praktika-bel für die Behandlung pathologischer kardialer Hypertrophie herauskristallisierte. In früheren Un-tersuchungen wurde eine Autophosphorylierung von ERK an Threonin 188 (murines ERK2) entdeckt und als Trigger für ERK1/2-vermitteltes hypertrophes Wachstum identifiziert. Diese Autophospho-rylierung steuert die nukleäre Lokalisation von ERK1/2 und ermöglicht so die Aktivierung nukleärer ERK-Zielproteine sowie hypertrophes Wachstum. Eine Interferenz mit der ERKThr188-Phosphorylierung konnte schon in vitro und in vivo erfolgreich einer pathologischen Hypertrophie entgegenwirken, ohne Einfluss auf physiologisches Herzwachstum oder die zytosolischen, anti-apoptotischen Effekte von ERK1/2 zu nehmen. Einen initialen Schritt für das Zustandekommen dieser Autophosphorylierung an Threonin 188 stellt dabei die Dimerisierung von ERK dar. In der vorliegenden Arbeit wurde daher die Inhibition der ERK-Dimerisierung im Hinblick auf die Behand-lung ERKThr188-vermittelter pathologischer Hypertrophie untersucht. Dabei sollte die endogene ERK-Dimerisierung mithilfe eines selbst generierten Peptids unterbunden werden. In Übereinstimmung mit den Ergebnissen zu einer dimerisierungsdefizienten ERK2-Mutante (ERK2-Δ4) konnte das Peptid in vitro und in vivo erfolgreich pathologisch hypertrophes Herzwachstum mindern. Dabei führte es sogar zu einem Rückgang des apoptotischen Zelltodes, ausgelöst durch eine Aortenligation, füh-ren. Es zeigte sich, dass das Peptid die nukleäre Translokation von ERK2 verhindert und dadurch nukleäre ERK-Substrate geringer aktiviert werden. Da eine Dysregulation in der Raf/MEK/ERK-Kaskade auch die Entstehung von Tumoren begünstigen kann, sollte schließlich untersucht wer-den, ob das Prinzip der Hemmung nukleärer ERK-Effekte auch die Proliferation von Krebszellen beeinflussen kann. Es stellte sich heraus, dass die Peptid-vermittelte Hemmung der ERK-Dimerisierung auch die Proliferation von Kolonkarzinomzelllinien mit unterschiedlichen Mutations-stadien der Raf/MEK/ERK-Kaskade reduziert.
In der vorliegenden Arbeit konnte somit die Intervention mit der ERK-Dimerisierung als Target der ERKThr188-Autophosphorylierung als translationale Strategie zur Reduktion nukleärer ERK-Effekte herausgearbeitet werden. Dies bietet die Möglichkeit ERK-vermittelte pathologische kardialer Hy-pertrophie und ERK-vermittelte Tumor-Proliferation zu behandeln, ohne kardiotoxische Nebenwir-kungen zu verursachen.
Das Creatinkinase-System ist ein für die Energiegewinnung bedeutender Mechanismus im Herz- und Skelettmuskel. Um die Bedeutung dieses Systems näher untersuchen zu können, wurden CK-knock-out Tiere (M-CK-/--, Mito-CK-/-- bzw. Double-CK-/--Mäuse) und als Kontrollgruppe C 57 Wildtyp Black Six Mäuse verwendet. In der Arbeit vorgeschalteten Versuchen zeigten sich im Ausdauertraining unterschiedliche Trainingseffekte zwischen den Gruppen. Während M-CK-/--Mäuse schlechter als Wildtypen trainierten, wiesen Mito-CK-/--Mäuse einen besseren Trainingseffekt auf. Im Gegensatz dazu zeigte sich im Belastungstraining auf dem Laufband ein umgekehrtes Bild. Durch das Laufradtraining kam es zu einer adaptiven Hypertrophie der Herzen von Wildtyp- und M-CK-/--Mäusen, nicht dagegen bei Mito-CK-/--Mäusen, welche, wie auch Double-CK-/--Mäuse, eine basale Herzhypertrophie aufwiesen. Um die Hypertrophie näher untersuchen zu können, wurden Kardiomyozyten isoliert und deren Größe bestimmt. Es zeigte sich, dass die Kardiomyozyten der Mito-CK-/--Mäuse bei vergleichbarer Breite etwa doppelt so groß wie Wildtyp-Kardiomyozyten waren. So ist die Hypertrophie der Mito-CK-/--Herzen durch die größeren Zellen bedingt. Die basale Vergrößerung der Double-CK-/--Herzen kann auf Grund der Kardiomyozytengröße nicht erklärt werden. Daher liegt die Vermutung nahe, dass sich die Herzhypertrophie auf eine erhöhte Anzahl von Herzmuskelzellen zurückführen lässt. Die Bedeutung eines möglichen kardialen Phänotyps wurde durch Ruhe-EKGs und Dobutamin-Stress-EKGs untersucht. Es zeigte sich, dass Mito-CK-/--Mäuse eine um 10% niedrigere Ruheherzfrequenz aufwiesen. Durch die Dobutamingabe stiegen die Herzfrequenzen in allen Gruppen signifikant an, wobei die Herzfrequenz der Mito-CK-/--Mäuse auch nach der Dobutamingabe 10% niedriger war. Des Weiteren konnte gezeigt werden, dass das QRS-Produkt, ein beim Menschen verwendeter Hypertrophiemarker im EKG, auch bei Mäusen einen Hinweis auf die Hypertrophie der Herzen geben kann. Zuletzt wurde die Muskelfaserverteilung sowie die Größe der Muskelfaserquerschnittsfläche vor beziehungsweise nach dreiwöchigem freiwilligen Laufradtraining in Querschnitten des M. tibialis anterior und M. gastrocnemius bestimmt. In den Muskeln der Wildtypmäuse kam es durch den Trainingsreiz zu einer Verschiebung hin zu mehr langsamen Fasertypen. Der gleiche Effekt zeigte sich auch bei Mito-CK-/--Mäusen, wobei diese sowohl vor als auch nach dem Training mehr schnelle Muskelfasern aufwiesen als Wildtypen. Bei M-CK-/--Mäusen konnte keine Anpassung der Muskeln an das Training nachgewiesen werden. Ein Bewertung der Double-CK-/--Mäuse ist im Bezug auf die Muskeln nicht möglich, da sie sich dem freiwilligen Laufradtraining nicht unterzogen. Ein kardialer Phänotyp kann die Unterschiede im Laufband- und Laufradtraining der CK-knock-out Tiere nur zum Teil erklären, da sich in allen Gruppen eine normale Anpassung der Herzfunktion an die Belastung mit adäquatem Frequenzanstieg. Da mit der Elektrokardiographie keine Aussage über die kardiale Funktion und das Herzzeitvolumen getroffen werden kann, könnte die Echokardiographie oder die EKG-gesteuerte Magnetresonanztomographie in Ruhe und unter medikamentösem Stress mit Dobutamin weitere Hinweise liefern. Auch eine Untersuchung ohne Narkose, in Ruhe und während der Trainingsphasen mittels Maus-Telemetrie könnte zusätzliche Aussagen liefern. Bei den Double-CK-/--Mäusen ist möglicherweise eine Veränderung im Gehirn dafür verantwortlich, dass sie sich dem freiwilligen Laufradtraining nicht unterziehen. Körperlich wären Double-CK-/--Mäuse durchaus fähig im Laufrad zu trainieren, da sie ja auch auf dem Laufband laufen. Die Unterschiede im Laufband- und Laufradtraining sind wahrscheinlich durch einen muskulären Phänotyp zu erklären. Erste Hinweise darauf liefern oben aufgeführte Ergebnisse, die eine unterschiedliche Anpassung der Muskelfasertypen an das Training zeigen. Weitergehende Untersuchungen mit größeren Gruppen und die Untersuchung der Muskeln von auf dem Laufrad trainierten Mäusen könnten dazu weitere Anhaltspunkte liefern.
L-type calcium channels (LTCCs) control crucial physiological processes in cardiomyocytes such as the duration and amplitude of action potentials, excitation-contraction coupling and gene expression, by regulating the entry of Ca2+ into the cells. Cardiac LTCCs consist of one pore-forming α1 subunit and the accessory subunits Cavβ, Cavα2δ and Cavγ. Of these auxiliary subunits, Cavβ is the most important regulator of the channel activity; however, it can also have LTCC-independent cellular regulatory functions. Therefore, changes in the expression of Cavβ can lead not only to a dysregulation of LTCC activity, but also to changes in other cellular functions. Cardiac hypertrophy is one of the most relevant risk factors for congestive heart failure and depends on the activation of calcium-dependent prohypertrophic signaling pathways. However, the role of LTCCs and especially Cavβ in this pathology is controversial and needs to be further elucidated.
Of the four Cavβ isoforms, Cavβ2 is the predominant one in cardiomyocytes. Moreover, there are five different splice variants of Cavβ2 (Cavβ2a-e), differing only in the N-terminal region. We reported that Cavβ2b is the predominant variant expressed in the heart. We also revealed that a pool of Cavβ2 is targeted to the nucleus in cardiomyocytes. The expression of the nuclear Cavβ2 decreases during in vitro and in vivo induction of cardiomyocyte hypertrophy and overexpression of a nucleus-targeted Cavβ2 completely abolishes the in vitro induced hypertrophy. Additionally, we demonstrated by shRNA-mediated protein knockdown that downregulation of Cavβ2 enhances the hypertrophy induced by the α1-adrenergic agonist phenylephrine (PE) without involvement of LTCC activity. These results suggest that Cavβ2 can regulate cardiac hypertrophy through LTCC-independent pathways. To further validate the role of the nuclear Cavβ2, we performed quantitative proteome analyses of Cavβ2-deficient neonatal rat cardiomyocytes (NRCs). The results show that downregulation of Cavβ2 influences the expression of various proteins, including a decrease of calpastatin, an inhibitor of the calcium-dependent cysteine protease calpain. Moreover, downregulation of Cavβ2 during cardiomyocyte hypertrophy drastically increases calpain activity as compared to controls after treatment with PE. Finally, the inhibition of calpain by calpeptin abolishes the increase in PE-induced hypertrophy in Cavβ2-deficient cells. These results suggest that nuclear Cavβ2 has Ca2+- and LTCC-independent functions during the development of hypertrophy. Overall, our results indicate a new role for Cavβ2 in antihypertrophic signaling in cardiac hypertrophy.
Integrine sind heterodimere, transmembranöse, ubiquitär vorkommende Glycoproteinrezeptoren, die aus einer alpha und einer beta Untereinheit bestehen und die Extrazellulärmatrix über verschiedene Signalwege mit dem Zytoskelett verbinden. In dieser Arbeit wurde die funktionelle Bedeutung des beta-1-Integrins bei der Entwicklung einer kardialen Hypertrophie und Insuffizienz am herzspezifischen konditionalen beta-1-Integrin Knock Out Mausmodell mit morphologischen, histologischen, echokardiographischen, proteinanalytischen und immunhistochemischen Essungen und Methoden untersucht. Hämodynamische Druckbelastung des Myokards ausgelöst durch transversales Aortic Banding führte bei den Knock Out Tieren verglichen mit Kontrolltieren zu folgenden Ergebnissen: erhöhte postoperative Mortalität, Reduktion der linksventrikulären Hypertrophie und Kontraktilität, Reduktion der Src-Aktivität bei unveränderter FAK-Aktivität sieben Tage postoperativ, sowie Reduktion der Erk 1/2 und P38 MAP Kinase Aktivität zwei, aber nicht sieben Tage postoperativ. Immunhistochemisch konnten das beta-1-Integrin, FAK und Src in der Kardiomyozytenmembran, im Gefäßendothel und teilweise in den Disci Intercalares nachgewiesen werden. Die enorme Bedeutung des beta-1-Integrins bei der Hypertrophieentstehung konnte somit bei Mäusen in vivo gezeigt werden. Für ein vollkommenes Verständnis der molekularen Zusammenhänge im hypertrophierenden Myokard bedarf es allerdings noch weiterer intensiver Forschung.
Die extrazellulär Signal-regulierten Kinasen 1 und 2 (ERK1/2) spielen eine zentrale Rolle bei der Vermittlung kardialer Hypertrophie und dem Zellüberleben. Hypertrophe Stimuli aktivieren ERK1/2, triggern deren Dimerisierung und in der Folge die ERK188-Autophosphorylierung. Diese neu entdeckte Autophosphorylierung ist eine Voraussetzung für den nukleären Import von ERK1/2 und führt zum Entstehen pathologischer kardialer Hypertrophie. Da das Dimer Interface von ERK eine mögliche Zielstruktur darstellt, um selektiv die nukleären Signalwege von ERK zu unterbrechen, wurde untersucht, ob man mit Hemmung der ERK-Dimerisierung eine therapeutische Möglichkeit hat, um pathologische kardiale Hypertrophie zu verhindern. Dazu wurden verschiedene ERK2 Mutanten und Peptide generiert, um die ERK-Dimerisierung zu verhindern. Die Effekte dieser Konstrukte auf die ERK-Dimerisierung und den Kernimport wurden in verschiedenen Zelltypen mittels Fluoreszenzmikroskopie, Co-Immunopräzipitationen und Duolink proximity ligation assays getestet. Es konnte gezeigt werden, dass die Peptide effektiv die ERK-ERK Interaktion nach Stimulation mit Phenylephrin und/oder Carbachol verhindern. Zusätzlich reduzierten die Peptide ERKT188-Phosphorylierung und in der Folge den ERK-Import in den Nukleus und Kardiomyozytenhypertrophie. Normale ERK-Aktivierung wurde jedoch durch die Peptide nicht verhindert. Insgesamt konnte gezeigt werden, dass das ERK-Dimer Interface eine wertvolle Zielstruktur ist, mit dem man nukleäre ERK1/2 Signalwege selektiv unterbrechen und damit effektiv Kardiomyozytenwachstum reduzieren kann, ohne gleichzeitig das Zellüberleben zu gefährden.