Refine
Has Fulltext
- yes (20)
Is part of the Bibliography
- yes (20)
Year of publication
Document Type
- Doctoral Thesis (18)
- Journal article (2)
Keywords
- In vitro (20) (remove)
Institute
- Theodor-Boveri-Institut für Biowissenschaften (5)
- Graduate School of Life Sciences (3)
- Institut für Pharmakologie und Toxikologie (3)
- Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin (3)
- Institut für Pharmazie und Lebensmittelchemie (2)
- Poliklinik für Zahnerhaltung und Parodontologie (2)
- Augenklinik und Poliklinik (1)
- Fakultät für Biologie (1)
- Fakultät für Chemie und Pharmazie (1)
- Julius-von-Sachs-Institut für Biowissenschaften (1)
Sonstige beteiligte Institutionen
Efficient expression systems are required for analysis of gene regulation and function in teleost fish. To develop such systems, a nurober of inducible or constitutive promoter and enhancer sequences of fish or higher vertebrate origin were tested for activity in a variety of fish celllines andin embryos of the Japanese medaka fish (Oryzias latipes) and Xiphophorus. The activity of the different promoterenhancer combinations were quantitated. Considerable differences were found for some constructs if tested in vitro or in vivo. From the data obtained, a set of expression vectors for basic research as weH as for aquaculture purposes were established.
In einer vorangegangenen In-vitro-Untersuchung wurden die pallatinalen Wurzeln menschlicher Molaren im Scherversuch (10mm/Min) gebrochen. Zahnfragmente wurden mit Hilfe verschiedener Dentinhaftvermittler (OptiBond FL, Syntac, Adhese, Prompt L-Pop und OptiBond FL in Kombination mit Tetrac Flow) adhäsiv wiederbefestigt. Die so rekonstruierte Zahneinheit wurde erneut an der ursprünglichen Bruchfläche gebrochen und die Bruchfestigkeit ermittelt. In der vorliegenden In-vitro-Untersuchung wurden die Bruchflächen der erneut gebrochenen Zähne digital abfotografiert und lichtmikroskopisch untersucht, um den Frakturmodus zu ermitteln. Die Frakturmodi (Adhäsivfraktur, Kohäsivfraktur im Dentin oder Befestigungsmaterial) wurden absolut und in Relation zur gesamten Bruchfläche ermittelt. Hierzu wurde ein spezielles CAD-Programm verwendet. Mittels statistischer Tests wurden die Adhäsivsysteme auf signifikante Unterschiede hinsichtlich der aufgetretenen Frakturmodi untersucht. Ergebnisse: Keine signifikanten Unterschiede. Kohäsivfrakturen im Befestigungsmaterial traten unabhängig vom Dentinhaftvermittler am häufigsten auf. Vor allem konnte dieser Bruchmodus bei Verwendung von OptiBond FL beobachtet werden. Adhäsivfrakturen traten am zahlreichsten bei Gebrauch von Prompt L-Pop und Kohäsivfrakturen im Dentin bei Verwendung von Syntac auf.
Kronenfrakturen, insbesondere im Rahmen von Frontzahntraumata, nehmen einen immer größeren Stellenwert bei der Behandlung von Kindern und Jugendlichen ein. Da auch in Zukunft mit einem weiteren Anstieg derartiger Verletzungen zu rechnen ist, muss an minimal-invasiven, ästhetischen und ökonomischen Therapiemöglichkeiten geforscht werden. Die Fragmentbefestigung mit Hilfe von Dentinadhäsiven mit oder ohne zusätzliche Verwendung von fließfähigem Komposit stellt derzeit die Methode der Wahl dar. Da es in den letzten Jahren zu einer Umstellung von Mehrflaschen-Adhäsiven auf Einflaschen-Adhäsive gekommen ist, sollten in der vorliegenden Arbeit Dentinadhäsivsysteme verschiedenen Generationen bezüglich ihres Bruchverhaltens nach Versagen der adhäsiven Befestigung getestet werden. Zudem sollte herausgefunden werden, ob unterschiedliche Frakturverläufe im Schmelz- und Dentinbereich zu beobachten sind. Humane extrahierte Zähne aus einer vorangegangenen Studie zur Bruchfestigkeit von Dentinadhäsiven dienten als In-vitro-Testsystem. Die Dentinadhäsive OptiBond FL®, Syntac®, AdheSE®, Adper® Prompt® L-Pop® sowie die kombinierte Anwendung von OptiBond FL® mit dem fließfähigen Komposit Tetric® Flow wurden anhand von lichtmikroskopischen Bruchflächenanalysen auf ihr Frakturverhalten nach Versagen der Fragmentbefestigung untersucht. Die Adhäsivsysteme untereinander unterschieden sich dabei bezüglich der Frakturverläufe kaum. Abweichungen gab es allerdings zwischen Schmelz- und Dentinbereich. Während es im Schmelzbereich zu einem ausgeglichenen Verhältnis von Kohäsiv- und Adhäsivfrakturen kam, dominierte im Dentinbereich der Anteil an Kohäsivfrakturen innerhalb des Restaurationsmaterials. Lediglich das Adhäsivsystem Syntac® fiel durch einen erhöhten Anteil an Adhäsivfrakturen im Dentinbereich und Adper® Prompt® L-Pop® durch einen hohen Prozentsatz an Adhäsivfrakturen im Schmelzbereich auf. In der Literatur werden Kohäsivfrakturen häufig mit hohen Haftwerten und Adhäsivfrakturen mit niedrigen Verbundfestigkeiten zwischen Zahn und Adhäsiv in Verbindung gebracht. Bei Adper® Prompt® L-Pop® konnte im Rahmen der vorangegangenen Studie eine verminderte Bruchfestigkeit gegenüber den anderen Adhäsivsystemen bestätigt werden. Zur Wiederbefestigung von Kronenfragmenten sind somit die modernen „Einflaschen-Adhäsivsysteme“ derzeit noch nicht zu empfehlen. Gefüllte Dentinadhäsive, wie OptiBond FL®, scheinen hingegen aufgrund ihrer höheren Bruchfestigkeit und ihrer langen klinischen Erfahrung für die Fragmentbefestigung geeignet zu sein.
In Deutschland und weltweit, werden mehr und mehr, neben einem makellosen Körper und Gesicht, auch makellose Zähne als Schönheits- und Statussymbol betont. Sogar können die kleinste Verfärbungen oder Füllungen Grund zur Besorgnis für Erwachsene, Kinder und Eltern sein. Als Therapie in der Zahnheilkunde ist verbreitet, diese Verfärbungen bzw. Flecken mit Kompositfüllungen, Veneers, Kronen oder mit abrasiven Schleifkörpern invasiv beseitigen zu können. Weniger angewendet, doch erste Wahl der Therapie sollte die minimal invasive Mikroabrasionsbehandlung sein. Dabei werden mit abrasiven und säurehaltigen Pasten die innerhalb der Oberfläche liegenden Verfärbungen beseitigt. Über die Größe des Schmelzabtrages in der zahnärztlichen Literatur findet man nur geringe metrische Angaben. Deshalb ist Ziel dieser vorliegenden Studie die Untersuchung des Schmelzsubstanzabtrages durch Mikroabrasion mit der Mikroabrasionspaste Opalustre® in den Bearbeitungszeiten von 5, 50 und 100 Sekunden, mit gleich bleibendem Anpressdruck und Umdrehungszahl und so herauszufinden, ob bei konstantem Druck und Umdrehungszahl die Größe des Abriebs mit der Behandlungszeit korreliert. Humane extrahierte Zähne dienten dabei als In-vitro-Testsystem. Die Analyse des Schmelzabtrages erfolgte an Dünnschnitten der behandelten humanen Zähne unter einem Lichtmikroskop bei 50 facher Vergrößerung. Auf die Labialflächen von 21 extrahierten und in 0,1 %-iger Thymollösung gelegten Zähnen wurde eine eingefärbte Bondingschicht mittig als Referenzfläche aufgetragen. Die in drei Versuchsgruppen aufgeteilten Zähne wurden dann mit der Mikroabrasionspaste Opalustre® für 5, 50 und 100 Sekunden bei einem Druck von etwa 200 g, bei etwa 135 U/min (Kavo-Reduzierwinkelstück, Doppelring grün 7,4:1 bei 1000 U/min) mit der Paste und dem dazugehörigen Polierkelch (Opal Cups-Bristle™) mikroabradiert. Nach Einbetten der Zahnkronen in Kunststoffblöcke wurden sie in ca. 0,7 mm (± 0,1mm) dicke Scheiben (Proben) geschnitten und unter dem Lichtmikroskop quantitativ nach dem Schmelzabtrag untersucht. Der Mittelwert des Substanzabtrages bei 5 Sekunden Bearbeitungszeit lag bei 14,80 µm, bei 50 Sekunden bei 20,86 µm und bei 100 Sekunden bei 23,74 µm. Die Ergebnisse sind signifikant. Damit wurde gezeigt, daß eine Anwendungszeit von 50 oder 100 Sekunden nicht effektiver ist als 5 Sekunden. Ein häufiger 5 Sekunden Wechsel mit wiederholt neuem Auftragen frischer Mikroabrasionspaste, entgegen der Herstellerangaben, zeigt einen effizienteren Abtrag als eine Zeitverlängerung. Für Fluorose bedingte Verfärbungen 2. Grades könnte somit in ca. 30 Sekunden mit Opalustre® (bei einer Umdrehungszahl von 135 rpm und einem Druck von 200 g) ein genügend tiefer Abtrag des betroffenen Schmelzareals (ca. 100 µm) mit dem gelieferten Kelch (OpalCups-Bristle™) stattfinden, wenn alle 5 Sekunden die Paste neu aufgetragen wird.
Um Arzneimittelwechselwirkungen von Arzneistoffen sowie neuen Arzneistoffkandidaten zu vermeiden, werden zur Abschätzung des Interaktionsrisikos so genannte In-vitro-Interaktionsstudien durchgeführt. Hierfür werden vor allem Mikrotiterplatten-basierte Fluoreszenz- und LC/MS-Methoden verwendet. Das Ziel dieser Arbeit war die Untersuchung der Anwendbarkeit und Validität dieser In-vitro-Methoden bezüglich der Inhibition von CYP-Enzymen durch Arzneipflanzenextrakte. Die in dieser Arbeit erhaltenen Daten belegen, dass die verwendeten Fluoreszenz-Assays für Pflanzenextrakte keine validen Ergebnisse liefern und für die Bestimmung der inhibitorischen Aktivität von Pflanzenextrakten nur in wenigen Fällen geeignet sind. Bei einigen untersuchten Pflanzenextrakten wurden sehr starke inhibitorische Aktivitäten gefunden, da durch Quenching des Fluoreszenzsignals falsch positive Ergebnisse vorgetäuscht wurden. Ebenso war die Inhibition bei einigen Pflanzenextrakten aufgrund einer starken Eigenfluoreszenz sehr schwach oder konnte überhaupt nicht bestimmt werden. Des Weiteren wurden als Referenzmethoden für die Bestimmung der Inhibition von CYP-Enzymen LC/MS-basierte Methoden mit Online-Festphasenextraktion verwendet, die speziell für Pflanzenextrakte entwickelt und validiert wurden. Die Ergebnisse der LC/MS-basierten CYP-Assays wurden durch die Pflanzenmatrix nicht beeinflusst, so dass diese Assays hervorragend als Referenzmethoden für die Bestimmung der inhibitorischen Aktivität von Pflanzenextrakten geeignet sind. Bei sehr hohen Extraktkonzentrationen zeigten einige Pflanzenextrakte sehr starke Abweichungen der mittels LC/MS und Fluorimetrie in Mikrotiterplatten erhaltenen inhibitorischen Aktivität. Die Verwendung von niedrigen Extraktkonzentrationen führte zu einer besseren Übereinstimmung der erhaltenen Ergebnisse. D.h. vor allem bei hohen Extraktkonzentrationen sind starke Quenching- und Eigenfluoreszenz-Effekte zu erwarten. Dennoch sind auch bei niedrigen Extraktkonzentrationen diese Effekte nicht auszuschließen. In den meisten Veröffentlichungen wurden sehr hohe Testkonzentrationen für die Bestimmung der inhibitorischen Aktivität von Pflanzenextrakten verwendet, so dass mit hoher Wahrscheinlichkeit aufgrund von Quenching- und Eigenfluoreszenz-Effekten falsch positive bzw. negative Ergebnisse erhalten wurden. Untersuchungen zum Quenching haben gezeigt, dass die meisten Extrakte in den üblicherweise verwendeten Konzentrationen (ca. 10-1000 µg/ml) die Fluoreszenzintensität der Metabolite sehr stark reduzierten. Die Quenching-Effekte der Pflanzenextrakte beeinflussten das Fluoreszenzsignal aller enzymatisch gebildeten Metabolite (Cumarin-Derivate, Resorufin, Fluorescein), wobei die Quenching-Effekte bei Resorufin und Fluorescein in ihrer Stärke und Häufigkeit geringer ausfielen. Bei CYP2B6, CYP2C9 und CYP2D6 wurden in Verbindung mit Fluoreszenzsubstraten, die eine Cumarinstruktur aufweisen, sehr oft falsch negative oder gar keine Ergebnisse erhalten, weil die Eigenfluoreszenz der Extrakte die Metabolitenfluoreszenz überlagerte. Quenching-Effekte traten bei den untersuchten Pflanzenextrakten weitaus häufiger auf als eine Eigenfluoreszenz. Aufgrund dieser Tatsachen können die Mikrotiterplatten-basierten Fluoreszenz-Methoden nur eingesetzt werden, wenn vorher gezeigt wurde, dass die Pflanzenextrakte bei allen Testkonzentrationen sowie bei verschiedenen Metabolitenkonzentrationen weder Quenching- noch Eigenfluoreszenz-Effekte zeigen. Ebenso wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass die bisher in Veröffentlichungen durchgeführten Kontrollinkubationen nur bedingt zur Kompensation von Quenching- und Eigenfluoreszenz-Effekten geeignet sind. Das Auftreten und Ausmaß der Quenching- und Eigenfluoreszenz-Effekte sind abhängig vom Inhibitor (Pflanzenextrakt), der Inhibitorkonzentration, dem Metaboliten und dessen Anregungs- und Emissionswellenlänge sowie der Metabolitenkonzentration, die durch die enzymatische Umsetzung des Substrats und der inhibitorischen Aktivität des Inhibitors bestimmt wird. Während der Inhibitor, die zu testenden Inhibitorkonzentrationen, der Metabolit sowie dessen Anregungs- und Emissionswellenlänge eine feste Größe darstellen, ist die Metabolitenkonzentration je nach inhibitorischer Aktivität des Inhibitors sehr unterschiedlich. D. h. letztendlich hängt das genaue Ausmaß der Eigenfluoreszenz- und Quenching-Effekte von der inhibitorischen Aktivität der Pflanzenextrakte ab. Es konnte gezeigt werden, dass je geringer die Metabolitenkonzentration ist, desto stärker wird das Fluoreszenzsignal reduziert (Quenching) bzw. erhöht (Eigenfluoreszenz). Eine sinnvolle Kontrollinkubation zur Kompensation von Quenching- und Eigenfluoreszenz-Effekten kann also gar nicht durchgeführt werden. Bei In-vitro-Untersuchungen zur Bestimmung der inhibitorischen Aktivität ist die Metabolitenkonzentration nicht bekannt und somit der Einfluss der Effekte nicht bestimmbar.
Background
Angiogenesis represents a highly multi-factorial and multi-cellular complex (patho-) physiologic event involving endothelial cells, tumor cells in malignant conditions, as well as bone marrow derived cells and stromal cells. One main driver is vascular endothelial growth factor (VEGFA), which is known to interact with endothelial cells as a survival and mitogenic signal. The role of VEGFA on tumor cells and /or tumor stromal cell interaction is less clear. Condition specific (e.g. hypoxia) or tumor specific expression of VEGFA, VEGF receptors and co-receptors on tumor cells has been reported, in addition to the expression on the endothelium. This suggests a potential paracrine/autocrine loop that could affect changes specific to tumor cells.
Methods
We used the monoclonal antibody against VEGFA, bevacizumab, in various in vitro experiments using cell lines derived from different tumor entities (non small cell lung cancer (NSCLC), colorectal cancer (CRC), breast cancer (BC) and renal cell carcinoma (RCC)) in order to determine if potential VEGFA signaling could be blocked in tumor cells. The experiments were done under hypoxia, a major inducer of VEGFA and angiogenesis, in an attempt to mimic the physiological tumor condition. Known VEGFA induced endothelial biological responses such as proliferation, migration, survival and gene expression changes were evaluated.
Results
Our study was able to demonstrate expression of VEGF receptors on tumor cells as well as hypoxia regulated angiogenic gene expression. In addition, there was a cell line specific effect in tumor cells by VEGFA blockade with bevacizumab in terms of proliferation; however overall, there was a limited measurable consequence of bevacizumab therapy detected by migration and survival.
Conclusion
The present study showed in a variety of in vitro experiments with several tumor cell lines from different tumor origins, that by blocking VEGFA with bevacizumab, there was a limited autocrine or cell-autonomous function of VEGFA signaling in tumor cells, when evaluating VEGFA induced downstream outputs known in endothelial cells.
Die Epithelzellen des renalen proximalen Tubulus resorbieren große Mengen an Wasser, Glucose und weiteren wertvollen Substanzen aus dem Primärharn, um deren Ausscheidung zu verhindern. Weiterhin sekretieren sie harnpflichtige Substanzen in den Primärharn und sind in der Lage, in die Zelle aufgenommene Substanzen enzymatisch umzusetzen. Diese Funktionen machen den renalen proximalen Tubulus zu einer wichtigen Einheit für die Nie-renfunktion. Sie führen aber auch zu einer hohen Empfindlichkeit gegenüber toxischen Effek-ten von Fremdstoffen. Daher ist ein In-vitro-Modell des renalen proximalen Tubulusepithels sowohl für die Erforschung physiologischer und pathologischer Mechanismen als auch zur Testung der Toxizität von Substanzen, insbesondere neuen Arzneimitteln, bedeutend. Ein weiteres Forschungsfeld, für das ein In-vitro-Gewebe von großem Nutzen wäre, ist die Ent-wicklung von bioartifiziellen Nierenersatzsystemen. Aufgrund Spezies-spezifischer Unterschiede, z.B. in der Expression von Transportproteinen und Enzymen, ist ein Modell mit humanen Zellen anzustreben. Bisher besteht jedoch ein Mangel an Modellen, die das renale proximale Tubulusepithel für die oben genannten An-wendungsbereiche adäquat abbilden. Das Ziel dieser Arbeit war deshalb der Aufbau eines humanen In-vitro-Modells des renalen proximalen Tubulus unter Verwendung von humanen Nierenzellen (human kidney-derived cells, hKDCs), die Eigenschaften renaler Vorläuferzellen aufweisen. In Kombination mit die-sen Zellen wurden verschiedene Kultursubstrate getestet. Dabei zeigte sich, dass die Zellen sowohl in Zellkulturplatten als auch auf Kollagen-Typ-I-beschichteten Insertmembranen mehrschichtig wachsen, ohne die typische Morphologie renaler proximaler Tubuluszellen auszubilden. In einem dreidimensionalen Kollagen-Typ-I-Hydrogel bildeten die hKDCs hin-gegen tubuläre bzw. zystäre Strukturen mit einer kubischen bis hochprismatischen Morpho-logie. Da für die oben erwähnten Anwendungsbereiche jedoch eine planare Zellschicht benö-tigt wird, erfolgte die Testung weiterer biologischer Matrices. Diese waren die Small intestinal submucosa (SIS) und das Biological vascularized scaffold (BioVaSc). Beide ließen sich aus porcinem Dünndarm herstellen, wobei bei der SIS die Mucosa sowie das Mesenterium ent-fernt wurden. Bei der BioVaSc handelt es sich um ein Darmsegment mit erhaltenem Ge-fäßsystem, dass zur Perfusion genutzt wird. Nach ihrer Kultur auf der SIS wiesen die hKDCs das typische Wachstum und die charakteris-tische Morphologie des renalen proximalen Tubulusepithels auf. Dazu gehören die Kontakt-hemmung, die das einschichtige Wachstum ermöglicht, die kubisch bis hochprismatische Morphologie sowie die Bildung eines Bürstensaums an der apikalen Zellmembran. Anhand einer Kollagen-Typ-IV- und einer Alcianblau-Färbung ließ sich die Bildung einer Basalmemb-ran an der Grenze zur SIS nachweisen. Bürstensaum- und Basalmembranbildung zeigten die zelluläre Polarisierung. Weiterhin waren typische Markerproteine renaler proximaler Tu-buluszellen wie N-Cadherin und Aquaporin-1 immunhistochemisch, zum Teil deutlich stärker als bei den Ausgangszellen, nachweisbar. Dies belegt einen positiven Einfluss der extrazellu-lären Matrixkomponenten der SIS auf die Ausbildung von Charakteristika des renalen proxi-malen Tubulusepithels. Die Albuminaufnahme als spezifische Funktion war ebenfalls nach-weisbar. Die molekularen Veränderungen der hKDCs während der Kultivierung auf der SIS ließen sich weiterhin mittels Raman-Spektroskopie bestätigen. Aufgrund der starken Interak-tion zwischen Tubulusepithel und umgebenden Kapillarnetzwerk wurde weiterhin die Co-Kultur mit Endothelzellen etabliert. Für den Vergleich der hKDCs mit einer etablierten humanen Zelllinie renaler proximaler Tu-buluszellen wurde die HK-2-Zelllinie verwendet. Mit dieser Zelllinie ließen sich die Ergebnisse der hKDCs jedoch nicht reproduzieren, was auf die fehlende Sensitivität der transformierten Zelllinie auf die Substrateigenschaften zurückzuführen ist. In der dynamischen Kultur mit der BioVaSc als Matrix waren ein inhomogenes Wachstum sowie eine variierende Markerexpression zu beobachten. Die ließ sich vor allem auf den starken Einfluss der Aussaatdichte sowie die Festigkeit der Matrix zurückführen. Bei einer erfolgreichen Optimierung der Kultur kann dieses Modell jedoch für komplexere Studien in der pharmakologischen Entwicklung nützlich sein. Mit der Kombination aus hKDCs und SIS ist es gelungen, eine einzelne, durchgängige Zell-schicht zu generieren, die wichtige Charakteristika des renalen proximalen Tubulusepithels aufweist. Weitere Untersuchungen sind nun nötig, um die Funktionalität des Modells weiter-gehend zu charakterisieren (z.B. der Transport von Substanzen und Sensitivität gegenüber toxischen Substanzen). Anschließend kann es für die spezifischen Anwendungen weiterentwickelt werden.
The novel refrigerant 2,3,3,3‐tetrafluoropropene (HFO‐1234yf) as well as the novel foam blowing and precision cleaning agent trans‐1‐chloro‐3,3,3‐trifluoropropene (trans‐HCFO‐1233zd) are both chlorofluorocarbon replacements with low GWPs and a short atmospheric life time. Whereas the hydrofluoroolefin HFO‐1234yf has no negative effect on stratospheric ozone due to the lack of chlorine in its structure, the hydrochlorofluoroolefine trans‐HCFO‐1233zd exhibits a very low potential for ozone depletion (ODP). This is approximately 100 times lower than the ozone depletion potential of precursor compounds such as 1,1,2‐trichloro‐1,2,2‐trifluoroethane (CFC‐113). Principle aims of this thesis were to investigate the unknown metabolism of the new solvent trans‐HCFO‐1233zd and to further investigate a possible biotransformation based toxicity of HFO‐1234yf observed in rabbits. Therefore study specimens of different in vitro and in vivo studies with trans‐HCFO‐1233zd and HFO‐1234yf were analyzed for metabolites using 19FNMR spectroscopy, LC‐MS/MS spectrometry and GC/MS spectrometry. Metabolites were identified by comparison with purchased or synthesized standard substances. Excretion kinetics of the predominant metabolites were determined by LC‐MS/MS quantification,inorganic fluoride was determined by potentiometry. Moreover cytochrome P‐450 2E1 and 3A4 liver enzyme activities were measured in a multi‐exposure study with HFO‐1234yf. ...
Assessing particle deposition in a representative in vitro model of the rat respiratory tract
(2014)
The aim of this thesis was to develop an in vitro model (IVR) of the rat lung for the purpose of investigating the deposition of drug particles in the rat airways. The model attempted to account for the affect of drug product characteristics and physiological parameters on deposition in the lungs. In addition, the model outputs were compared with in vivo lung deposition results from live rats and in silico predictions using published computer model of lung deposition in pre-clinical species.
Initial work focussed on developing an aerosol exposure system capable of dosing small rodent to a range of airborne test materials. The system consists of two main parts; a fluidised bed aerosol generator and connection of the generator output to a nose only exposure chamber capable of accommodating 12 small animals in a single layer. In addition, an aerodynamic particle spectrometer (APS) was installed for continuously measuring the size distribution and airborne concentration of aerosol particles generated in the exposure chamber. System validation showed acceptable degree of variation of the test material tested, Fluorescent Microspheres (FMS) throughout the exposure chamber (CV < 15.0%). Particle size (MMAD ± GSD) using the APS was shown to be stable throughout the exposure periods.
The IVR model developed in this project was based on a number of euthanased (n=7), female Sprague-Dawley rats (weight: 372 ± 56 g), which underwent high-resolution micro-CT scans. The physical model consisted of five sub sections; Extra-Thoracic region containing the snout and nasophyarynx, trachea-bronchial region containing the trachea, bronchi, and bronchioles. All sections of the model were attached to one another in numerical order and housed within a containment unit. At the rear end of the cast, a flexible diaphragm was attached in order to collect the fraction of inhaled particles exiting the TB section and possibly reaching the lung, referred to as the Post-TB section.
A study was conducted to assess the influence of inhalation parameters such as the breathing frequency and tidal volume on total and regional dose distribution using FMS as test material. The major finding of this study was the demonstration of the model sensitivity to changes in breathing parameters especially respiratory frequency, where the data showed increased deposition in the peripheral regions of the model with decreased respiratory frequency. Other studies assessed the effect of particle characteristics on deposition on the IVR model, such as particle size, dose increase and formulation changes.
The results assessing particle size effect showed a slightly higher deposition levels for the 4µm sized particles versus 2µm sized particles in the head region; 90.8 ± 3.6% and 88.2 ± 6.6%. However, this difference did not reach statistical significance (P> 0.05) probably due to the polydispersity of aerosolised FMS particles. In addition, the regional deposition analysis showed an increased lung peripheral deposition with the smaller particles. In addition, the model was shown to be sensitive to changes in formulation composition mediated by inclusion of MgSt.
The next stage of work was to validate the model in terms of comparison with lung deposition for in vivo rats. For lung deposition comparison, the absolute amount deposited in the IVR lung model (expressed as µg/kg) was shown to have a reasonably strong correlation with in vivo lung concentration measures (µg/kg); R2= 0.66, P < 0.05. Compounds were predicted well and within 2-folds of the measured lung deposition values. However, knowing the variability in biological systems and the multiple components required to estimate lung doses, predictions within 2-fold of the measured values would seem reasonable
In terms of comparison with in silico model predictions using MPPD, similar deposition levels were noted between the two models, particularly when the data was expressed as percentage of total particles inhaled. The data showed the highest deposition levels were noted in the head region (> 80%) and less than 5.0% deposition for the peripheral lung fractions.
With regards to using the IVR model to assess the relationship between dose, particle size and efficacy, an in vivo study using FP with different particle sizes (2.0 and 4.0 µm) but same doses ( 100 and 1000 µg/kg). This study demonstrated that exposure of rat to FP powder resulted in a dose-dependent inhibition of neutrophils in BAL fluids. However, a clear difference in neutrophils suppression was demonstrated for equivalent doses but different particle sizes of FP, where the smaller FP particles (2.0 µm) induced a greater level of neutrophils suppression in comparison with larger FP particles (4.0 µm). In addition, a reasonably good correlation for the relationship between lung deposition in the IVR model and a neutrophils suppression level was demonstrated. Furthermore this data support the hypothesis that regional deposition is an important determinant in efficacy. Therefore, this suggests that the IVR model may be a useful as a tool to describe in vivo efficacy with in vitro data. However, further studies should be conducted to evaluate the validity of this model and relationship.
The IVR model has a number of important limitations. First, the model is based on scans up to generation four of the rat respiratory tract as this represented the limits of the micro-CT scanning technology at the time of this study. Therefore deposition in the deeper region of the lung may not be reflected precisely in the IVR model. Second, the regional deposition data generated using the model tended to show an overestimation of deposition in head region and an underestimation of deposition in the peripheral regions of the lung, in comparison with in vivo lung deposition data. Third, the current model does not take into account lung clearance. However, the amount of the drug present in the in vivo lungs is dependent on numerous physiological processes such as dissolution, passive or active absorption into the systemic circulation, binding to lung tissue and mucociliary clearance. Consequently, the results generated using this IVR model for drug molecules with high lung clearance rate should be treated with some caution.
Future work extending this research could go in a number of directions. In this research, a representative model of the rat respiratory tract was constructed from analysis of imaging data from a number of euthanised Sprague-Dawley rats. This model represented the “average respiratory tract” in terms of dimensions of Sprague-Dawley rats. However, there is considerable variability in the airway dimensions between rats. This variability encompasses a number of factors such as the strains of rats, sex and age, and disease state. Thus, it may be possible to produce a small number of airway models to represent small and large rats and scaled to represent the extrathoracic and peripheral regions based on literature reports of their dimensions in different rat populations. This approach will then enable the effect of intersubject airway dimensions for different rat populations on aerosol deposition to be thoroughly examined.
In addition, due to the limitation of the micro-CT technology used to construct the physical IVR model, detailed morphology only up to generation 4 were captured. However, recent advances in MRI technology, such as the use of in situ-MRI based scanning technology have enabled rat airway morphometry to be extended to 16 airway generation. This coupled with improvements in the resolutions of rapid-prototyping process means it may be possible to construct a rat model that reflects the in vivo lung morphology more accurately, and thus enable greater understanding of the link between aerosol deposition and airway geometry.
In conclusion, a model cast of the rat lung was developed and validated to allow the deposition of inhaled particles in the rat lung to be investigated. The model may be used to estimate the lung concentration in vivo rats in preference to exposure concentration measurements based on filter samples which have been shown to be a poor indicator of the lung concentration immediately after exposure. In addition, the model has the potential to be used along with live rats in an inhalation rig in pulmonary pharmaceutics research and may facilitate in development of inhaled formulations to target specific regions within the lung as well as screening of inhaled drugs in preclinical setting.
Kinetic assessment by in vitro approaches - A contribution to reduce animals in toxicity testing
(2015)
The adoption of directives and regulations by the EU requires the development of alternative testing strategies as opposed to animal testing for risk assessment of xenobiotics. Additionally, high attrition rates of drugs late in the discovery phase demand improvement of current test batteries applied in the preclinical phase within the pharmaceutical area. These issues were taken up by the EU founded 7th Framework Program “Predict-IV”; with the overall goal to improve the predictability of safety of an investigational product, after repeated exposure, by integration of “omics” technologies applied on well established in vitro approaches. Three major target organs for drug-induced toxicity were in focus: liver, kidney and central nervous system. To relate obtained dynamic data with the in vivo situation, kinetics of the test compounds have to be evaluated and extrapolated by physiologically based pharmacokinetic modeling.
This thesis assessed in vitro kinetics of the selected test compounds (cyclosporine A, adefovir dipivoxil and cisplatinum) regarding their reliability and relevance to respective in vivo pharmacokinetics. Cells were exposed daily or every other day to the test compounds at two concentration levels (toxic and non-toxic) for up to 14 days. Concentrations of the test compounds or their major biotransformation products were determined by LC-MS/MS or ICP-MS in vehicle, media, cells and plastic adsorption samples generated at five different time-points on the first and the last treatment day.
Cyclosporine A bioaccumulation was evident in primary rat hepatocytes (PRH) at the high concentration, while efficient biotransformation mediated by CYP3A4 and CYP3A5 was determined in primary human hepatocytes (PHH) and HepaRG cells. The lower biotransformation in PRH is in accordance with observation made in vivo with the rat being a poor model for CYP3A biotransformation. Further, inter-assay variability was noticed in PHH caused by biological variability in CYP3A4 and CYP3A5 activity in human donors. The inter-assay variability observed for PRH and HepaRG cells was a result of differences between vehicles regarding their cyclosporine A content. Cyclosporine A biotransformation was more prominent in HepaRG cells due to stable and high CYP3A4 and CYP3A5 activity. In addition, in vitro clearances were calculated and scaled to in vivo. All scaled in vitro clearances were overestimated (PRH: 10-fold, PHH: 2-fold, HepaRG cells: 2-fold). These results should be proven by physiologically-based pharmacokinetic modeling and additional experiments, in order to verify that these overestimations are constant for each system and subsequently can be diminished by implementation of further scaling factors.
Brain cell cultures, primary neuronal culture of mouse cortex cells and primary aggregating rat brain cells, revealed fast achieved steady state levels of cyclosporine A. This indicates a chemical distribution of cyclosporine A between the aqueous and organic phases and only minor involvement of biological processes such as active transport and biotransformation. Hence, cyclosporine A uptake into cells is presumably transport mediated, supported by findings of transporter experiments performed on a parallel artificial membrane and Caco-2 cells. Plastic adsorption of cyclosporine A was significant, but different for each model, and should be considered by physiologically based pharmacokinetic modeling.
Kinetics of adefovir dipivoxil highlights the limits of in vitro approaches. Active transporters are required for adefovir uptake, but were not functional in RPTECT/TERT1. Therefore, adefovir uptake was limited to passive diffusion of adefovir dipivoxil, which itself degrades time-dependently under culture conditions.
Cisplatinum kinetics, studied in RPTEC/TERT1 cells, indicated intracellular enrichment of platinum, while significant bioaccumulation was not noted. This could be due to cisplatinum not reaching steady state levels within 14 days repeated exposure. As shown in vivo, active transport occurred from the basolateral to apical side, but with lower velocity. Hence, obtained data need to be modeled to estimate cellular processes, which can be scaled and compared to in vivo.
Repeated daily exposure to two different drug concentrations makes it possible to account for bioaccumulation at toxic concentrations or biotransformation/extrusion at non-toxic concentrations. Potential errors leading to misinterpretation of data were reduced by analyses of the vehicles as the applied drug concentrations do not necessarily correspond to the nominal concentrations. Finally, analyses of separate compartments (medium, cells, plastic) give insights into a compound’s distribution, reduce misprediction of cellular processes, e.g. biotransformation, and help to interpret kinetic data. On the other hand, the limits of in vitro approaches have also been pointed out. For correct extrapolation to in vivo, it is essential that the studied in vitro system exhibits the functionality of proteins, which play a key role in the specific drug induced toxicity. Considering the benefits and limitations, it is worth to validate this long-term treatment experimental set-up and expand it on co-culture systems and on organs-on-chips with regard to alternative toxicity testing strategies for repeated dose toxicity studies.