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The work presented in this thesis was mainly targeted at exploring the capabilities of evaporation based LC detectors as well as further alternatives for the control of impurities in substances not exhibiting a suitable chromophore for UV-detection. In the course of the work carried out, several new methods for the identification, impurities control and composition testing of APIs were elaborated. An evaporation based detector that entered into the field of pharmaceutical analysis in the recent years was the Evaporative Light Scattering Detector (ELSD). However, non-reproducible spikes were reported when injecting concentrated test solutions as they are usually required for the control of impurities. The reasons, for the appearance of these spikes as well as possibilities for their avoidance were explored in a systematic study. Moreover, the dependence of the detector sensitivity on different eluent composition, eluent flow-rate and ELSD settings was investigated. In the course of the revision of the Ph.Eur. monographs for aspartic acid and alanine, a C18 reversed phase ion-pair LC method using 1 mmol/L of perfluoroheptanoic acid as an ion-pair reagent and a charged aerosol detector (CAD) was developed and fully validated for the purity control of Asp. The method was capable of separating the organic acids and major amino acids known to occur as process related impurities. With a slight modification, the method was also applicable for the purity control of Ala. Based on the developed LC-CAD method for the impurity control of alanine, a comparative study of the performance characteristics of different evaporation based LC detectors, i.e. ELSD, CAD and the recently developed Nano Quantity Analyte Detector (NQAD) was carried out. Additionally, an MS detector and qNMR were included in this study. It was found that the control of impurities in Alanine at an ICH conform level could be ensured using LC coupled to CAD, MSD and NQAD detection as well as by the use of qNMR. In terms of performance, prize and ease of use CAD and NQAD were found to be the most suitable alternatives. In terms of repeatability and sensitivity, the CAD appeared slightly superior to the NQAD. The quality of streptomycin sulfate is not sufficiently controlled by the current Ph.Eur. monograph in that an appropriate test for the control of the related substances is missing. A study was carried out to develop a C18 reversed phase ion-pair LC method using pentafluoropropionic acid as an ion-pair reagent and a CAD for the identification and control of the related substances. The developed method allowed the separation of 21 impurities from streptomycin. Moreover, coupling of the method to MS allowed the identification of the separated impurities. The method was shown to be sufficiently sensitive to control the related substances with a disregard limit of 0.1% as it is normally applied in the Ph.Eur. for products derived from fermentation. Currently, the aescin content of horse-chestnut standardized dry extract is determined using a complex and laborious photometric determination. A more selective LC-UV assay determination for beta-aescin has been proposed for the Ph.Eur. draft monograph of horse-chestnut standardized dry extract. Possibilities were explored to further improve the LC-method using detection by CAD. It was demonstrated that by the use of a modified LC-CAD method several problems related to the differences in the UV-response of the various components contained in the active aescin fraction could be eliminated. Moreover the proposed reference standard strategy was reviewed. Eventually, it was demonstrated on the example of two different clusters of pharmacologically active peptides how low energy collision induced dissociation mass spectrometry (low energy CID-MS) can successfully be used for identification testing in pharmacopoeial monographs. In this respect, the combination of a direct confirmation of the molecular mass via the m/z-ratio of the molecule ions with structural sequence information obtained by low energy CID-MS experiments was found to deliver a higher degree of certainty of the identity of a given substance than the set of tests currently described in the monographs. A significant gain in efficiency and throughput and important reduction of the amount of sample consumed during testing were identified as being additional advantages of this approach. Taken together, it could be demonstrated on various examples how recent technological advancements in the field of analytical chemistry can contribute to improve the quality control of APIs.
Starting in the late 1990s ionic liquids (ILs) gained momentum both in academia as well as industry. ILs are defined as organic salts with a melting point below 100 °C. Active pharmaceutical ingredients (APIs) may be transferred into ILs by creating salts with a bulky counterion with a soft electron density. ILs have demonstrated the potential to tune important pharmaceutical features such as the solubility and the dissolution rate, particularly addressing the challenge of poor water soluble drugs (PWSD). Due to the tunability of ILs, modification of physico-chemical properties of APIs may be envisioned without any modifications of the chemical structure.
In the first chapter the potential as well as the limitation of ILs are discussed. The chapter commences with an overview of preparation and characterization of API-ILs. Moreover, examples for pharmaceutical parameters are presented which may be affected by IL formation, including the dissolution rate, kinetic solubility or hygroscopicity as well as biopharmaceutical performance and toxicology. The impact of IL formation on those pharmaceutically relevant features is highlighted, resulting in a blueprint for a novel formulation concept to overcome PWSD challenges without the need for structural changes of the API.
Within the second chapter the IL concept is detailed for one specific API - counterion combination. A poorly water soluble acidic API against migraine attacks was transformed into an IL in an effort to minimize the time to maximum plasma concentration (tmax) and optimize the overall bioavailability. These studies were conducted in parallel to a prodrug of the API for comparison of the IL strategy versus a strategy involving modification of the API’s structure. A significantly longer duration of API supersaturation and a 700 fold faster dissolution rate of the IL in comparison to the free acid were obtained and the underlying mechanism was elucidated. The transepithelial absorption was determined using Caco-2 cell layers. For the IL about 3 times more substance was transported in comparison to the prodrug when substances were applied as suspensions, despite the higher permeability of the prodrug, as increased solubility of the IL exceeded this effect. Cytotoxicity of the counterion was assessed in hepatic, renal and macrophage cell lines, respectively, and IC50 values were in the upper µM / lower mM range. The outcome of the study suggested the IL approach instrumental for tuning biopharmaceutical properties, without structural changes of the API as required for preparation of prodrugs. Thus the toolbox for formulation strategies of poorly water soluble drugs could be extended by an efficient concept.
The third chapter focuses on the effect of different counterions on the physico-chemical properties of an API-IL, in particular to overcome the challenge of poor water solubility. Therefore, the same poorly water soluble acidic API against migraine attacks mentioned above was combined with 36 counterions resulting in ILs and low lattice enthalpy salts (LLES). Depending on the counterions, different dissolution rates, durations of supersaturation and hygroscopicities were obtained and release profiles could be tailored from immediate to sustained release. Besides, in vitro the cytotoxicity of the counterions was assessed in three cell lines. Using molecular descriptors such as the number of hydrophobic atoms, the graph theoretical diameter and the number of positive charges of the counterion, the dissolution rate, supersaturation and hygroscopicity as well as the cytotoxicity of counterions could be adequately modeled, rendering it possible to predict properties of new LLESs.
Within the forth chapter different poorly water soluble APIs were combined with the counterion tetrabutylphosphonium (TBP) studying the impact on the pharmaceutical and physical properties of the APIs. TBP-ILs and low lattice enthalpy salts were prepared of the acidic APIs Diclofenac, Ibuprofen, Ketoprofen, Naproxen, Sulfadiazine, Sulfamethoxazole and Tolbutamide. NMR and IR spectroscopy, DSC, XRPD, DVS and dissolution rate measurements, release profiles and saturation concentration measurements were used to characterize the free acids and TBP salts as compared to the corresponding sodium salts. The TBP salts as compared to the free acids displayed lower melting points and glass transition temperatures and up to 1000 times higher dissolution rates. The increase in the dissolution rate directly correlated with the salts’ hygroscopicity, an aspect which is critically discussed in terms of pharmaceutical translation challenges. In summary TBP ILs of solid salts were proved instrumental to approach the challenge of poor water solubility. The outcome profiled tailor-made counterions as a powerful formulation strategy to address poor water solubility, hence bioavailability and ultimately therapeutic potential of challenging APIs.
In summary, a plethora of ILs and LLESs were prepared by combination of different acidic APIs and counterions. The IL and LLESs concept was compared to conventional salt and prodrug strategies. By choice of the counterion, biopharmaceutical relevant parameters were deliberately modified and release profiles were tuned ranging from immediate to prolonged release. The impact of distinct structural counterion features controlling the dissolution, supersaturation, hygroscopicity and counterion cytotoxicity were identified, correlations were presented and predictive models were built. ILs and LLESs could be proven to be a powerful concept for the formulation of poorly water soluble acidic APIs.
Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Klärung der Fragestellung, ob sich die quantitative NMR-Spektroskopie zur Bestimmung von Identität, Reinheit und Gehalt von Arzneistoffen eignet, und wie sich Präzision und Empfindlichkeit dieser Methode im Vergleich zu etablierten chromatographischen Verfahren verhalten. Die quantitative Untersuchung der drei strukturell jeweils verwandten Mehrkomponentengemische Codergocrinmesilat, Clomifencitrat und Flupentixoldihydrochlorid bewies eindrucksvoll die Eignung der 1H-NMR-Spektroskopie als orthogonale, analytische Messmethode im Vergleich zu validierten HPLC-Arzneibuchmethoden. Die im Rahmen einer Validierung der 1H-NMR-Methode ermittelten Ergebnisse erfüllten bezüglich Präzision und Richtigkeit die an eine im pharmazeutischen Bereich eingesetzte analytische Methode gestellten Anforderungen; zudem wurden weitere Prüfparameter wie Selektivität, Linearität, Robustheit und Stabilität verifiziert. Externe-Standard-Experimente wie "Zwei-Röhrchen-Methode" und ERETIC-Verfahren bestätigten die quantitativen Ergebnisse der Internen Standardisierung; jedoch wurde hier -- insbesondere für die ERETIC-Technik -- eine höhere Fehleranfälligkeit und somit eine größere Streuung der Einzelergebnisse beobachtet. Am Beispiel von Codergocrinmesilat und Flupentixoldihydrochlorid konnte zudem die Eignung anderer NMR-aktiver Kerne wie 13C und 19F für die quantitative Analyse von komplexen Substanzgemischen aufgezeigt werden. Das Potential der 1H-NMR-Spektroskopie für die Reinheitsprüfung von Arzneistoffen wurde am Beispiel der Aminosäure L-Alanin aufgezeigt. Die zu erwartenden Verunreinigungen Glutamin-, Asparagin-, Äpfel- und Fumarsäure konnten im Gegensatz zu den "veralteten" Prüfmethoden des Europäischen Arzneibuches eindeutig identifiziert und quantifiziert werden; mit einer Bestimmungsgrenze von <= 0.03% wurden die Vorgaben der ICH-Richtlinie Q3A(R2) erfüllt. Die deutliche Übereinstimmung der NMR-spektroskopisch ermittelten Ergebnisse einer quantitativ untersuchten Alanin-Modellmischung mit einer für den Routinebetrieb geeigneten HPLC-Methode unter Einsatz verschiedener Detektoren wie CAD, NQAD, ELSD und MS, sowie der Vergleich wichtiger Prüfparameter wie Linearität und Nachweisgrenze bestätigten die Eignung der 1H-NMR-Spektroskopie im Rahmen der routinemäßig durchgeführten Qualitätskontrolle. Die Aufdeckung von Arzneimittelfälschungen mit Hilfe der NMR-Spektroskopie wurde im Rahmen dieser Arbeit anhand der zwei aktuellen Fallbeispiele Heparin und Glycerin näher untersucht. Die in Zusammenhang mit dem Heparin-Skandal verantwortliche Kontaminante OSCS konnte neben Dermatansulfat und weiteren natürlich vorkommenden Glykosaminoglykan-Verunreinigungen im 1H-NMR-Spektrum eindeutig identifiziert und auf 0.1% OSCS bzw. 0.5% Dermatansulfat begrenzt werden. Eine präzise und richtige quantitative Bestimmung der beiden Glykosaminoglykane wurde über die N-Acetyl-Resonanzen mit Hilfe der Signalhöhenbestimmung und dem Standard-Additionsverfahren ermöglicht; deutliche Abweichungen vom "wahren" Gehalt wurden hingegen, bedingt durch starke Signalüberlagerungen, nach Flächenvergleich beobachtet. Weitere Verunreinigungen, insbesondere Lösungsmittelrückstände, die während des Extraktions- und Reinigungsprozesses des Heparins eingesetzt werden, konnten ebenfalls über charakteristische Resonanzen identifiziert und mit Hilfe der Internen-Standard-Methode quantitativ erfasst werden. Eine umfangreiche Untersuchung von 145 Heparin-API-Mustern mittels NMR-Spektroskopie und weiteren, neuentwickelten Verfahren wie HPLC, CE, IR- und Raman-Spektroskopie konnte die Eignung der entwickelten 1H-NMR-Methode bestätigen. Potentielle Glycerin-Kontaminanten wie Diethylenglycol und Ethylenglycol konnten ebenso wie eine weitere, natürlich vorkommende Verunreinigung, Propylenglycol, mittels 1H- und 13C-NMR-Spektroskopie identifiziert und quantifiziert werden. Beide Methoden erfüllten die in der USP beschriebenen Anforderungen, die für pharmazeutisch eingesetztes Glycerin jeweils höchstens 0.1% Diethylenglycol bzw. Ethylenglycol erlaubt. Während die quantitative Reinheitsprüfung beim Einsatz der 1H-NMR-Spektroskopie mit einer Messdauer im Bereich von etwa 30 min für den Routineeinsatz geeignet ist, ist die entwickelte quantitative 13C-NMR-Methode beim Einsatz von Spektrometern geringer Magnetfeldstärke aufgrund einer geringen Nachweisempfindlichkeit und der NOE-Problematik für den Routinebetrieb nur bedingt anwendbar. Abschließend kann zusammengefasst werden, dass die untersuchten Beispiele die NMR-Spektroskopie als in hohem Maße geeignet für die quantitative Analyse von Arzneimitteln ausweisen.
Bevor ein zellbasiertes GTMP erstmalig beim Menschen angewendet werden kann, müssen verschiedene notwendige nicht-klinische Studien durchgeführt werden. Wichtig ist hier u.a. die Untersuchung der Biodistribution im Tiermodel. Diese umfasst die Verteilung, das Engraftment, die Persistenz, die Eliminierung und gegebenenfalls die Expansion der humanen Zellen in verschiedenen Organen, meistens im Mausmodel. Deshalb wurde eine qPCR-basierte Analysenmethode entwickelt, mit der humane genomische DNA innerhalb von muriner genomischer DNA bestimmt werden kann, und entsprechend den regulatorischen Richtlinien der European Medicines Agency und des International Council for Harmonisation validiert. Anschließend wurde diese Methode innerhalb einer präklinischen worst-case Szenario Biodistributionsstudie angewendet. Das Ziel dieser Studie war die Untersuchung des Biodistributionsprofils von genetisch modifizierten Blood Outgrowth Endothelial Cells von Hämophilie A Patienten 24 Stunden und sieben Tage nach intravenöser Applikation einer Dosis von 2x106 Zellen. Die Isolation, genetische Modifikation und die Expansion der Zellen sollte entsprechend den Richtlinien der Guten Herstellungspraxis durchgeführt werden. Hierbei ist die Auswahl und Anwendung geeigneter und essentieller Rohstoffe wichtig. Gleichermaßen ist die Durchführung einer definierten Qualitätskontrollstrategie notwendig und die Patientenzellen sollten nur innerhalb von nicht-klinischen Studien eingesetzt werden, wenn alle Akzeptanzkriterien erfüllt wurden. Die Validierung der qPCR-Methode zeigte eine hohe Genauigkeit, Präzision und Linearität innerhalb des Konzentrationsintervalls von 1:1x103 bis 1:1x106 humanen zu murinen Genomen. Bei Anwendung dieser Methode für die Biodistributionsstudie konnten nach 24 Stunden humane Genome in vier der acht untersuchten Mausorgane bestimmt werden. Nach sieben Tagen konnten in keinem der acht Organe humane Genome nachgewiesen werden...
Kapillarelektrophoretische Reinheitsanalytik verschiedener Arzneistoffe des Europäischen Arzneibuchs
(2011)
Die Kapillarelektophorese (CE), deren Trennprinzip auf der Wanderung geladener Teilchen im elektrischen Feld basiert, ist eine Methode, die in verschiedenen Techniken angewandt werden kann. Sowohl die wässrige Kapillarzonenelektrophorese (CZE) als auch die wasserfreie CE (NACE), aber auch die elektrokinetische Chromatographie mittels Mikroemulsion (MEEKC) wurden in dieser Arbeit für die Reinheitsanalytik der im Europäischen Arzneibuch beschriebenen Wirkstoffe Ethambutol, Quetiapin, Ephedrin sowie Levodopa und deren jeweils strukturverwandter Substanzen benutzt. Der Wirkstoff Ethambutol wird in der (S,S)-Form verwendet, die im Ph. Eur. 7 als Dihydrochlorid aufgeführt ist. Um eine Trennmethode für (S,S)-Ethambutol, sein Enantiomer und die achirale meso-Verbindung entwickeln zu können, wurden die beiden stereoisomeren Verunreinigungen aus 2-Amino-1-butanol und Diethyloxalat synthetisiert. Zur Trennung dieser drei Ethambutol-Isomere wurde CZE als Methode gewählt. In saurem Phosphatpuffer musste eine hohe Probenkonzentration von 1 mg/ml verwendet werden, um die Substanzen mit UV detektieren zu können (λ: 200 nm). In alkalischem Tetraboratpuffer war das Chromophor dank der freien Elektronenpaare der Stickstoff-Moleküle besser ausgeprägt und die Intensität der Peaks deutlich intensiver. Als chirale Selektoren wurden die nativen α-, β- und γ-Cyclodextine (CDs) und verschiedene derivatisierte β-CDs eingesetzt. Die Methode wurde vielfach in Bezug auf Molarität und pH-Wert der Puffer, Konzentration der verschiedenen chiralen Selektoren, Spannung und Temperatur modifiziert. Jedoch konnte keine Trennung der Stereoisomere erreicht werden. Eine CD-modifizierte MEEKC-Methode wurde herangezogen, um die Racemate der Aminosäuren Dopa, Methyldopa, Tyrosin und Phenylalanin voneinander zu trennen. Dazu wurde eine Mikroemulsion (ME) aus Ethylacetat, SDS, 1-Butanol, Phosphatpuffer, sulf. β-CD und, wenn nötig, aus dem organischen Modifier 2-Propanol eingesetzt. Für jede DL-Aminosäure wurde die Zusammensetzung der ME als auch die Geräteeinstellungen (Spannung, Temperatur) optimiert. Die Trennung von DL-Dopa konnte ohne Zugabe eines organischen Modifiers durchgeführt werden. Auf Grundlage dieser individuellen Methoden wurden zwei CD-modifizierte MEEKC-Methoden entwickelt, mit denen alle vier untersuchten Racemate getrennt werden konnten. Die abschließende Validierung in Bezug auf Wiederholpräzision (Auflösung, Migrationszeiten, Verhältnis der korrigierten Peakflächen und Anzahl der theoretischen Böden) und Detektionsgrenzen zeigte, dass die Methoden präzise Ergebnisse liefern. Die Technik der MEEKC wurde auch zur Trennung von Ephedrin-Derivaten genutzt. Wedig et al. konnten die Racemate von Ephedrin, Pseudoephedrin, N-Methylephedrin und Norephedrin mit einer HDAS-β-CD-modifizierten CZE-Methode in einem Lauf basislinientrennen, indem ein 50 mM Phosphatpuffer, pH 3,0 als HGE eingesetzt wurde. Aus diesem HGE und den organischen Bestandteilen, die zur Trennung der Aminosäuren führten, wurde eine ME hergestellt. Entgegen der Methode von Wedig et al. konnte mittels HDAS-β-CD keine zufriedenstellende Trennleistung erreicht werden. Durch Austausch des chiralen Selektors gegen sulf. β-CD und Modifizierung des Phosphatpuffers in Ionenstärke und pH-Wert konnte für alle vier Epedrin-Derivate eine Basislinientrennung erzielt werden. Diese MEEKC-Methode wurde auf weitere Ephedrin-Derivate angewandt, wodurch das racemische 2-(Dibutylamino)-1-phenyl-1-propanol partiell, die Racemate von Adrenalin, 2-Amino-1-phenylethanol und Diethylnorephedrin vollständig voneinander getrennt werden konnten. Während mit der HDAS-β-CD-modifizierten CZE-Methode alle vier Ephedrin-Derivaten in einem Lauf getrennt werden konnten, hat die MEEKC-Methode den Vorteil mit dem kostengünstigeren sulf. β-CD auszukommen. Schlussendlich wurde eine Reinheitsanalytik von Quetiapin und seinen verwandten Substanzen Quetiapindesethanol, Quetiapin-N-Oxid und Quetiapinlactam entwickelt. Da Quetiapinlactam fast ausschließlich in organischen Lösungsmitteln löslich ist, sollte eine wasserfreie CE-Methode (NACE) eingesetzt werden. Zwar konnte eine Methode entwickelt werden, deren HGE aus Methanol, Acetonitril, Ammoniumacetat und Essigsäure bestand, und mit der Quetiapin und seine drei verwandten Substanzen sehr gut getrennt werden konnten. Allerdings konnte sie aufgrund von Stromabbrüchen nicht validiert werden. Alternativ wurde eine wässrige, gut reproduzierbare CZE-Methode gefunden, deren Elektrolytlösung aus einem 80 mM Phosphatpuffer, pH 4.0 bestand. Aufgrund der Wasserunlöslichkeit von Quetiapinlactam konnten so nur Quetiapin und die Verunreinigungen Quetiapindesethanol und Quetiapin-N-Oxid erfasst werden. Abschließend wurde die CZE-Methode validiert, wodurch die hohe Präzision der ermittelten Werte gezeigt werden konnte.
Quantitative Bestimmungen Anhand verschiedener Substanzen konnte im Rahmen dieser Arbeit gezeigt werden, dass die NMR-Spektroskopie in der Lage ist, Verunreinigungen von Arzneistoffen zu quantifizieren. Für das Antidepressivum Fluvoxamin ist im Arzneibuch eine Ionenpaarchroma-tographie vorgeschrieben, um die Verunreinigung des wirksamen E-Isomers durch das Z-Isomer zu quantifizieren. Ionenpaarchromatographischen Methoden mangelt es häufig an der Robustheit. Eine quantitative Auswertung der NMR-Spektren einer Mischung beider Isomere ist ohne aufwändige Probenvorbereitung möglich. In den 1H-NMR-Spektren der Mischung sind die Signale der Was-serstoffe beider Isomere an Position 2 gut voneinander getrennt. Werden diese quantitativ ausgewertet, dann ist es nach Optimierung insbesondere hinsichtlich der T1-Relaxationszeit möglich, den Anteil des Z-Isomers auf 0,2 % zu begrenzen. Auch für die Bestimmung der Abbauprodukte des Perphenazinenantats konnte gezeigt werden, dass die qNMR eine geeignete Methode darstellt. Perphenazine-nantat kann durch Esterhydrolyse gespalten werden. Zur Auswertung der 1H-NMR-Spektren wird der Vergleich der Integralflächen der Signale der Wasserstoffe an Position 21 des Perphenazins mit dem zusammenfallenden Signal der Wasserstoffe an Position 11 beider Substanzen herangezogen. Es konnte sowohl Perphenazin als Abbauprodukt des Esters als auch Perphena-zinenantat in Perphenazin quantifiziert werden. Zusätzlich kann der Bereich der aromatischen Wasserstoffe zu einer Aussage über die Oxidation genutzt werden. Bei der Oxidation des Schwefels im Phenothiazinring zum Sulfoxid und zum Sul-fon ändern sich die chemischen Verschiebungen der Wasserstoffkerne in diesem Ringsystem. Dadurch wird eine halbquantitative Aussage ermöglicht. Schließlich konnten die beiden Epimere Chinin und Chinidin jeweils als Verunrei-nigung des anderen Chinaalkaloides quantifiziert werden. Auch in diesem Fall lie-gen in den 1H-NMR-Spektren in DMSO-d6 von Mischungen dieser beiden Verbin-dungen Signale weit genug auseinander, um eine Quantifizierung zu ermöglichen. In beiden Fällen, der Bestimmung von Chinidin in Chinin und von Chinin in Chini-din konnte dies auf einem Niveau von 2,5% geschehen, was den Anforderungen der Arzneibücher entspricht. Gentamicinsulfat Die 1H-NMR-Spektroskopie wurde ebenfalls zur Charakterisierung der Zusam-mensetzung des Antibiotkums Gentamicin eingesetzt. Gentamicin, das fermentativ aus Micromonospora purpurea gewonnen wird, besteht aus verschiedenen Haupt- und Nebenkomponenten, deren Zusammensetzung je nach Fermentationsbedingungen schwankt. Nach einer Reihe von Todesfällen im Zusammenhang mit der Anwendung des Antibiotikums Gentamicin in den USA wurde vermutet, dass diese auf verschiede-ne Verunreinigungen zurückzuführen sind. In der aktuellen Arzneibuch-Monographie wird eine HPLC-Methode beschrieben, die zwar die Hauptkomponenten quantifizieren kann, aber nicht alle Nebenkomponenten gut abtrennt. Auch ist die gesamte Elutionszeit sehr lang, so dass spät eluierende Substanzen breite Peaks zeigen. Außerdem ist der benutzte gepulste amperometrische Detektor sehr empfindlich und die Methode insgesamt daher wenig robust. Unter Zuhilfenahme von ein- und zweidimensionalen Standardmesstechniken sowie selektiver TOCSY-Messungen konnten alle Signale in den 1H- und 13C-NMR-Spektren der Haupt- und Nebenkomponenten von Gentamicin vollständig zugeordnet werden. Dabei zeigte sich, dass der Bereich der anomeren Wasserstoffe sehr gut geeignet ist, Aussagen über die Reinheit und über das Verhältnis der Hauptkomponenten zueinander treffen zu können. In dem in der Abbildung gezeigten Ausschnitt aus einem 400 MHz-1H-NMR-Spektrum ist eine Integration der H20-Signale der Hauptkomponenten aufgrund mangelnder Trennung nicht möglich. Diese ist jedoch in 600 MHz-Spektren möglich. Auf diese Weise können die Verhältnisse der Hauptkomponenten zueinander bestimmt werden. Die so erhaltenen Ergebnisse zeigen eine sehr gute Übereinstimmung mit den aus einer MEKC-Trennung erhaltenen Daten. Das zeigt die sehr gute Ergänzung dieser beiden Methoden. Insgesamt wurden für diese Arbeit über 40 Gentamicin-Proben verschiedener Hersteller untersucht, miteinander verglichen und in verschiedene Gruppen einge-teilt. Als Leitverunreinigung hat sich dabei Sisomicin erwiesen. Daneben konnte der Vergleich der Verunreinigungsprofile Hinweise auf Handelswege geben. Unter den untersuchten Proben waren auch diejenigen, zu den Todesfällen führten. Die-se konnten den stark verunreinigten Gruppen zugeordnet werden.
This thesis concerns (i) the synthesis and olfactory characterisation of silicon-containing analogues of the musk odourant phantolide, (ii) the synthesis and pharmacological investigation of silicon-containing analogues of retinoids of the EC23 and TTNN type and (iii) the attempted syntheses of silicon-containing analogues of the antipsychotic penfluridol and the antidiarrhoeal agent loperamide. All target compounds and intermediates were characterised by multinuclear NMR studies (1H, 13C, 15N, 19F, 29Si) and elemental analyses or high-resolution mass spectrometry. Additionally, some of these compounds were characterized by single crystal X-ray diffraction studies.
Although the prevalence of substandard and counterfeit pharmaceutical products is a global problem, it is more critical in resource-constrained countries. The national medicines regulatory authorities (MNRA) in these countries have limited resources to cater for regular quality surveillance programmes aimed at ensuring that medicines in circulation are of acceptable quality. Among the reasons explained to hinder the implementation of these strategies is that compendial monographs are too complicated and require expensive infrastructures in terms of environment, equipment and consumables. In this study it was therefore aimed at developing simple, precise, and robust HPLC and HPTLC methods utilizing inexpensive, readily available chemicals (methanol and simple buffers) that can determine the APIs, other API than declared one, and which are capable of impurity profiling. As an outcome of this study, three isocratic and robust HPLC and two HPTLC methods for sulfadoxine, sulfalene, pyrimethamine, primaquine, artesunate, as well as amodiaquine have been developed and validated. All HPLC methods are operated using an isocratic elution mode which means they can be implemented even with a single pump HPLC system and standard C18 columns. The densitometric sulfadoxine/sulfalene and pyrimethamine method utilizes standard TLC plates as well as inexpensive, readily available and safe chemicals (toluene, methanol, and ethyl acetate), while that for artesunate and amodiaquine requires HPTLC plates as well as triethylamine and acetonitrile due to challenges associated with the analysis of amodiaquine and poorly the detectable artesunate. These HPTLC methods can be implemented as alternative to those requiring HPLC equipment e.g. in countries that already have acquired densitometer equipment. It is understood that HPTLC methods are less sensitive, precise and accurate when compared to HPLC methods, but this hindrance can easily be addressed by sending representative samples to third party quality control laboratories where the analytical results are verified using compendial HPLC methods on a regular basis.
It is therefore anticipated that the implementation of these methods will not only address the problem of limited resources required for medicines quality control but also increase the number of monitored targeted antimalarial products as well as the number of resource- constrained countries participating in quality monitoring campaigns. Moreover, the experiences and skills acquired within this work will be applied to other API groups, e. g. antibiotics, afterwards.
Weltweit sind über 34 Millionen Menschen mit dem HI-Virus infiziert, täglich steigt die Zahl weiter an. Es liegt auf der Hand, dass die Forschung zur Bekämpfung der Replikation des Virus stetig weiter geführt werden muss. In dieser Arbeit wurden die Grundlagen für einen neuartigen HIV-Therapieansatz geschaffen. Dabei steht nicht die Hemmung von Replikations-essentiellen Enzymen wie Protease, Reverse Transkriptase oder Integrase im Vordergrund, sondern die Aufrechterhaltung des humanen retroviralen Schutzes. Durch Hemmung der vif–Elongin-C-Interaktion mit Elongin-C-Inhibitoren bleibt der Organismus in der Lage, sich mithilfe von APOBEC3G auf natürlichem Wege vor dem HI-Virus zu schützen, unabhängig von viralen Mutationen. Aufgrund der Tatsachen, dass die Kristallstruktur von Elongin-C und der Bindemodus von vif in der essentiellen Bindetasche des Proteins aufgeklärt sind, konnten durch Docking-Berechnungen in der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Christoph Sotriffer in-silico Substanzen bestimmt werden, die theoretisch mit hoher Affinität in die Bindetasche binden und so vif aus dieser verdrängen. Basierend auf diesen Docking-Studien wurden im Rahmen dieser Arbeit ca. 50 potentielle Inhibitoren synthetisiert und weitere 27 Substanzen kommerziell erworben. Diese wurden anschließend zum größten Teil in der Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Axel Rethwilm in einer zellulären Testvariante auf Hemmung des APOBEC3G-Abbaus getestet. Dabei erwies sich die Substanz A19 (FM329, Abb. 7.1) als sehr effektiv. Zur Bestätigung dieses Testergebnisses wurde A19 weiterhin in der Arbeitsgruppe von PD Dr. Jochen Bodem auf Hemmung der Replikation der Viren untersucht. Auch hier hemmt A19 die Replikation des Virus bei einer Konzentration von 30 µM zu 100%. Da allerdings die Hemmung des Abbaus von APOBEC3G bzw. der Replikation des Virus kein Nachweis auf die tatsächliche postulierte Interaktion zwischen dem Inhibitor und der Bindetasche des Proteins ist, wurde im weiteren Verlauf versucht diese Interaktion nachzuweisen. Dazu wurde zunächst unter Anleitung von Mitarbeitern des Arbeitskreises von Prof. Dr. Caroline Kisker das Targetprotein exprimiert und isoliert. Damit konnten erste Versuche zur Bindungsaufklärung durchgeführt werden. Diese beliefen sich auf Mikrokalorimetrie-Experimente und Surface-Plasmon-Resonance Untersuchungen. Erste Indizien für eine Wechselwirkung zwischen dem Inhibitor und dem Protein konnten damit bereits ermittelt werden, ein eindeutig positives Ergebnis wurde allerdings noch nicht erzielt.
In the current work, several well-known pharmaceuticals (1,4-dihydrazinophthalazine sulfate, caffeine, and papaverine hydrochloride) and new organometallic compounds (nickel(II) cupferronato complexes NiL2An, L = PhN2O2-, n = 1, A = o-phenanthroline (1), o,o’-bipyridine (2) and n = 2, A = H2O (3), o-NH2Py (4), o-C6H4(NH2)2 (5); silylene-bridged dinuclear iron complexes [Cp(OC)2Fe]2SiX2 (X = H (6), F (7), Cl (8), Br (9), I (10)); 3-silaoxetane 3,3-dimethyl-2,2,4,4-tetraphenyl-1-oxa-3-silacyclobutane (11) and 3-silathietane 3,3-dimethyl-2,2,4,4-tetraphenyl-1-sila-3-thiacyclobutane (12) compounds), which have successfully been characterized by using vibrational spectroscopy in conjunction with accurate density functional theory (DFT) calculations, are presented. The DFT computed molecular geometries of the species of interest reproduced the crystal structure data very well and in conjunction with IR and Raman measurements helped us to clarify the structures of the compounds, for which no experimental data were available; and this, especially for the new organometallic compounds, where the X-Ray analysis was limited by the non-availability of single crystals (3, 5, 10). Furthermore, a natural population analysis (NPA) and natural bond orbital (NBO) calculations together with a detailed analysis of the IR and Raman experimental as well as calculated spectra of the new organometallic compounds, allowed us to study some special bonding situations (1-12) or to monitor the structural changes observed with the change in temperature during the Raman experiments (11, 12). By combining these two methods (DFT and vibrational spectroscopy), the auspicious results obtained on the organometallic compounds 6-12 and overall in literature, made us confident of the power of theoretical calculations in aiding the interpretation of rich SERS spectra by solving some interesting issues. Consequently, the Raman and SERS spectra of well-known pharmaceuticals (1,4-dihydrazinophthalazine sulfate, caffeine, and papaverine hydrochloride) or new potentially biological active organometallic complexes (1-5), that were synthetized by our coworkers, were discussed with the assistance of the accurate results obtained from DFT calculations (structural parameters, harmonic vibrational wavenumbers, Raman scattering activities), and many previous incomplete assignments have been analyzed and improved. This allowed us to establish the vibrational behavior of these biological compounds near a biological artificial model at different pH values or concentrations (Ag substrate), taking into account that information about the species present under particular conditions could be of great importance for the interpretation of biochemical processes. The total electron density of molecules and the partial charges situated on selected atoms, which were determined theoretically by NPA, allowed us to establish the probability of different atoms acting as an adsorptive site for the metal surface. Moreover, a closer examination of the calculated orbitals of molecules brought further arguments on the presence or absence of the photoproducts at the Ag surface during the irradiation (1,4-dihydrazinophthalazine sulfate). Overall, the results provide a benchmark illustration of the virtues of DFT in aiding the interpretation of rich vibrational spectra attainable for larger polyatomic adsorbates by using SERS, as well as in furnishing detailed insight into the relation between the vibrational properties and the nature of the Ag substrate-adsorbate bonding. Therefore, we strongly believe that theoretical calculations will become a matter of rapidly growing scientific and practical interest in SERS.