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In this work we wanted to investigate the role of NFATc1 in lymphocyte physiology and in pathological conditions (eg. psoriasis). NFATc1 is part of the signal transduction
pathways that regulates B cells activation and function. NFATc1 has different isoforms that are due to different promoters (P1 and P2), polyadenylation and alternative splicing. Moreover, we tried to elucidate the points of interactions between the NFAT and the NF-κB pathways in
activated B-cell fate. NFAT and NF-κB factors share several properties, such as a similar mode of induction and architecture in their DNA binding domain. We used mice which over-express a constitutive active version of NFATc1/α in their B cells with -or without- an ablated IRF4. IRF4 inhibits cell cycle progression of germinal center B cell-derived Burkitt’s lymphoma cells and
induces terminal differentiation toward plasma cells. Our experiments showed that a ‘double hit’ in factors affecting B cell activation (NFATc1 in this case) and late B cell Differentiation (IRF4 in this case) alter the development of the B cells, lead to increase in their numbers and increase in stimulation induced proliferation. Therefore, the overall picture indicates a link between these 2 genes and probable carcinogenic alterations that may occur in B cells.
We also show that in splenic B cells, c-Rel (of the NF-κB canonical pathway) Support the induction of NFATc1/αA through BCR signals. We also found evidence that the lack of NFATc1 affects the expression of Rel-B (of the NF-κB non-canonical pathway). These data suggest a tight interplay between NFATc1 and NF-κB in B cells, influencing the competence of B cells and their functions in peripheral tissues.
We also used IMQ-induced psoriasis-like inflammation on mice which either lack NFATc1 from B cell. Psoriasis is a systemic chronic immunological disease characterized
primarily by abnormal accelerated proliferation of the skin keratinocytes. In psoriasis, the precipitating event leads to immune cell activation. Our experiments showed that NFATc1 is needed for the development of psoriasis. It also showed that IL-10 is the link that enables NFAT
from altering the B cell compartment (eg Bregs) in order to affect inflammation. The important role of B cell in psoriasis is supported by the flared up psoriasis-like inflammation in mice that lack B cells. Bregs is a special type of B cells that regulate other B cells and T cells; tuning the immunological response through immunomodulatory cytokines.
Der transkriptionelle Koaktivator BOB.1/OBF.1 spielt eine wichtige Rolle in der oktamer-abhängigen Transkription in B-Lymphozyten. Mäuse, denen dieser Koaktivator fehlt, zeigen verschiedene Defekte in der B-Zellentwicklung. Besonders auffällig ist hierbei das völlige Fehlen der Keimzentren. Übereinstimmend mit diesem Phänotyp zeigten B-Zellen des Keimzentrums eine stark erhöhte BOB.1/OBF.1-Expression im Vergleich zu ruhenden B-Zellen. Im Gegensatz zu primären B-Zellen unterschiedlicher Entwicklungsstadien zeigen transformierte korrespondierende B-Zellen keine Regulation der BOB.1/OBF.1-Expression. T-Zellen exprimieren im Gegensatz dazu BOB.1/OBF.1 erst nach Stimulation mit PMA und Ionomycin. Um die unterschiedliche Regulation in B-Zellen versus T-Zellen zu untersuchen wurde der BOB.1/OBF.1-Promotor kloniert. Die Analyse der Promotor-Sequenz ergab Bindungsstellen für die Transkriptionsfaktoren CREB, NF-AT und ein SRY-Motiv. In Transfektionsstudien konnte eine deutliche Zellspezifität des Promotors gezeigt werden. Die erwartete induzierbare Aktivierung in T-Zellen war hingegen nur schwach. Die Analyse der BOB.1/OBF.1-Regulation in B-Zellen des Keimzentrums ergab, daß die verstärkte BOB.1/OBF.1-Expression nur partiell auf eine erhöhte Expression des BOB.1/OBF.1-Transkriptes zurück zu führen ist. Vielmehr zeigte sich eine deutliche Regulation des BOB.1/OBF.1-Proteins. In einem "yeast-two hybrid screen" mit der amino-terminalen Domäne von BOB.1/OBF.1 als "bait" (Köder) konnten die beiden Proteine SIAH1 und SIAH2 als Interaktionspartner identifiziert werden. Eine beschriebene Funktion von SIAH1 und SIAH2 liegt in der Regulation der Proteinstabilität ihrer Interaktionspartner. In Ko-Transfektionsexperimenten konnte gezeigt werden, daß SIAH1 die BOB.1/OBF.1-Proteinstabilität vermindert, ohne die transkriptionelle Expression zu beeinflussen. Die Inhibition des Proteasoms führt hierbei zu einer stark verminderten BOB.1/OBF.1-Degradation. Abschließend konnte gezeigt werden, daß die Aktivierung des B-Zellrezeptors zu einer Degradation von BOB.1/OBF.1 durch SIAH1 führt und folglich die transkriptionelle Aktivierung BOB.1/OBF.1-abhängiger Reporterkonstrukte vermindert wird. In einem zweiten "yeast-two hybrid screen" mit der carboxy-terminalen Domäne von BOB.1/OBF.1 als "bait", konnten die Interaktionspartner ABP 280 und Mcm7 identifiziert werden. Besonders die Rolle von Mcm7 in der Transkription könnte neue Aufschlüsse über die Wirkungsweise des transkriptionellen Aktivators BOB.1/OBF.1 geben.
Gegenstand dieser Arbeit ist die Untersuchung von Aspekten der Funktion von CD22, einem B-Zell spezifischen Transmembran-Rezeptor der Siglec-Familie (Sialinsäure-bindende Immunglobulin-ähnliche Lectine). Mit der äußersten der 7 extrazellulären Ig-ähnlichen Domänen kann CD22 spezifisch mit a2,6-Sialinsäure interagieren. In der cytoplasmatischen Domäne von CD22 befinden sich 6 konservierte Tyrosine, 3 davon in ITIMs (Immunrezeptor tyrosinhaltige inhibitorischen Motiven). Nach Kreuzvernetzung des B-Zell Rezeptors wird CD22 tyrosinphosphoryliert. Die cytosolische Tyrosin-Phosphatase SHP-1 bindet in der Folge an die phosphorylierten ITIMs, wird aktiviert, und inhibiert das BCR Ca2+-Signal. Gleichzeitig binden jedoch auch positive Modulatoren des BCR-Signals (Lyn, Syk, PLCg PI3K, und Grb-2) an CD22, deren Rolle im Zusammenhang mit CD22 bislang ungeklärt ist. 1. In einem Hauptteil der Arbeit sollten zwei Knockin Mausmodelle generiert werden. Das eine Mausmodell (CD22-ITIM-KO) sollte zerstörte ITIM-Motive enthalten. Bei dem anderen (CD22-Tailless) sollte die gesamte cytoplasmatische Domäne von CD22 fehlen. Beide Modelle sollten der Untersuchung der Rolle der an CD22 bindenden positiven Modulatoren des BCR-Signals, und des Zusammenhangs zwischen Signaltransduktion und Ligandenbindung in vivo dienen. Die Klonierung der Targeting-Vektoren für CD22-ITIM-KO (pCD22-ITIM-KO) und CD22-Tailless (pCD22-Tailless) wurde abgeschlossen. Mit Hilfe ebenfalls klonierter Kontrollvektoren wurden PCRs zur Identifizierung homolog rekombinanter ES-Zell Klone etabliert. Für beide Targeting-Konstrukte wurden nach Transfektion von C57BL/6 ES-Zellen homolog rekombinante Klone erhalten, und mittels Southern Blot und Sequenzierung der eingeführten Mutationen vollständig charakterisiert. Nach Cre/lox-vermittelter Deletion der Selektionskassette des Targeting-Konstrukts folgte Injektion voll charakterisierter CD22-ITIM-KO Klone in BALB/c-Blastozysten. Es wurden 5 chimäre Tiere erhalten, von denen keines die Mutationen durch die Keimbahn weitergab. Transfektionen der C57BL/6 Targeting-Konstrukte in anderen, nicht-isogenen ES-Zell Linien ergaben keine homologen Rekombinanten. Das Auffinden der genomischen Sequenz von CD22 in einer Internet-Datenbank ermöglichte die Verlängerung von pCD22-ITIM-KO um ca. 4 kb mit 129/ola-DNA. Eine Transfektion dieses neuen Konstruktes in eine 129/ola ES-Zelllinie ergab keine homologen Rekombinanten. Jedoch öffnet die nun bekannte genomische CD22-Sequenz den Weg zu einfacher Neukonstruktion von pCD22-ITIM-KO mit 129/ola-DNA, oder zu einer Veränderung und Verbesserung der vorhandenen C57BL/6-Vektoren. 2. Zur Untersuchung der Auswirkung der zerstörten ITIMs auf Tyrosinphosphorylierung und SHP-1 Assoziation von CD22 in vitro in einer Zelllinie wurde ein CD22-ITIM-KO-Expressionsvektor konstruiert, und Sialyltransferase/CD22-ITIM-KO Doppeltransfektanten der Plasmozytom-Zelllinie J558L gewonnen. CD22-ITIM-KO wurde nach BCR-Stimulation nicht tyrosinphosphoryliert, SHP-1 konnte entsprechend nicht mit CD22-ITIM-KO assoziieren. Die Ergebnisse zeigen die Funktionalität des CD22-ITIM-KO Konstrukts hinsichtlich ITIM-Phosphorylierung und SHP-1 Bindung. Weiterhin zeigten die Ergebnisse, daß die ITIM-Tyrosine wichtig für die Phosphorylierung der nicht-ITIM-Tyrosine sind. 3. Interaktion von CD22 mit a2,6-Sialinsäure auf der selben Zelloberfläche (in Cis) spielt eine wichtige Rolle bei der Zell-Zell-Interaktion und bei der intrazellulären Signaltransduktion. In dieser Arbeit wurden erstmals mittels Durchflußcytometrie B-Zellen mit CD22, dessen Liganden-Bindungsstelle nicht durch endogene a2,6-Sialinsäure besetzt ist (demaskiertes CD22), identifiziert. Ca. 10,5% aller B220+ Milzzellen von Wildtyp-Mäusen, aber nur ca. 4,5% der B220+ Milzzellen aus CD22-/- Mäusen waren in der Lage, exogene a2,6-Sialinsäure zu binden. Dieser Effekt ist zum Großteil auf CD22 zurückzuführen. Genauere FACS-Analyse zeigte, daß Zellen mit demaskiertem CD22 in der Fraktion der Transitionalen B-Zellen Typ 2 (T2-Zellen) angereichert sind, und Zeichen von Aktivierung (B7.2, CD25, CD69) zeigen. In Übereinstimmung damit führte in vitro Aktivierung von B-Zellen mit LPS oder IL4 zu CD22-abhängiger Demaskierung. 4. FACS-Färbungen zeigten, daß das Marginalzonen (MZ) B-Zell Kompartiment in CD22-/- Mäusen um ca. 70-80% gegenüber wt-Mäusen verkleinert ist. In Bestätigung früherer Arbeiten war die Immunantwort gegen i.p.-injizierte Thymusunabhängige Antigene Typ 2 (TI2-Antigene) in CD22-/- Mäusen 2-fach reduziert. Die Antwort war jedoch signifikant stärker reduziert (3-4-fach), wenn die gleiche Antigen-Menge i.v.-injiziert wurde, eine Situation, in der bevorzugt die MZ B-Zellen der Milz in Kontakt mit im Blutstrom transportierten Antigenen kommen. Es ist wahrscheinlich, daß die bekannte Defizienz in TI2-Immunantworten in CD22-/- Mäusen auf die verringerte MZ B-Zell Anzahl zurückzuführen ist.
Regulation of B lymphocyte terminal differentiation and death by the transcription factor Blimp-1
(2005)
B lymphocyte induced maturation protein-1 (Blimp-1) and X-box-binding protein-1 (XBP-1) are indispensible transcription factors required for B lymphocyte terminal differentiation into Ig secreting plasma cells. Occurrence of an unfolded protein response (UPR) and XBP-1 splicing, due to elevated Ig levels, are critical events during plasma cell generation. However, the upstream molecule sufficient to trigger these events remain elusive. Because ectopic expression of Blimp-1 in B cells is sufficient to generate plasma cells, it is plausible that Blimp-1 might be the upstream molecule, sufficient for the induction of UPR and XBP-1 splicing. The results from the current study indicate that ectopic expression of Blimp-1 or its N-terminal domain, in B cells, is sufficient to induce XBP-1 splicing, UPR and Ig (immunoglobulin) secretion. Further more Blimp-1 is able to directly repress the antiapoptotic gene A1, by binding to specific DNA elements in A1 promoter. This repression of A1 by Blimp-1 seems to be an important prerequisite for Plasma cell differentiation because ectopic expression of A1 in primary B cells resulted in reduced immunoglobulin secretion.
Mit der VH-Fluoreszenz-Multiplex-PCR steht ein neuartiges Screeningverfahren zur semiquantitativen und qualitativen Analyse der VH-Familienverteilung der schweren Kette des Immunglobulinmoleküls in humanen B-Lymphozyten zur Verfügung. In zwei Multiplex-PCRs werden IgH Produkte der sechs häufigsten VH-Familien mit familienspezifischen und fluoreszenzmarkierten Primern (FAM, HEX, NED und ROX) amplifiziert. Die Auftrennung der Produkte erfolgt durch Elektrophorese in einem ABI Prism 377 Sequencer. In verschiedenen Experimenten konnte die hohe Spezifität und Sensitivität der Methode, sowie die gute Reproduzierbarkeit, Reliabilität und Validität der Daten gezeigt werden. Die Analyse des VH-Repertoires gesunder Individuen (n=10) zeigte eine vergleichbare und zugleich charakteristische Häufigkeitsverteilung der VH-Familien unter den Probanden, wie sie auch schon in anderen Studien beschrieben wurde. Die gewonnen Daten wurden ferner durch Sequenzierung von Produkten im Anschluss an eine Single-Cell PCR validiert. Mittels FMPCR konnte darüber hinaus die Existenz monoklonaler B-Lymphozyten bei Patienten mit CLL nachgewiesen werden. Erste Befunde bei Patienten mit Autoimmunerkrankungen zeigten in Einzelfällen ein stark restringiertes B-Zellrepertoire. Die familienspezifische Markierung der Primer mit Fluoreszenzfarbstoffen erlaubt folglich neben der Abschätzung der Häufigkeitsverteilung der VH-Familien auch eine Aussage über die klonale Zusammensetzung des peripheren B-Lymphozytenpools sowie im Falle eines klonalen Peaks die unmittelbare Zuordnung zu einer der sechs VH-Familien. Die FMPCR stellt ein schnell und einfach durchzuführendes, aber zugleich reliables Screeningverfahren zur Analyse des humanen VH-Repertoires bei Erkrankungen mit einer dominierenden Rolle von B-Lymphozyten dar. Dadurch wird es erstmals möglich sein, größere Kollektive von Patienten mit Autoimmunerkrankungen bezüglich eines krankheitsspezifischen Repertoires zu untersuchen.
Der inhibitorische Einfluss von CD22 auf das B-Zellrezeptorsignal nach Stimulation der B-Zelle
(2003)
CD22 ist ein B-zellspezifisches Transmembranprotein der Immunglobulin (Ig)-Superfamilie. Es übernimmt zwei unterschiedliche Aufgaben. Zum einen hat CD22 eine inhibitorische Wirkung auf das BZR-Signal. Nach BZR-Ligation lagert sich die Tyrosin-Phosphatase SHP-1 an die cytoplasmatische Domäne von CD22 an, wodurch SHP-1 aktiviert wird. Durch die dephosphorylierende Aktivität der Phosphatase moduliert sie das BZR-Signal. Zum anderen ist CD22 ein Adhäsionsmolekül, das in die Gruppe der Siglecs (Sialic acid-binding Ig-like lectin) gehört. Die N-terminale Ig-Domäne von CD22 weist die Bindungseigenschaften eines Lectins auf und bindet spezifisch 2,6-gekoppelte Sialinsäure. Das Ziel der vorliegenden Doktorarbeit war es, die inhibitorische Wirkung von CD22 auf das BZR-Signal molekular zu definieren. Daher wurde das Substrat der an CD22 rekrutierten und aktivierten Phosphatase SHP-1 in vergleichenden Analysen von CD22-defizienten und Kontroll-B-Zellen nach BZR-Stimulation gesucht. Wir konnten zeigen, dass in CD22-defizienten B-Zellen nach BZR-Stimulation das Adaptermolekül SLP-65, auch BLNK oder BASH genannt, früher und stärker Tyrosin-phosphoryliert vorliegt, als in Kontroll-B-Zellen. Transfektionsexperimente mit der CD22-defizienten Plasmazytom-Zelllinie J558Lm3 wurden begonnen, um den molekularen Zusammenhang zwischen CD22, SHP-1 und SLP-65/BLNK zu bestätigen. Das in J558Lm3 Zellen ektopisch exprimierte CD22 wurde Tyrosin-phosphoryliert, und SHP-1 konnte mit CD22 co-präzipitiert werden. Jedoch war in den CD22-Transfektanten keine Reduktion der Tyrosin-Phosphorylierung von SLP-65/BLNK nach BZR-Stimulation im Vergleich zu untransfizierten Zellen nachweisbar. Da in unabhängigen Experimenten die Liganden-Bindung von CD22 als Voraussetzung für die inhibitorische Wirkung von CD22 deutlich wurde, etablierten wir 2,6 Sialinsäure- und CD22-positive J558Lm3 Doppeltransfektanten. Auf diesen konnte die cis-Maskierung von CD22 nachgewiesen werden. In Stimulationsexperimenten der Doppeltransfektanten wurde die reduzierte Tyrosin-Phosphorylierung von SLP-65/BLNK in Abhängigkeit von CD22 in der Mehrzahl der Klone bestätigt. Allerdings mussten die Resultate in Frage gestellt werden, als in den meisten Klonen einer Kontrolltransfektion ebenfalls eine Reduktion der Tyrosin-Phosphorylierung von SLP-65/BLNK festgestellt wurde. Um den Einfluss von CD22 und SLP-65 auf das BZR-Signal zu klären, wurden CD22- und SLP-65-defiziente Mäuse gekreuzt. Durch die zusätzliche Deletion von CD22 in SLP-65-/- Mäusen konnte das Ca2+-Signal nach BZR-Stimulation wieder hergestellt werden. Jedoch zeigte die weitere Analyse der doppel-defizienten Mäuse, dass in der Regel der Phänotyp der SLP-65-defizienten Mäuse dominiert. Diese Ergebnisse verdeutlichten, dass das Adaptermolekül SLP-65/BLNK zwar ein Substrat des CD22/SHP-1 Signalweges ist, aber keine essentielle Rolle in der inhibitorischen Wirkung von CD22 übernimmt. Weiterhin wurde der Einfluss der Ligandenbindung von CD22 auf dessen intrazelluläre, inhibitorische Wirkung auf das BZR-Signal untersucht. Ein synthetisches Sialoside stand zur Verfügung, das hochspezifisch die Interaktion von CD22 mit dessen Liganden stört. Wurden die Zellen einer humanen B-Zelllinie in Gegenwart des Sialosids über den BZR stimuliert, konnte ein erhöhtes Ca2+-Signal gemessen werden. Dieses Resultat erinnerte an die stärkere Ca2+-Mobilisierung in CD22-defizienten B-Zellen. Entsprechend war die Tyrosin-Phosphorylierung von CD22 nach Vorbehandlung mit dem Sialosid in den humanen B-Zellen verringert, und weniger SHP-1 konnte mit CD22 co-präzipitiert werden. Mit diesen Ergebnissen wurde deutlich, dass die Adhäsionsdomäne von CD22 einen direkten, positiven Einfluss auf die intrazelluläre, inhibitorische Domäne von CD22 hat. Als Nebenprojekt wurde die Rolle von CD22 in knock-out Mäusen des transkriptionellen Co-Aktivators BOB.1/OBF.1 untersucht. Ein Entwicklungsblock im transitionalen B-Zellstadium im Knochenmark der BOB.1/OBF.1-defizienten Mäuse verursacht eine deutliche Reduktion reifer B-Zellen in der Milz. Die Analyse des Knochenmarks der BOB.1/OBF.1-defizienten Mäuse zeigte, dass ausschließlich die Expression von CD22 auf den B-Vorläufer Zellen erhöht war. Nach zusätzlicher Deletion von CD22 in BOB.1/OBF.1-/- Mäusen war nach BZR-Stimulation ein deutliches Ca2+-Signal in den doppel-defizienten B-Zellen messbar. Dieses könnte die normalisierte Anzahl transitionaler B-Zellen im Knochenmark und die gestiegene Anzahl reifer B-Zellen in der Milz der doppel-defizienten Mäuse bewirken. Allerdings waren die doppel-defizienten Mäuse, entsprechend den BOB.1/OBF.1-/- Mäusen, nicht in der Lage, eine humorale Immunantwort einzuleiten oder Keimzentren zu bilden. Die Proliferation von CD22-defizienten B-Zellen nach LPS-Stimulation verlief unabhängig von der An- oder Abwesenheit von BOB.1/OBF.1. Mit den Untersuchungen konnten wir zeigen, dass die Differenzierungsschwierigkeiten der BOB.1/OBF.1-defizienten B-Zellen vom BZR-Signal abhängen. Allerdings muss das Ausbleiben der Keimzentrenbildung auf einen anderen Mechanismus zurückgeführt werden.
Myocardial B-cell infiltration after LAD occlusion in mice is driven by CXCL13
After myocardial infarction, the immune system is activated and regulates wound healing and remodeling processes in the heart.
While the role of T cells has been elucidated already, the function of B cells in myocardial infarction remained relatively unclear until now. It is, however, already known that B cells are of importance in healing processes in other tissues, for example in the skin.
Our studies therefore addressed the role and function of B cells in healing and early remodeling processes in the myocardium after infarction.
Under physiological conditions, only few B cells can be found in the heart. After myocardial infarction, however, which we modelled with a permanent ligation of the left anterior descending artery (LAD) in C57BL/6J mice, we could demonstrate that B lymphocytes accumulate in the early phase after tissue injury (days one to seven) in the myocardium.
To detect B cells, we performed immunofluorescence stainings on cryosections of infarcted hearts using an anti-B220 antibody. Quantitative analysis of tissue infiltration revealed that B cells peaked at day seven. In flow cytometry, we further characterized the B cells infiltrating infarcted tissue. We found that most of them were mature B cells (IgM+, IgD+).
Next, we wanted to outline a potential mechanism responsible for B-cell infiltration to the site of tissue injury. We therefore performed ELISA experiments revealing that CXCL13 was upregulated in scar tissue.
Antibody-mediated neutralization of CXCL13 verifiably attenuated B-cell infiltration.
Treated mice also showed – in the tendency – smaller infarct sizes and an improved survival.
In conclusion, we could show that B lymphocytes infiltrate the myocardium after MI in mice following a local CXCL13 gradient and that it is, most likely, beneficial to inhibit this process.
Das Hauptthema der hier vorliegenden Arbeit befaßt sich mit dem B-Zell spezifischen Oberflächenprotein CD22, einem Mitglied der Siglec (Sialinsäure bindende Igähnliche Lektine) Proteinfamilie. Dieses Transmembranprotein besitzt sieben extrazelluläre Immunoglobulin-ähnliche Domänen und kann über die äußerste V-set Domäne seine Liganden: α2,6 verknüpfte Sialinsäuren binden. CD22 hat eine Transmembrandomäne und eine cytoplasmatische Domäne mit sechs potentiellen Tyrosin Phosphorylierungsstellen, von denen drei eine ITIM-Sequenz (engl. immunoreceptor tyrosine-based inhibitory motif) aufweisen. CD22 defiziente Mäuse zeigten eindeutig, daß das Siglec CD22 ein negativer Regulator des BCR-Signals ist. Durch BCR-Kreuzvernetzung wird CD22 tyrosinphosphoryliert, die inhibitorische Tyrosinphosphatase SHP-1 gebunden, aktiviert, und ist nun in der Lage das BCR Ca2+ Signal zu inhibieren. Um die Rolle der CD22Ligandenbindungsdomäne, in vivo zu untersuchen, sollte in dieser Arbeit eine CD22 knock -in Maus erzeugt werden (CD22R130E Maus), in der die Ligandenbindungsdomäne von CD22 durch eine Punktmutation funktionell ausgeschaltet ist. In der hieraus resultierenden Mauslinie sollte dann die BZellentwicklung, Signaltransduktion und der Immunstatus analysiert werden. Der Vergleich des Phänotyps der CD22R130E Maus und der CD22 defizienten Maus sollte dann zeigen, wie die Adhäsions- und Signalleitungseigenschaften von CD22 zusammenhängen. Der „Targeting“ Vektor für die „Gene Targeting“ Experimente wurde von der Arbeitsgruppe Dr. Anton van der Merwe (von Christina Piperi) angefertigt. Ursprünglich wurde ein „Targeting“ Vektor aus genomischer C57BL/6-DNA verwendet, um den genetischen Hintergrund der CD22-defizienten Maus beizubehalten. Dieser Vektor wurde von mir für ES-Zell Transfektionen in der C57Bl/6 ES-Zellline verwendet. Aus den Gene Targeting Experimenten mit der C57Bl/6-III ES-Zelllinie konnten zwei ES-Zellklone isoliert werden, die eine korrekte homologe Integration des Targetvektors trugen. Aus einem Blastozysteninjektions- Experiment mit einem Cre-deletierten C57BL/6-III Subklon wurden sechs hochchimäre Mäuse erhalten, mit denen allerdings keine Keimbahntransmission erzielt werden konnte. Nach Problemen mit Keimbahntransmission von Klonen aus der C57BL/6-III ESZelllinie, wurden noch die BALB/c und die E14Tg2a ES-Zelllinie für neue Gene Targeting Experimente verwendet. Die Experimente mit der BALB/c ES-Zelllinie ergaben keine ES-Zellklone mit korrekter homologer Integration, dies beruhte wahrscheinlich auf dem nicht isogenen Hintergrund. Alle folgenden Experimente mit der E14Tg2a ES-Zelllinie (genetischer Hintergrund: 129/ola) wurden mit dem verlängerten R130E-Targetvektor (Targetvektor 2), der mit 129/ola DNA um 2,3 Kb in 5’-Richtung verlängert wurde, um den isogenetischen Anteil des Targetvektors zu erhöhen, durchgeführt. Aus diesen Experimenten resultierten wiederum zwei ESZellklone, deren korrekte homologen Rekombination durch Southern Blot bestätigt werden konnten. Bei den darauffolgenden Blastozysten-Injektionsexperimenten mit diesen zwei E14Tg2a Klonen konnten fünf chimäre Tiere gewonnen werden. Ein 80 %ig chimäres Männchen erzeugte eine hohe Anzahl von Nachkommen mit Keimbahntransmission. Bei der Analyse dieser Tiere trat das Resultat zutage, daß alle diese Tiere mit Keimbahntransmission einen wildtypischen Genotyp besaßen. Ein weiteres Mitglied der Siglecproteinfamilie, das murine SiglecG (ein Ortholog zu humanem Siglec10), wurde in dieser Arbeit untersucht. In Zusammenarbeit mit dem Labor von Dr. Paul Crocker sollte eine SiglecG knock out Maus hergestellt werden. Die Strategie für die Gene Targeting Experimente für einen SiglecG knock out basierten auf der Verwendung der BalbI ES-Zelllinie (aus BALB/c Mäusen), da hiermit sehr gute Erfahrungen vorlagen, was die Stabilität ihrer Pluripotenz und des Keimbahntransmissionspotenzials angeht. Daher wurde im Labor von Paul Crocker (von Sheena Kerr) ein Kontroll- und ein Targetvektor kloniert, mit dem große Teile der ersten und zweiten Ig-Domäne von SiglecG ausgeschaltet werden sollte. Mit diesem Vektor führte ich mehrere ES-Zell Transfektionsexperimente durch. Innerhalb der Zeitspanne meiner Doktorarbeit konnten keine ES-Zellklone mit einem korrekten homologen Integrationsereignis gewonnen werden. Mittels der ursprünglichen Strategie konnte die mir nachfolgende Doktorandin jedoch ES-Zell Klone isolieren, nach Blastozysteninjektion Keimbahntransmission erzielen und somit eine SiglecGdefiziente Maus generieren. Eine andere Zusammenarbeit kam mit Dr. Burkhard Kneitz (Physiologisches Chemie I, Biozentrum, Universität Würzburg) zustande. Seine Intention war es, die Rolle des TGF-β Signalmediators SMAD2 auf B-Zellebene näher zu untersuchen. Von Erwin Böttinger bekamen wir eine Mauslinie, in der das Smad2-Gen gefloxt ist, die mit der CD19-Cre Maus gekreuzt wurde. So wurde eine B-Zell spezifische SMAD2 knock out Maus (bSmad2-/-) erzeugt. Meine Aufgabe bestand darin, die B-Zellkompartmente und die Immunantworten der B-Zell spezifischen Smad2-defizienten Maus zu analysieren. Faßt man alle gewonnenen Daten aus den hier generierten B-Zell spezifischen Smad2 knock out Tieren zusammen, so kann man zu dem klaren Ergebnis kommen, daß der TGF-β Signalmediator Smad2 eine entscheidende Rolle bei der Weiterleitung von TGF-β Signalen in das Zellinnere von B-Zellen spielt. Hierbei zeigten sich klare Veränderungen, im Vergleich zu Kontrolltieren, eine Erhöhung der Zellzahl in den Peyerschen Plaques (PP), und der B1-Zellen im Peritoneum. Die IgA-Immunantwort war in bSmad-/- Tieren stark erniedrigt. Der für TGF-β beschriebene Effekt der Proliferationshemmung von aktivierten B-Zellen war bei aktivierten B-Zellen der bSmad2-/- Mäuse hingegen nicht beeinträchtigt.
Nach Aktivierung differenzieren B-Zellen entweder direkt zu IgM sezernierenden Plasmazellen oder treten in den Differenzierungsweg zur Gedächtniszelle ein, der sowohl durch die Affinitätsreifung als auch den Klassensprung zu sekundären Immunglobulin-Isotypen gekennzeichnet ist. Welchen Weg die B-Zelle durchläuft, ist abhängig von der Intensität und der Dauer des BZR-Signals, von der Verfügbarkeit und der Art der T-Zell-Hilfe und von weiteren Signalen in der speziellen Mikroumgebung des Keimzentrums. Der Transkriptionsfaktor Blimp-1 ("B lymphocyte induced maturation protein 1") wird als ein „Mastergen“ der terminalen B-Zell-Differenzierung betrachtet und ist in der Lage, die komplexen Differenzierungsprozesse zu Ig-sezernierenden Plasmazellen auszulösen und voranzutreiben. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit identifizieren Blimp-1 als wichtigen Regulator, der bestimmt, ob eine B-Zelle zur Plasmazelle oder zur Gedächtniszelle differenziert. Unter Verwendung ruhender, primärer B-Zellen der Maus, die in vitro mit Interleukin-4 (IL-4), anti-mF(ab´)2 oder anti-CD40 in verschiedenen Kombinationen sowohl in An- als auch in Abwesenheit von LPS stimuliert wurden, konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass die IgM-Sekretion und die Expression von Blimp-1 durch Signalgebung über den BZR oder CD40 und durch IL-4 entweder nicht induziert oder sogar unterdrückt wird. Die Zugabe von IL-2 und IL-5 induziert die Expression von Blimp-1 und erleichtert die Sekretion von IgM und IgG1 in diesem System. Gleiches kann durch direkte Transduktion der B-Zellen mit rekombinanten Retroviren erreicht werden, die für Blimp-1 codieren. Auf der anderen Seite wird der durch IL-4 induzierte Klassensprung nach IgG1 durch Blimp-1 gehemmt. Blimp-1 bewirkt daher ein Umschalten des B-Zell-Differenzierungsweges von der Gedächtniszelle zur Plasmazelle. Die Unterdrückung der Expression von Blimp-1 sowohl durch Antigen-BZR-Wechselwirkungen als auch durch die von T-Helferzellen abhängige Signalgebung über CD40 und IL-4 unterdrückt die terminale Differenzierung zur Plasmazelle und ist für den Eintritt und das Durchlaufen des Gedächtniszell-Differenzierungsweges notwendig. Zur Identifikation von Genen, deren Expression durch Blimp-1 direkt oder indirekt beeinflusst wird, wurde Blimp-1 in WEHI 231 B-Lymphomzellen unter Verwendung rekombinanter Retroviren überexprimiert. Messika et al. zeigten, dass die Überexpression von Blimp-1 in B-Lymphomzellen in Abhängigkeit vom Reifungsstadium der Zelle entweder einen Wachstumsnachteil, gefolgt vom Zelltod, induziert oder zur terminalen Differenzierung führt. Obwohl WEHI 231 Zellen unreife, d.h. sIgM+ B-Zellen repräsentieren, exprimieren Blimp-1 transduzierte WEHI 231 Zellen die J-Kette, zeigen eine erhöhte Konzentration der für die sekretorische Form der my-Kette codierenden mRNA, exprimieren den Plasmazellmarker Syndecan-1 auf ihrer Oberfläche und sezernieren für kurze Zeit IgM. Diese Differenzierungsprozesse gehen allerdings mit einem Wachstumsnachteil und Zellzyklus-Arrest, gefolgt vom Zelltod, einher. Blimp-1 exprimierende WEHI 231 Zellen zeigen somit den Phänotyp kurzlebiger Plasmazellen. Eine Langzeitkultur Blimp-1+ WEHI 231 Zellen führt zum Verlust des differenzierten Phänotyps, d.h der Erhalt IgM-sezernierender WEHI 231 Zellen ist nicht ohne weitere Maßnahmen möglich. Auf molekularer Ebene hemmt Blimp-1 die Expression von c-myc und diejenige des antiapoptotischen Bcl-2 Familienmitgliedes A1, stimuliert aber die Expression von mad4. Die Verschiebung des Verhältnisses von Myc/Max- zu Mad/Max-Heterodimeren zugunsten von Mad/Max-Komplexen und die daraus resultierende Inhibition der Transkription von Myc-abhängigen, proiliferationsfördernden Genen ist in vielen Systemen als von zentraler Bedeutung für die Initiation von Differenzierungsprozessen beschrieben und wurde auch bereits für B-Zellen diskutiert. Auch in primären B-Zellen führt Blimp-1 zu einer verstärkten Expression von mad4. Wird der durch Blimp-1 bewirkte Verlust der Expression von A1 durch dessen Überexpression in Blimp-1+ WEHI 231 Zellen kompensiert, so überleben diese Zellen wieder erheblich länger, bleiben aber weiterhin im Zellzyklus arretiert. Der differenzierte Phänotyp, charakterisiert durch die verstärkte Expression von mad4 und der Sekretion von IgM, wird dabei aufrechterhalten. Wachstumsnachteil und Zelltod können in diesem System daher entkoppelt werden. In primären Zellen führt Blimp-1 ebenfalls zur Erniedrigung der A1 Expression. Da diese Zellen aber nicht in dem Maße wie WEHI 231 Zellen absterben, kann der Verlust von A1 offensichtlich besser kompensiert werden. Die Lebensdauer einer Blimp-1+ Plasmazelle ist somit durch Manipulation der Expression von antiapoptotischen Molekülen wie A1 verlängerbar.
Stimulation von unreifen B-Lymphozyten der Maus über den Antigenrezeptor führt zu Wachstumsstopp und Apoptose. Eine gleichzeitige Stimulation über CD40 bewirkt die Aufrechterhaltung der Proliferation und schützt die Zellen vor programmiertem Zelltod. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass Stimulation über CD40 die Genexpression von A1 - einem antiapoptotischen Mitglied der Bcl2-Proteinfamilie - in primären B-Lymphozyten aus Mäusen anregt. Die CD40 Abhängigkeit der A1 Expression wurde in WEHI 231 Lymphomzellen, einem Modellsystem für unreife B-Lymphozyten, bestätigt. Um das Potential von A1 in den BZR-abhängigen Prozessen Wachstumsstopp und Apoptose zu untersuchen, wurden WEHI 231 Zellen mit A1 transduziert. Die cDNA von A1 wurde mittels rekombinanten, replikationsdefekten Retroviren eingeschleust. Positive Populationen wurden über chimäre Marker aus Gelbfluoreszenzprotein und Zeocin Resistenzprotein, deren Expression über eine "internal ribosomal entry site" (IRES) an die Expression des Testgens gekoppelt war, selektioniert. Nach Stimulation der A1 transduzierten Zellen über den BZR wiesen diese eine größere Überlebensrate auf als Zellen der entsprechenden Kontrollpopulation. Dabei hatte die konstitutive Expression von A1 jedoch keinerlei Einfluß auf den durch BZR Stimulation hervorgerufenen Zellzyklusarrest. Dieses Ergebnis erklärt sich durch die Tatsache, dass A1 alleine nicht in der Lage war, die durch den BZR negativ regulierte Expression von c-myc RNA zu verhindern. Auch der BZR-abhängige Aktivitätsverlust eines NFkB-abhängigen Luciferasereporters wurde durch A1 alleine nicht verhindert. Die Überexpression von induzierbarem cMyc-ER in A1 transduzierten Zellen, um damit durch parallele Induktion des ektopischen cMyc-ER den BZR-induzierten Verlust von cMyc auszugleichen, führte nicht zur Wiederherstellung der Proliferationsfähigkeit dieser Populationen. Ektopisches cMyc-ER hatte im Gegenteil selbst eine proliferationshemmende und apoptotische Wirkung, die von A1 unbeeinflusst blieb. Untersuchungen zur Funktionsweise von A1 zeigten, dass es den Abbau des Caspasesubstrates Poly-ADP-Ribose-Polymerase (PARP), die Aktivierung der Caspase 7, aber auch die Freisetzung radikalischer Sauerstoffverbindungen aus den Mitochondrien unterdrückte. Das CD40-Signal scheint sich also oberhalb von A1 in zwei Hauptkomponenten aufzuteilen, wovon eine die Proliferationsfähigkeit aufrecht erhält, während die andere das Überleben der Zellen sichert. A1 ist allem Anschein nach für letztere von zentraler Bedeutung.