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Sonstige beteiligte Institutionen
Im Rahmen der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss von MV auf die Expression und Nutzung verschiedener Rezeptoren auf Dendritischen Zellen (DC) untersucht. Dazu wurden DC in vitro aus Monozyten gewonnen und mit IL- 4 und GM-CSF ausdifferenziert. In der Arbeit wurden das Wildtypvirus WTF und der Vakzinestamm ED eingesetzt. Im ersten Teil der Arbeit wurde die Expression der Chemokinrezeptoren 5 (CCR5) und 7 (CCR7) auf MV-infizierten DC-Kulturen sowie das Migrationsverhalten der DC untersucht. Die Expression von CCR5 ist abhängig vom Reifungszustand der DC. Während unreife DC CCR5 exprimieren, verringert sich die Expression im Zuge der Ausreifung, während die Expression von CCR7 induziert wird. In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass die MV-Infektion einer DC-Kultur die Expression von CCR5 nicht beeinflusst, obwohl die Expression anderer charakteristischer Reifungsmarker erhöht wird. Weiterhin konnte die Expression von CCR7 durch eine Infektion der DC-Kulturen mit MV nicht induziert werden. Die Ergebnisse der durchgeführten durchflusszytometrischen Analysen zur Rezeptorexpression wurden in Chemotaxis-Assays eingehender untersucht. DC aus MV-infizierten Kulturen zeigten trotz anhaltender CCR5-Expression nur eine geringe Migration in Richtung des CCR5-Liganden CCL-3. Aufgrund der fehlenden CCR7- Expression konnte erwartungsgemäß keine Migration der eingesetzten DC gegenüber dem CCR7-Liganden CCL-19 beobachtet werden. Weiterhin konnten Unterschiede im induzierten Chemokinmuster in MV-infizierten DCKulturen im Vergleich zu LPS-ausgereiften oder mit einer Mockpräparation behandelten DC nachgewiesen werden. Kurz nach der Infektion konnte in MVinfizierten DC-Kulturen eine reduzierte Menge CXCL-8 und CCL-20 sowohl auf mRNA Ebene als auch auf Proteinebene detektiert werden. In weiteren Experimenten konnte eine verminderte Migration von T-Zellen auf Zusammenfassung 152 Zellkulturüberstände aus infizierten DC-Kulturen im Vergleich zu Überständen aus LPS-behandelten DC-Kulturen festgestellt werden. Im zweiten Teil der vorgelegten Arbeit konnte MV als Ligand für das DCspezifische Oberflächenmolekül DC-SIGN (dendritic cell-specific intercellular adhesion molecule (ICAM)-3 grabbing non-integrin) identifiziert werden. Dabei konnte gezeigt werden, dass beide verwendeten Virusstämme an DC-SIGN binden können, DC-SIGN jedoch keinen Eintrittsrezeptor für MV darstellt. Weitere Analysen zeigten, dass DC-SIGN die Infektion, besonders bei geringen Viruskonzentrationen, verstärkt. In erster Linie zeigt die MV-Infektion unreifer DC die Bedeutung von DC-SIGN als Bindungsrezeptor für MV. Die hohe Expression von DC-SIGN auf unreifen DC ermöglicht eine effiziente effektive Infektion dieser Zellen. Auf reifen DC ist der Einfluss von DC-SIGN auf die Effektivität der Infektion der DC deutlich verringert. Im dritten Teil dieser Arbeit wurden die Kontaktzeiten zwischen DC und TZellen in dreidimensionalen Kollagenmatrices untersucht. Dabei wurde eine in etwa doppelt so lange Kontaktzeit zwischen MV-infizierten DC und durch Oxidative Mitogenese veränderten T-Zellen gegenüber LPS-behandelten DC bzw. MV-infizierten und nicht-modifizierten T-Zellen festgestellt. In den parallel durchgeführten Proliferationstests wurde eine reduzierte Proliferation der TZellen beobachtet, die mit MV-infizierten DC kokultiviert wurden. Im Gegensatz zu den kürzeren Kontakten zwischen LPS-behandelten DC und modifizierten TZellen waren die Kontakte zwischen MV-infizierten DC und modifizierten TZellen nicht-stimulatorisch.
Obwohl eine wirksame Schutzimpfung verfügbar ist, sind Masern noch immer weltweit verbreitet. Mit etwa 750.000 Todesfällen jährlich gehören sie zu den gefährlichsten Infektionskrankheiten im Kindesalter überhaupt. Nicht allein wegen der masernvirusinduzierten Immunsuppression treten sekundäre bakterielle Infektionen, darunter Otitiden oder Pneumonien, gehäuft auf. Eine Beteiligung des zentralen Nervensystems kann zur akuten postinfektiösen Masernenzephalitis (APME), die meist mit einer hohen Defektheilungsrate einhergeht, oder zur letal verlaufenden subakuten sklerosierenden Panenzephalitis (SSPE) führen. Besonders gefürchtet sind die schweren Komplikationen der Riesenzellpneumonie oder der measles inclusion body encephalitis (MIBE) bei immunsupprimierten Patienten. Viele pathogenetische Aspekte und pathophysiologische Vorgänge sind dabei noch nicht gänzlich verstanden. Vaskuläre Endothelzellen sind neben Epithelzellen, Monozyten und Makrophagen sowie Lymphozyten als wichtige Zielzellen für das Masernvirus bei der Ausbreitung der Masernvirusinfektion und Entstehung ihrer Komplikationen anzusehen. In immunhistochemisch aufbereiteten pathologischen Schnittpräparaten wurden in infizierten und stark entzündlich veränderten Arealen immer wieder infizierte Gefäßendothelzellen gefunden. Eine systematische Untersuchung der Interaktion von Masernviren mit humanen Gefäßendothelzellen in vitro lag allerdings bislang nicht vor. Das Ziel dieser Dissertation war es nun, die Interaktion von attenuierten und virulenten Masernvirusstämmen mit humanen Gefäßendothelzellen grundlegend und systematisch zu untersuchen und eine Basis für die Definition pathogenetisch bedeutsamer molekularer Mechanismen zu schaffen. Hierfür wurde mit primären Endothelzellen der menschlichen Nabelschnurvene (HUVEC) und einer humanen mikrovaskulären Hirnendothelzelllinie (HBMEC) ein rein humanes Zellkulturmodell gewählt und unter Verwendung attenuierter und virulenter Masernvirusstämme den natürlichen Bedingungen Rechnung getragen. Als essentielle Grundlage für die Untersuchungsreihen wurden die Endothelzellen auf endothelzellspezifische Markermoleküle hin untersucht und charakterisiert. Einzig die Oberflächenproteine membrane cofactor protein (MCP oder CD46) und signaling lymphocytic activation molecule (SLAM oder CD150) sind bislang als zelluläre Rezeptoren für das Masernvirus identifiziert worden. Es konnte hier eindeutig nachgewiesen werden, dass HUVEC und HBMEC auf verschiedenen zellulären Ebenen konstitutiv CD46, nicht aber SLAM exprimieren. Weder eine Aktivierung der Endothelzellen mit diversen Zytokinen und Stimulantien, noch der Kontakt der Endothelzellen mit inaktivierten Masernviren vermochte eine Expression von SLAM zu induzieren, obwohl eine Expression von toll-like receptor 2 (TLR2) klar aufgezeigt werden konnte. Es konnte hier ebenfalls belegt werden, dass sowohl der attenuierte Masernvirusstamm Edmonston (Edm) als auch die virulenten Masernvirusstämme WTFb, Wü4797 und Wü5679 Endothelzellen infizieren und eine morphologische Zellalteration mit Ausbildung eines zytopathischen Effekts hervorrufen können. Weitere Analysen zeigten für Edm und Wü4797 ein enormes Infektionsausmaß und eine sehr gute Ausbreitungseffizienz, die durch die Anwesenheit CD46-spezifischer Antikörper nur bei Edm klar reduziert werden konnte. Eine Aktivierung der Endothelzellen mit diversen Zytokinen und Stimulantien trug keinen eindeutigen begünstigenden oder hemmenden Effekt auf die Masernvirusinfektion mit sich, Interferon-α und -γ schienen das Infektionsausmaß abzuschwächen. Folgeversuche zur Rezeptormodulation durch Masernviren deuten darauf hin, dass CD46 nur für den attenuierten Masernvirusstamm Edm, nicht aber für die virulenten Masernvirusstämme WTFb, Wü4797 und Wü5679 als zellulärer Rezeptor fungiert. Die Ergebnisse dieser Dissertation belegen eine von den beiden Masernvirusrezeptoren CD46 und SLAM unabhängige Infektion humaner vaskulärer Endothelzellen mit Masernviruswildtypstämmen. Diese Beobachtungen lassen einen weiteren, bislang noch nicht bekannten zellulären Rezeptor oder einen von einem zellulären Rezeptor unabhängigen Aufnahme- und Ausbreitungsmechanismus bei Gefäßendothelzellen vermuten. Es darf weiterhin als sicher angesehen werden, dass Endothelzellen in der Pathogenese von masernvirusinduzierten Komplikationen, sei es direkt oder indirekt, involviert sind.
Die rheumatoide Arthritis (RA) ist eine Autoimmunerkrankung, die durch anhaltende Gelenksentzündungen gekennzeichnet ist und mit einer fortschreitenden Degradierung des Knorpels und Knochen einhergeht. Ungefähr 2 % der erwachsenen Bevölkerung weltweit sind betroffen und leiden unter erheblichen Gelenkschmerzen und Beeinträchtigungen. Der intraartikuläre Transfer anti-entzündlicher Gene (z.B. des Interleukin-1 Rezeptorantagonisten – IL1RA) zeigte signifikante Bedeutung in präklinischen und Phase-I klinischen Studien der RA Therapie. Die meisten dieser Studien verwendeten MLV-basierte orthoretrovirale Vektoren für eine stabile Transgenexpression, tragen aber das Risiko der Insertionsmutagenese. Wir haben foamyvirale Vektoren (FVV) etabliert, welche von apathogenen Elternviren abgeleitet sind und sich durch ein breites Wirtsspektrum und ein vorteilhaftes Integrationsmuster ins zelluläre Genom auszeichnen. In dieser Arbeit wurden IL1RA exprimierende prototypische foamyvirale Vektoren (PFV) generiert, deren chondroprotektives Potential in vitro und in einem indirekten Gentransferansatz in Kniegelenken von Wistar und athymischen Nacktratten in vivo evaluiert wurde. PFV Vektoren mit der kodierenden Sequenz für den humanen IL1RA, einer internen ribosomalen Eintrittsstelle (IRES) und EGFP wurden generiert und mit Verwendung eines Vier-Plasmidsystem, bestehend aus dem Vektorplasmid (IL1RA-IRES-EGFP) und den Expressionsplasmiden FV-gag, FV-pol und FV-env in 293T Zellen produziert. Ebenso wurden Kontrollvektoren welche nur EGFP exprimieren generiert. Transduktionsexperimente wurden mit primären humanen mesenchymalen Stammzellen (MSZ) aus Knochenmarkaspiraten, der Tert-4 mesenchymalen Stammzelllinie, HT1080 Fibroblasten und primären Ratten Synovialfibroblasten durchgeführt. Die Transgenexpression wurde mittels Fluoreszenzmikroskopie (EGFP), ELISA (IL1RA) und quantitativer Real-Time PCR (IL1RA) evaluiert. Die Funktionalität des IL1RA-Proteins wurde mit einem Prostaglandin E2 (PGE2) Assay gezeigt. Dazu wurden FV.IL1RA transduzierte Tert-4 Zellen und unbehandelte Zellen mit 10 ng/ml IL1 inkubiert. Als readout für die IL1-Stimulation dienten die PGE2 Mengen in den konditionierten Medien. Die Zellkulturüberstände wurden 48 h nach IL1-Gabe auf ihren PGE2 und IL1RA Gehalt hin untersucht. Die PGE2 Menge war dabei, im Vergleich zu den unbehandelten Kontrollen, in den FV.IL1RA transduzierten Zellen signifikant erniedrigt. Nach der Transplantation von foamyviral transduzierten Synovialfibroblasten in Kniegelenke von Wistar und athymischen Nacktratten, war die intraartikuläre (i.a.) Transgenexpression in den Wistar Ratten zunächst hoch, fiel jedoch nach ungefähr 3 Wochen ab. Im Gegensatz dazu war die foamyviral vermittelte IL1RA-Expression in den immundefizienten Ratten für 12 Wochen auf sehr hohen Leveln stabil. Ein Maximum wurde an Tag 10 nach i.a. Transplantation mit ca. 450 ng pro Gelenk erreicht. Untersuchungen zur Biodistribution zeigten keine extraartikuläre Transgenexpression in allen untersuchten Organen (Gehirn, Herz, Lunge, Leber, Niere, Milz, Gonaden und Serum). Diese Resultate, zusammen mit dem Ausbleiben von sekundären Erkrankungen, wie bspw. Tumoren, in allen behandelten Tieren, sprechen für die Sicherheit des Ansatzes. Die Arbeit zeigt, dass FVV verwendet werden können, um primäre Synovialfibroblasten und MSZ effizient mit Markergenen und dem anti-entzündlichen IL1RA Transgen zu transduzieren. Die dabei erzielten Transgenlevel sind in der Lage, die Effekte von hochdosiertem IL1 zu blockieren. Die Ergebnisse sprechen dafür, dass FVV sehr effiziente Werkzeuge für den ex vivo Gentransfer sind und unterstreichen ihr großes Potential für die Bereitstellung anti-entzündlicher Transgene in primären Zellen und Geweben. Zukünftig soll diese Technologie in Tiermodellen der Arthritis angewendet werden. Das Fernziel der Arbeiten besteht in der Etablierung und Evaluierung eines Gentransfersystems, welches die in vivo Applikation am Menschen erlaubt.
Hintergrund: Die HIV-Infektion wird von einer allgemeinen Hyperimmunaktivierung begleitet, die wahrscheinlich eine treibende Kraft in der Pathogenese der Entwicklung von AIDS darstellt. Im Rahmen einer 24-monatigen, Placebo-kontrollierten, randomisierten Doppelblindstudie wurde in unserer Arbeitsgruppe der Einfluss von gering-dosiertem Prednisolon (5 mg/Tag) auf die Progression der Erkrankung untersucht (ProCort-Studie, clinicaltrials.gov NCT01299948). Es konnte gezeigt werden, dass gering-dosiertes Prednisolon bei weiblichen Studienteilnehmerinnen zu einer signifikant verlangsamten Progression hin zum Studienendpunkt AIDS geführt hat. Die immunologischen Grundlagen dieses Effektes sind noch nicht ausreichend verstanden. Es ist bekannt, dass die HIV-Infektion zu einer Zunahme der aktivierten T-Zellen im Blut führt und dass der Anteil dieser aktivierten T-Zellen mit der Krankheitsprogression korreliert. Diese T-Zell Hyperaktivierung wird unter antiretroviraler Behandlung wieder normalisiert. In der vorliegenden Arbeit sollte der Einfluss der Prednisolon-Behandlung auf die T-Zell-Aktivierung untersucht werden, um zu verstehen, ob die Prenisolon-Behandlung ähnliche positive Effekte auf das Immunsystem hat, wie die antiretrovirale Therapie.
Methoden: In dieser Studie wurden insgesamt 154 PBMC-Proben (77 Placebo, 77 Prednisolon) des Studienzeitpunktes 12 Monate untersucht. Die PBMC wurden mit Fluorochrom-markierten Antikörpern gegen CD3 (PerCP-Cy 5.5), CD8 (FITC), CD38 (PE) und HLA-DR (APC) gefärbt und durchflusszytometrisch analysiert. Folgende Populationen wurden definiert: T-Zellen (CD3+), CD8-positive T Zellen (CD3+/CD8+), CD4-positive T Zellen (CD3+/CD8-), aktivierte T Zellen (CD38+/HLA-DR+). Eine statistische Analyse der Daten erfolgte mit Hilfe der GraphPad Prism Software.
Ergebnisse: Patienten mit Prednisolon-Behandlung zeigten im Vergleich zu Patienten mit Placebo-Behandlung eine geringere Aktivierung der CD8+ T Zellen (median 8.04 % [CI95% 8.158-11.54]) vs. median 9.74 % [CI95% 9.71-13.05] sowie der CD4+ T Zellen (median 6.910% [CI95% 6.862-8.721] vs. median 8.185 % [CI95% 8.088-10.49]). Die Unterschiede sind jedoch statistisch nicht signifikant (p=0.1250 bzw. p=0.1032, U test). Bei einer Stratifizierung der Daten nach Geschlecht erreichten die festgestellten Unterschiede zwischen Placebo- und Prednisolonbehandlung bei weiblichen Studienteilnehmern statistische Signifikanz (CD8+ Aktivierung: median 7.3 % [CI95% 7.413-10.26] vs. median 10.3 % [CI95% 9.927-13.69], p = 0.0248, U-test), sowie der CD4+ T Zellen (median 6.735% [CI95% 6.448-8.476] vs. (median 8.36% [CI95% 8.274-10.72], p = 0.0158, U-test), während bei männlichen Studienteilnehmern kein Unterschied auftrat. Die Lymphozytenaktivierung zeigte eine positive Korrelation zur HIV-Viruslast (p = 0.0521 für CD8+ und p = 0.0078 für CD4+, lineare Regression) und zum Immunaktivierungsmarker sCD14 (p = 0.0075 für CD8+ und p < 0.0085 für CD4+, lineare Regression) und zum Aktivierungsmarker supar (p = 0.0261 für CD8+ und p < 0.0001 für CD4+, lineare Regression). Aktivierte CD4+ Zellen zeigten eine positive, aktivierte CD8+ Zellen eine negative Korrelation zum Anteil an memory-B-Zellen (p = 0.0080 für CD8+ und p < 0.0001 für CD4+, lineare Regression). In einer Kaplan-Meyer-Analyse innerhalb des Placebo-Arms zeigten Patienten mit einer höherne Immunaktivierung bei CD8+ T-Lymphozyten (Quartilen Q1 und Q2) eine signifikant schnellere Progression zu AIDS als Patienten mit einer niedrigen Immunaktivierung (Quartilen Q3 und G4, p = 0.0176).
Diskussion: In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Studienteilnehmerinnen mit Prednisolon-Behandlung zum Zeitpunkt 12 Monate eine signifikant niedrigere Lymphozytenaktivierung zeigen als Studienteilnehmerinnen mit Placebo-Behandlung. Die Prednisolon-vermittelte Reduktion der Immunaktivierung korrelierte mit verlangsamter Krankheitsprogression. Die HIV-induzierte Immunaktivierung ist damit ein treibender Faktor in der Progression der Erkrankung. Immunmodulatorische Therapien bei Patienten mit ungenügender Immunrekonstitution unter antiretroviraler Behandlung könnten daher möglicherweise einen positiven Behandlungseffekt erzielen.
Zielsetzung dieser Arbeit ist die Bestimmung der Aktivierung von CD8+ und CD4+ T-Lymphozyten bei Teilnehmern eines RCT, in dem der Effekt von niedrig-dosiertem Prednisolon auf die Progression der HIV-Infektion untersucht werden sollte. Die Ergebnisse sollten mit der Art der Behandlung (Placebo oder Prednisolon), weiteren Markern der Immunaktivierung sowie der Viruslast korreliert werden und der Effekt auf die Krankheitsprogression untersucht werden. Aus diesen Ergebnissen sollten Rückschlüsse auf die Effekte von Prednisolon auf das Immunsystem, sowie ein besseres Verständnis der Immunpathogenese der Infektion gewonnen werden.
Prionenerkrankungen oder Transmissible Spongiforme Enzephalopathien (TSEs) sind übertragbare Krankheiten, zu denen die Creutzfeldt-Jakob-Krankheit (CJD) beim Menschen, Scrapie bei Schafen und die Bovine Spongiforme Enzephalopathie (BSE) bei Rindern gehören. Der infektiöse Erreger (PrPSc) besteht dabei aus einer abnormalen Form des zellulären Prion-Proteins (PrPC) und unterscheidet sich von dieser nur in der Proteinstruktur. Ein Hauptproblem bei der Entwicklung von aktiven Immunisierungsstrategien gegen Prionenerkrankungen besteht in der fehlenden Reaktion des Immunsystems auf das ubiquitär exprimierte Selbst-Antigen PrPC, welche auf einer Immuntoleranz gegen das körpereigene Protein beruht. In dieser Arbeit wurde ein transgenes Mausmodell für aktive Immunisierungsexperimente verwendet. Diese transgenen Tiere exprimieren Hamster-PrPC (HaPrP) unter der Kontrolle des Neuronen-spezifischen Enolase-Promotors (NSE) ausschließlich im Nervensystem auf einem Prnpo/o-Hintergrund. Durch die Verwendung eines „artfremden“ Proteins (rekombinantes Maus-PrP) gegen endogenes Hamster-PrP als Vakzine sollte die Immunogenität des Proteins verstärkt werden. Zusätzlich wurde für die Immunisierungen ein Fusionsprotein aus Maus-PrP und einem T-Helferepitop des Tetanustoxins (P30) eingesetzt. Als Adjuvanz diente das bakterielle DNA-Motiv CpG-1826, welches die Fähigkeit besitzt T-und B-Lymphozyten direkt zu stimulieren und die Sekretion von Interleukinen zu induzieren. Die Immunisierungen erfolgten subkutan und wurden monatlich durchgeführt. Nach jedem Boost wurden die Blutseren auf Antikörper sowohl gegen Maus-PrP als auch gegen Hamster-PrP untersucht. Neben der Analyse der humoralen Immunantwort mittels ELISA, Westernblot und FACS, wurden die Seren der immunisierten Mäuse auf ihre Fähigkeit getestet, die Prionenreplikation in vitro zu inhibieren. Mit der gewählten Immunisierungsstrategie war es mit beiden Proteinen möglich, hohe Antikörperantworten sowohl gegen Maus- als auch gegen Hamster-Prion-Protein zu induzieren. In Zellkultur waren die Seren in der Lage, signifikant den PrPSc-Gehalt zu reduzieren. Die immunisierten Mäuse wurden mit Hamsterprionen infiziert, um den Einfluss der induzierten Antikörper auf den Verlauf der Krankheit zu untersuchen. Nach Immunisierung mit PrP-P30 zeigten die Mäuse gegenüber mit Ovalbumin-behandelten Kontrolltiere eine signifikant verlängerte Inkubationszeit von ca. 30%. Im Gegensatz dazu konnte nach Immunisierung mit PrP ohne das zusätzliche T-Helferepitop keine Verlängerung in den Inkubationszeiten beobachtet werden. Abschließend wurde die Immunantwort in den immunisierten Tieren auf zellulärer Ebene mittels Proliferationsanalyse von T-und B-Lymphozyten untersucht. Dafür wurden Lymphozyten aus Milz und Lymphknoten der immunisierten NSEHa-Prnpo/o_Mäusen isoliert, ex vivo mit Maus-PrP bzw. Hamster-PrP stimuliert und auf die Proliferation von CD4-positiven oder CD8-positiven T-Lymphozyten untersucht. Durch die Analyse wurde gezeigt, dass es nach Immunisierung mit rek.PrP oder PrP-P30 zu keiner spezifischen Proliferation von T-Lymphozyten kam. Die beobachtete humorale Immunantwort scheint also unabhängig von einer spezifischen T-Zell-Immunantwort zu wirken. Die vorliegenden Ergebnisse zeigen, dass es möglich ist, durch die Wahl von geeigneten Immunisierungsstrategien, die Toleranz gegen das Selbstprotein PrP zu brechen. Sie stellen eine Grundlage für weitere Forschungsansätze dar, um prophylaktische Immunisierungen gegen Prionenerkrankungen in Zukunft zu realisieren. In einem weiteren Teil der Arbeit wurde die Funktion der apoptotischen Faktoren BAX und BCL-2 in der Prionen-induzierten Neurodegeneration in vivo untersucht. Dazu wurde neuroektodermales Gewebe aus BAX-/- und BCL-2-/- -Embryonen in das Gehirn von PrP-Knockout-Mäusen (Prnpo/o) transplantiert. Diese PrPC-defizienten Tiere sind nicht mit Prionen infizierbar und können PrPSc nicht propagieren. Nach Langzeitinfektion mit Mausprionen wurden die Transplantate histochemisch auf Prionenpathologie untersucht. Die typischen neuropathologischen Veränderungen waren dabei strikt auf das PrPC-positive Transplantat begrenzt. Zusätzlich wurden die Transplantate auf apoptotische Veränderungen untersucht und dabei TUNEL-Färbungen und aktivierte-Caspase-3 Färbungen durchgeführt. Es zeigten sich hierbei hinsichtlich Ausprägung und Stärke der Pathologie keine Unterschiede zwischen den BAX-bzw. BCL-2-Knockout Transplantaten und wildtypischen Transplantaten. Daraus konnte gefolgert werden, dass in diesem Modell weder BAX noch BCL-2 eine signifikante Rolle bei der Prionenpathogenese spielen. Die Ergebnisse aus diesem Teil der Arbeit leisten einen wichtigen Beitrag für das bessere Verständnis der durch Prionen-induzierten Neurodegeneration und sind für die Entwicklung von potentiellen therapeutischen Strategien hilfreich.
Foamyviren enthalten vier zentrale purinreiche Sequenzen, die Elemente A bis D. Bekannt sind solche auch bei anderen Retroviren, u.a. bei HIV, wo der cPPT (central polypurine tract) für eine effektive Replikation benötigt wird und eine Kopie des 3´PPT darstellt. Bei FV ist nur das Element D sequenzidentisch zum 3´PPT, welcher sich bei allen Retroviren findet und von welchem die Plusstrang-Synthese bei der Bildung der cDNA intiiert wird. Vermutet wurde daher für das Element D, das es einen zweiten Initiationsort für die Plusstrang-Synthese darstellt und analog zum cPPT bei HIV die Replikation zu beschleunigen vermag. Um die Funktion der purinreichen Sequenzen zu verstehen, führten wir Mutationen in die Elemente A bis D ein und untersuchten sie im infektiösen Volllängenklon sowie im Vektorkontext; zusätzlich analysierten wir die viralen Proteine in infizierten Zellen und Viruspartikeln.
Die Arteriosklerose ist ein chronisch entzündlicher Prozess der Gefäßwand, in dem CD4+CD25+FoxP3+ regulatorische T-Zellen („\(T_{reg}\)“) eine atheroprotektive Rolle spielen. Durch exogenen \(T_{reg}\)-Transfer konnten andere Gruppen eine Reduktion der Arteriosklerose nachweisen. In der vorliegenden Arbeit wurde die Aktivität der endogenen Treg durch spezielle Antikörper modifiziert, ihr Einfluss auf die Entwicklung arteriosklerotischer Plaques in ApoEko-Mäusen untersucht sowie eine mögliche Abhängigkeit dieser Wirkung vom zellulären Immunstatus des Wirts geprüft.
Im Abstand von 28 Tagen wurde weiblichen ApoEko-Mäusen zweimal der CD28-spezifische superagonistische monoklonale Antikörper D665 injiziert, um eine polyklonale Vermehrung ihrer \(T_{reg}\) anzuregen. In einer zweiten Versuchsreihe wurden endogene \(T_{reg}\) zweimal im Abstand von 28 Tagen durch Gabe eines CD25-spezifischen Antikörpers (PC61) zunächst depletiert und jeweils 7 Tage später durch D665 geboostert, um den Effekt der \(T_{reg}\) auf ein initial Treg defizientes Tiermodell zu testen. Verglichen wurde mit der alleinigen Treg-Depletion durch PC61 sowie mit einem Kontrollantikörper (Isotyp-IgG, MOPC). Die Quantifizierung der Arterioskleroseentwicklung erfolgte mittels Planimetrie der Plaquefläche der Aorta. Die Wirksamkeit der Antikörper auf die \(T_{reg}\)-Konzentrationen wurde mittels FACS-Analysen aus Blut und Milz untersucht.
Nach alleiniger \(T_{reg}\)-Amplifikation durch D665-Injektion zeigte sich kein Unterschied in der prozentualen Plaquefläche im Vergleich zur Kontrollgruppe. Auch eine alleinige Depletion mit PC61 zeigte keine Veränderungen in der Läsionsfläche. Durch Kombination beider Antikörper jedoch kam es nach Treg-Depletion mittels PC61, gefolgt von Treg-stimulierender D665-Behandlung, zu einer signifikanten Verminderung der prozentualen Plaquefläche der Aorta um 32,02% im Vergleich zur MOPC Kontrolle und um 28,73% im Vergleich zur alleinigen \(T_{reg}\)-Depletion mit PC61+MOPC. Die FACS-Analysen bestätigten eine signifikante Depletion durch PC61-Injektion sowie eine signifikante Zunahme der Treg eine Woche nach D665-Injektion.
Die Stimulation regulatorischer T-Zellen in einem Treg-defizienten arteriosklerotischen Tiermodell reduzierte die aortale arteriosklerotische Läsionsfläche signifikant. In der immunkompetenten ApoEko Maus jedoch bewirkte die alleinige Vermehrung oder die alleinige Depletion regulatorischer T-Zellen keine messbare Veränderung in der Plaqueentwicklung. Diese Arbeit zeigt, dass ein Zusammenhang zwischen der Wirksamkeit regulatorischer T-Zellen und der inflammatorischen Veränderung der Gefäßwand besteht.
Um die Verdteidigungsmechanismen der Wirtszelle gegen Sindbisvirusinfektion zu charakterisieren, haben wir in den Extrakten infizierter Zellen. Interferon(IFN)- stimulated- response- element (ISRE)- Bindungsproteine untersucht, welche in der transkriptionellen Induktion von IFN Typ I induzierter Gene beteiligt sind. Mittels Gelretentionsanalyse in der ein humanes Interferon-stimuliertes Gen 15 ( ISG15 ) Verwendung fand, wiesen wir in Extrakten von sindbisinfizierten L-929 Zellen verschiedene Proteinkomplexe nach, die nicht in Extrakten uninfizierter Zellen nachweisbar waren. Übereinstimmung im Laufverhalten mit Extrakten NDV-infizierter Zellen, in der ISRE-Bindungsspezifität und in Antikörperversuchen zeigt, dass die sindbisinduzierten Komplexe in L-929 Zellen den bekannten DRAF1 und ISGF3 entsprechen. Transfektion von L-929 Zellen mit polyr I:rC induzierte lediglich ISGF3.
Infektionen durch C. albicans auf den Schleimhäuten sind eine häufige Erkrankung bei Patienten mit einer Schwächung der T-Zellimmunität. Blutstrominfektionen mit der Hefe C. albicans (Candidämie) stellen, vor allem bei Patienten auf Intensivstationen, eine nach wie vor bedrohliche Komplikation mit hoher Letalität dar.
Das pH-regulierte Antigen 1 (Pra1) ist ein Protein, das von C. albicans produziert wird, auf der Oberfläche des Pilzes gebunden vorkommt und auch vom Pilz in den Überstand sezerniert wird. Im humanen System bindet das Protein an T-Zellen an das Oberflächenprotein CD46. Es ist des Weiteren bekannt, dass das Pra1 an bestimmte Immunzellen der Maus (Monozyten und Phagozyten) binden kann. Eine Bindung an T-Zellen der Maus ist bisher nicht beschrieben. Eine genaue Charakterisierung der Interaktion von Pra1 mit Immunzellen der Maus ist interessant, da die Maus als biologischer Modellorganismus zur Erforschung der Infektion mit C. albicans dient. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass rekombinantes Pra1 (rPra1) auch an Maus-CD4+ T-Zellen binden kann.
Es wurden Einflussfaktoren auf die gefundene Bindung von Pra1 an CD4+ T- Zellen gesucht. Als ein Einflussfaktor wurde Zink identifiziert. Pra1 kann an freies Zink binden und durch Zugabe von ZnCl2 während der Inkubation von Pra1 mit T-Zellen kann das Signal von gebundenem Pra1 an CD4+ T-Zellen erhöht werden. Aspf2, ein Protein aus Aspergillus fumigatus mit großer Homologie zu Pra1, kann nicht an diese Zellen binden.
Im in-vivo-Experiment mit Tieren, die mit C. albicans infiziert wurden, konnte kein wildtypisches sezerniertes Pra1 gebunden an T-Zellen nachgewiesen werden. Zellkulturüberstände von C. albicans zeigten nach Inkubation in vitro mit T-Zellen ein Signal für gebundenes Pra1 an CD4+ T-Zellen.
Die Bindungskinetik von Pra1 an T-Zellen zeigte eine über die Zeit der Inkubation konstante Zunahme des Signals von zellgebundenem rPra1 an CD4+ T-Zellen. In der off-Kinetik fand sich eine Abnahme des Signals über die Zeit bis an die Grenze der Nachweisbarkeit.
Der Bindungspartner von Pra1 auf T-Zellen konnte nicht identifiziert werden. Die strukturell und funktionell verwandten Oberflächenproteine Crry, CD59a und CD55 wurden auf Bindungsfähigkeit an T-Zellen in entsprechenden Knockout- Mäusen getestet, konnten jedoch als Rezeptor für Pra1 ausgeschlossen werden. Durch die Bindung von sezerniertem Pra1 an neutrophile Granulozyten wird die Fähigkeit dieser Zellen zur Phagozytose eingeschränkt. Die Bindung von Pra1 an CD4+ T-Zellen führt zur Kostimulation der T-Zellen, also zur verstärkten Zellaktivierung und Proliferation. Durch die Zugabe von 10 μM Zinkchlorid wird die kostimulatorische Aktivität von Pra1 verstärkt.
Während der Zellaktivierung von Effektor-Memory-CD4+ T-Zellen reduziert rPra1 die Sekretion von IFN-γ. Diese Reduktion von IFN-γ-produzierenden Zellen entsteht nicht durch einen Einfluss von Pra1 während der Zellaktivierung von naiven CD4+ T-Zellen zu Th1-Zellen und auch nicht durch die Auslösung von Apoptose in IFN-γ-produzierenden Th1-Zellen. Die Bindung von Pra1 an CD4+- T-Zellen, die über den T-Zell-Rezeptor aktiviert werden, reduziert in vitro die Sekretion des Zytokins. Zusätzlich werden weitere Zytokine in ihrer sezernierten Menge reduziert wie IL-2 und TNF-α.
Für die Replikation des Masernvirus wird den Komponenten des Zytoskeletts eine wichtige Rolle zugeschrieben. Die vorliegende Arbeit zeigt, dass Aktin in polymerisierter Form vorliegen muss, um das Budding zu ermöglichen. Die Beeinflussung der ersten Schritte des Replikationszyklus konnte für Aktin, vor allem aber für Tubulin nachgewiesen werden, so dass ein Transport des viralen Genoms zum Ort seiner Replikation entlang der Mikrotubuli möglich wäre.