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Im Rahmen dieser Arbeit wurden Liganden des zentralen Benzodiazepin-Rezeptors (BZD-R) aus pflanzlichen Geweben untersucht. Der erste Teil war dem Studium „natürlicher“ Benzodiazepine (BZD) gewidmet. Deren Vorkommen ist vielfach belegt; an ihrer Biogenese sind möglicherweise Mikroorganismen beteiligt. Es war nun zu prüfen, ob BZD auch unter Sterilbedingungen, d.h. nach Ausschluss mikrobieller Aktivität auftreten können. Hierzu wurden steril kultivierte pflanzliche Kalli und Regenerate, unter anderem von Kartoffelkraut und Estragon untersucht. Methanolische Extrakte wurden auf ihre Aktivität am zentralen BZD-R im Radiorezeptorbindungsassay (RRA) geprüft und mittels Festphasenextraktion bzw. präparativer HPLC-Fraktionierung gereinigt. Nach erneuter Prüfung im RRA erfolgte die Analyse aktiver Fraktionen mit Hilfe der online HPLC-ESIpos-Tandemmassenspektrometrie (HPLC-ESIpos-MS/MS) im SRM-Modus. Auf diese Weise gelang es, die BZD Delorazepam und Temazepam in Sterilkulturen von Estragon (Artemisia dracunculus), sowie Diazepam und Temazepam in Kartoffelkraut (Solanum tuberosum), nachzuweisen. Der zweite Teil der Arbeit war der Suche nach natürlichen Nicht-BZD-artigen Liganden des BZD-R gewidmet. Hierzu wurden methanolische Extrakte verschiedener in der Volksmedizin als Sedativa genutzter Pflanzen im RRA auf BZD-R-Aktivität getestet. Für die Isolierung von Nicht-BZD-artigen Liganden wurde der Salbeiblätterextrakt (Salvia officinalis L.) ausgewählt. In einer RRA-begleiteten chromatographischen Fraktionierung des Extraktes wurden fünf aktive Komponenten, drei Flavone und zwei Diterpene, isoliert. Die BZD-R-aktiven Flavone wurden als Apigenin (5,7,4’-Trihydroxyflavon), Hispidulin (5,7,4’-Trihydroxy-6-methoxyflavon)und Cirsimaritin (5,4’-Dihydroxy-6,7-dimethoxyflavon identifiziert. Bei den diterpenoiden BZD-R-Liganden handelte es sich um 7-Methoxyrosmanol und Galdosol. Hispidulin sowie die Diterpene erwiesen sich mit IC 50-Werten von 1.3, 7.2 und 0.8 µM als die BZD-R-aktivsten Komponenten. Apigenin und Cirsimaritin zeigten mit IC50-Werten von 30 bzw. 350 µM geringere Affinitäten zum BZD-R. Die hohe BZD-R-Aktivität von Hispidulin im RRA veranlasste uns, Untersuchungen zum pharmakologischen Profil sowie zur in vivo-Wirksamkeit dieser Substanz durchzuführen. Da die Isolierung aus pflanzlichem Material sehr zeit- und materialaufwendig ist, wurde Hispidulin durch chemische Synthese bereitgestellt. Diese erfolgte in Anlehnung an die Baker-Venkataraman-Methode aus 4-Benzyloxy-2,3-dimethoxy-6-hydroxyacetophenon und 4-Benzyloxybenzoesäurechlorid. Die Ausgangssubstanzen wurden in getrennten Syntheserouten, ausgehend von 2,4,6-Trihydroxyacetophenon und 4-Hydroxybenzoesäure, hergestellt. Danach wurde der Benzoylester aus dem Acetophenon- und dem Säurechlorid-Baustein gebildet. Der Ester wurde nach Baker-Venkataraman zum 1,3-Diketon in basischem Milieu umgelagert. Das 1,3-Diketon zyklisierte unter Säure-und Hitzeeinwirkung zum Flavon, das zur gleichzeitigen Entfernung der Schutzgruppen und der labilen C-5-Methylgruppe mit 1 M BCl3-Lösung bei etwa –70 °C behandelt worden ist. Mit dem chemisch synthetisierten Hispidulin erfolgten Studien zu dessen pharmakologischen Eigenschaften an rekombinanten GABAA-Rezeptoren im Xenopus laevis Oozyte-Modell. Hispidulin zeigte an allen untersuchten Rezeptor-Subtypen (alpha1-3,5,6beta2,gamma2) bereits in Konzentrationen ab 50 nM eine stark positive Stimulation des GABA-induzierten Ionenstromes. Maximale relative Stimulation wurde bei einer Konzentration von 10 µM erreicht, bei der Hispidulin 24 % der maximalen Diazepam-Wirkung aufwies. Da Hispidulin einen mit BZD-Agonisten vergleichbaren, jedoch geringeren Einfluss auf die GABA-induzierten Ströme zeigte, wurde das pharmakologische Profil als partiell agonistisch charakterisiert. Die weiteren Studien waren daher auf den Nachweis einer in vivo-Wirksamkeit von Hispidulin ausgerichtet. Das Modell der Mongolischen Wüstenrennmaus (Gerbil, Meriones unguiculatus) ist ein geeignetes Tiermodell zur Untersuchung epileptiformer Krämpfe und wird eingesetzt, um die Wirkung potentieller Antiepileptika zu untersuchen. Es bot uns die Möglichkeit, erste in vivo-Studien mit Hispidulin durchzuführen. Hierzu sind mittelschwere bis schwere Anfälle mit einer Häufigkeit von etwa 90 % induziert worden. Nach siebentägiger Verfütterung von Hispidulin (10 mg/kg KG pro Tag) und Diazepam (2 mg/kg KG pro Tag) (als Positivkontrolle) wurde sowohl in der Hispidulin-, als auch in der Positivkontrollgruppe eine Reduzierung schwerer Anfälle auf 30 bzw. 25 % beobachtet. Hispidulin zeigte in vivo eine mit Diazepam vergleichbare antikonvulsive Wirkung und damit das Potential eines möglichen Antiepileptikums.
Die Wirksamkeit eines Arzneistoffs hängt in entscheidendem Maße von seiner Wasserlöslichkeit ab. Schlechte Löslichkeit bedeutet eine große positive Änderung der Freien Energie während des Lösevorgangs. Hinweise zu finden, die zum besseren Verständnis des Lösungsprozesses führen, ist das Ziel dieser Arbeit. Auf der Grundlage des Hess’schen Satzes wird der Lösungsprozess in Ersatzprozesse zerlegt. Die Teilschritte der Ersatzprozesse werden thermodynamisch, kalorimetrisch und quantenchemisch beschrieben. Freie Energien, Standardenthalpien und Standardentropien der Teilschritte werden erfasst und beurteilt. Weitere physikochemische Größen werden gemessen oder berechnet, die mit den einzelnen Teilschritten in Zusammenhang stehen können. Einfache Naphthalinderivate dienen als Modellsubstanzen. Dies sind zwei einfach und sieben zweifach hydroxylierte Naphthaline, 1-Naphthylamin, 4-Chlor-1-naphthol und 2-Naphthalinthiol. Zum einen wird der Lösungsvorgang als Summe aus Sublimation und anschließender Solvatation betrachtet. Die Freien Sublimationsenergien werden aus dem experimentell ermittelten Sublimationsdampfdruck berechnet. Dies geschieht mittels einer Hochvakuumapparatur oder einer gaschromatographischen Methode. Je mehr polare Gruppen am Grundgerüst sind, desto höher ist der energetische Aufwand, das Molekül zu sublimieren. Die Freie Energie beträgt für Naphthalin 30,5 [kJ·mol-1], für einfach substituierte Naphthaline 40,1 und 45,3 [kJ·mol-1] und für zweifach hydroxylierte Naphthaline 51,8 bis 67,5 [kJ·mol-1]. In ähnlichem Verhältnis stehen auch die Freien Solvatationsenergien. Diese werden mittels AMSOL, eines quantenchemischen semiempirischen Rechenprogramm, für zwei Parametrisierungen AM1 und PM3 berechnet. Die Löslichkeit der Substanzen in Wasser wird ermittelt, und daraus die Freie Lösungsenergie berechnet. Der Unterschied in den Freien Lösungsenergien ist trotz des größeren Energieaufwandes der substituierten Derivate bei der Sublimation um ca. 10 [kJ·mol-1] je polarer Gruppe nicht deutlich. Die Ursache ist die Energiefreisetzung während der Solvatation, die mit zunehmenden polaren Gruppen mehr Energie freisetzt. Gründe dafür sind vermehrte Wasserstoffbrückenbindungen und stärkere Dipol-Dipol-Wechelswirkungen der höher substituierten Naphthaline. Ein den Freien Energien ähnliches Bild ergibt sich bei der Betrachtung der Standardenthalpien. Die Standardsublimationsenthalpie wird aus Sublimationsdrücken bei unterschiedlichen Temperaturen berechnet, die Standardlösungsenthalpie mittels Kalorimetrie und die Standardsolvatationsenthalpie aus der Differenz der beiden vorangegangenen. Adsorptionsmessungen werden durchgeführt, um kalorimetrische Falschmessungen durch Adsorption von Wasser an die Substanzen auszuschließen. Die Ursachen für ein den Freien Energien ähnliches Verhalten sind die gleichen. Eine Ausnahme bildet 1,3-Dihydroxynaphthalin, bei dem die Standardlösungsenthalpie um den Faktor 4 größer ist als bei den restlichen Dihydroxynaphthalinderivaten. Die Standardentropien werden aus den vorher gewonnenen Größen berechnet. Die Standardsublimationsentropien der untersuchten Substanzen liegen zwischen 162 und 350 [J·mol-1·K-1]. Ebenso steigen sie beim Lösevorgang mit Ausnahme von 2-Naphthalinthiol. Dort liegt die Ursache in der mangelnden Hydrophilie, so dass sowohl beim Lösen als auch beim Mischen der Ordnungszustand zunimmt. Bei der Solvatation sinkt die Entropiealler Substanzen mit Ausnahme von 1,3- Dihydroxynaphthalin. Eine Beurteilung aufgrund der Entropien zwischen den Naphthalinen zu machen, ist anhand der Messergebnisse nicht möglich. Die zweite Betrachtungsweise legt dem Lösungsprozess das Schmelzen und anschließende Mischen der Substanz mit dem Lösungsmittel zugrunde. Die Standardschmelzenthalpie wird kalorimetrisch aus Schmelzpunkt, Differenz der Wärmekapazitäten und der Schmelzwärme am Schmelzpunkt ermittelt. Die Standardmischungsenthalpien werden aus der Differenz von kalorimetrisch gemessener Standardlösungsenthalpie und Standardschmelzenthalpie berechnet. Die Standardschmelzenthalpien der Dihydroxynaphthaline sind geringer. Dies hat allerdings in den höheren Schmelzpunkten seine Ursache. Das chlorierte 1-Naphthol liegt mit seinem Schmelzverhalten im Bereich des einfachen 1-Naphthols, so dass das Chloratom scheinbar keine große Rolle im Schmelzprozess spielt. Die Änderungen der Entropien während des Schmelzprozesses werden aus den gleichen Größen wie die Standardschmelzenthalpie gewonnen. Die Mischungsentropie wird aus der Differenz von Schmelz- und Lösungsentropie berechnet. Die Ordnung während des Mischungsvorganges nimmt bei allen untersuchten Substanzen zu außer bei 2-Naphthalinthiol und Naphthalin. Beide hydrophoben Moleküle haben in wässriger Lösung weniger Möglichkeiten sich anzuordnen als in der Schmelze. In die Berechnung der Schmelzentropien gehen die Schmelztemperaturen mit ein. Je höher der Schmelzpunkt ist, desto niedriger ist die Standardschmelzentropie. Die Solvatationsenergien werden mittels AM1- und PM3-Parametrisierung in AMSOL berechnet und mit dem experimentell ermitteltem Wert verglichen. Die Berechnungsmethoden zeigen eine statistisch nicht unterscheidbare gleiche Korrelation von r2 = 0,97 für AM1 und r2 = 0,98 für PM3. Die Berechnung der Freien Solvatationsenergie setzt sich aus einzelnen Teilbeträgen zusammen. Ein Teil ist die freiwerdende Polarisationsenergie, die mit zunehmender Zahl polarer Substituenten ansteigt, da Partialladungen häufiger auftreten und polarisiert werden können. Auch die Oberflächenenergie trägt zur stärkeren Solvatation polar substituierter Naphthaline bei. Van der Waals-Oberflächen und –Volumina der untersuchten Moleküle werden mittels AMSOL berechnet. Die Oberflächen der Dihydroxynaphthaline liegen bei ca. 375 [Ǻ2], die einfach substituierten darunter. Die Volumina der Dihydroxynaphthaline werden zu ca. 146 [Ǻ3] berechnet. Berechnete logarithmierte Oktanol/Wasser-Verteilungskoeffizienten werden mit den experimentell ermittelten verglichen. Zur Berechnung wird eine AM1- und PM3-Parametrisierung verwendet. Beide Parametersätze können nur unzureichend Oktanol/Wasser-Verteilungskoeffizienten berechnen. Die Bestimmtheitsmaße r2 liegen unter 0,79. Modellrechnungen weisen als abschließende Beurteilung auf einzelne Größen hin, die mit Freier Sublimationsenergie, Freier Solvatationsenergie und Freier Lösungsenergie in engerem Zusammenhang stehen. Die Einflussgrößen werden auf maximal drei festgelegt, um eine Zufallskorrelation auszuschließen. Es lässt sich ein Modell für die Freie Sublimationsenergie berechnen, das für AM1-Berechnungen ein Bestimmtheitsmaß von r2 = 0,984 zeigt und die Moleküloberfläche, die Wechselwirkung von Polarisationsenergie und Molekülvolumen und das quadrierte Molekülvolumen mit einbezieht. Für PM3-Berechnungen werden das Molekülvolumen, das Dipolmoment in der Gasphase und die Wechselwirkung von Polarisationsenergie und Molekülvolumen herangezogen, wobei das Bestimmtheitsmaß r2 = 0,986 ist. Die experimentell ermittelte Freie Sublimationsenergie der untersuchten Substanzen kann durch drei berechnete Parameter beschrieben werden. Beim Modell zur Freien Solvatationsenergie werden Polarisationsenergie, Oberflächenenergie und Schmelztemperatur als die entscheidenden Einflussparameter herangezogen. Das Bestimmtheitsmaß r2 erreicht 0,979 für AM1-Berechnungen und 0,983 für PM3-Berechnungen. Das Modell zur Berechnung der Freien Lösungsenergie beruht auf der Polarisationsenergie, der Schmelztemperatur und dem Molekülvolumen bei AM1-Berechnungen. Statt des Molekülvolumens wird bei PM3-Berechnungen als dritte Größe die Schmelzwärme herangezogen. Die Korrelation ist mit r2 = 0,847 bei AM1-Berechnungen und r2 = 0,879 bei PM3-Berechnungen nicht zufällig, aber nicht so deutlich wie bei den beiden anderen Modellierungen. Ausblickend lässt sich festhalten, dass auch 13 Substanzen für eine umfassende theoretische Erfassung der Ersatzprozesse zum Lösungsvorgang nicht ausreichen. Ein wichtiger Schritt wird die Beschreibung der Kristallstruktur und der Gitterenergie sein, um befriedigende Löslichkeitsvorhersagen machen zu können.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden kapillarelektrophoretische Methoden entwickelt, mit denen es möglich ist, Gentamicinsulfat in Haupt- und Nebenkomponenten zu trennen. Ausgelöst wurden die Untersuchungen im Jahr 2000, da in den USA über 60 Patienten durch Gentamicin starben. Es wurde vermutet, dass dies auf Verunreinigungen in gewissen Chargen zurückzuführen ist. Gentamicin wird fermentativ aus Micromonospora purpurea gewonnen. Durch leichte Abweichungen im Herstellungsprozess können Produkte entstehen, die mit den bisher angewendeten Analysenmethoden nicht nachzuweisen sind. In der momentanen Arzneibuch-Monographie von Gentamicinsulfat wird zur Prüfung der verwandten Substanzen eine HPLC-Methode beschrieben, die Gentamicin ohne Derivatisierung mit einem gepulsten amperometrischen Detektor detektiert. Vorteil dieser Methode ist, dass Gentamicin nicht derivatisiert werden muss. Der große Nachteil dieser Methode ist aber, dass die einzelnen Peaks sehr lange Migrationszeiten haben (bis über 10 Minuten) und somit Verunreinigungen überdeckt werden können. Außerdem sind viele Bestandteile nicht von den Hauptkomponenten abgetrennt. Weiterhin ist diese Methode nicht sehr robust, da der Detektor sehr empfindlich ist. Eigene HPLC-Messungen an mehreren Gentamicin-Chargen zeigten die Probleme auf. Da Gentamicin kein chromophores System hat, kann es nicht mit einem UV/VIS-Detektor detektiert werden. Um dies dennoch zu ermöglichen, kann Gentamicin mit verschiedenen Reagenzien derivatisiert werden. In der vorliegenden Arbeit wurden alle Aminoglykoside mit ortho-Phthaldialdehyd und 2-Mercaptoessigsäure derivatisiert. Somit war eine Detektion bei 330 nm bzw. 340 nm möglich. Zur Trennung von Gentamicinsulfat wurde eine spezielle kapillarelektrophoretische Methode entwickelt. Die mizellare elektrokinetische Chromatographie (MEKC) ist nach Derivatisierung in der Lage, nahezu alle in der Monographie beschriebenen aber auch einige nicht aufgeführte Verunreinigungen zu trennen. Die Trennung erfolgt in einer Kieselgelkapillare mit einer Gesamtlänge von 33.0 cm, einer effektiven Länge von 24.5 cm und einem Innendurchmesser von 50 µm. Als Hintergrundelektrolyt wird ein Natriumtetraborat-Puffer verwendet (100 mM, pH 10.0), zu dem Desoxycholsäure-Natrium als mizellbildendes Reagenz in einer Konzentration von 20 mM und weiterhin beta-Cyclodextrin in einer Konzentration von 15 mM zugegeben wird. Die Proben werden hydrodynamisch bei 5000 Pa innerhalb 5 Sekunden auf der Anodenseite injiziert. Die Trennung erfolgt bei einer Kapillartemperatur von 25 °C und einer Trennspannung von +12 kV. Pikrinsäure wird als Interner Standard benutzt. Die Detektion erfolgt UV-spektroskopisch bei 340 nm. Die Hauptpeaks konnten durch „spiken“ mit den Einzelkomponenten, die u.a. säulenchromatographisch gewonnen wurden, identifiziert werden. Die vier Hauptkomponenten Gentamicin-C1, C1a, C2 und C2a sind basisliniengetrennt ebenso wie Gentamicin-C2b, die Verunreinigungen Garamin, Desoxystreptamin und Sisomicin. Bei den Untersuchungen von über 40 Gentamicin-Chargen verschiedener Hersteller und Händler fielen sowohl deutliche Unterschiede bezüglich der einzelnen Gehalte der Hauptkomponenten auf, als auch verschiedene Grade der Verunreinigungen. Anhand der Menge der Verunreinigungen konnten die Chargen in verschiedene Gruppen eingeteilt werden. Die Verunreinigung Sisomicin kann als Leitsubstanz der Verunreinigungen bezeichnet werden, da bei allen stärker verunreinigten Chargen Sisomicin in beträchtlichen Mengen vorhanden ist. Unter den untersuchten Proben befanden sich auch die Proben, die in den USA die eingangs erwähnten Todesfälle verursacht haben. Diese Proben konnten der Gruppe der stärker verunreinigten Gentamicin-Chargen eindeutig zugewiesen werden. Die Richtigkeit aller Messungen wurde durch 1H-NMR-Messungen bestätigt. Die Anwendbarkeit der entwickelten MEKC-Methode wurde auch an weiteren Aminoglykosiden untersucht. Die Methode ist ohne Änderung auf Sisomicin übertragbar. Der Sisomicin-Peak ist deutlich abgetrennt vom OPA-Reagenzpeak. Selbst kleine Verunreinigungen der CRS-Substanz können mit dieser Methode erkannt werden. Netilmicin und Amikacin können nicht ohne Änderungen mit der Methode vermessen werden, da sie unter diesen Bedingungen mit dem OPA-Peak komigrieren. Eine Anhebung der Trennspannung von +12 kV auf +14 kV lassen die Peaks hervortreten. Eine Unterscheidung der beiden Substanzen ist im Elektropherogramm nicht möglich, allerdings können sie durch 1H-NMR-spektroskopische Messungen identifiziert und unterschieden werden. Netilmicin wurde in vielen Gentamicin-Proben nachgewiesen. Bei Kanamycin liegen mit dieser Methode im Elektropherogramm sehr viele kleine Peaks sehr nahe beieinander. Durch Absenkung der Kapillartemperatur auf 20 °C können diese Peaks etwas besser getrennt werden...
In der vorliegenden Arbeit werden instrumentell-analytische Studien zur enzymatischen und chemischen Bildung von 4-Hydroxy-2,5-dimethyl-3(2H)-furanon (HDMF) und 4-Hydroxy-5-methyl-3(2H)-furanon (HMF) – zwei wichtigen Aromakomponenten zahl-reicher Früchte und verarbeiteter Lebensmittel – vorgestellt. Die Studien demonstrieren erstmals die Bildung dieser Verbindungen aus Zuckerphosphaten unter physiologischen Reaktionsbedingungen. Ein Schwerpunkt der Arbeiten lag dabei auf der Bildung von HDMF aus D-Fructose-1,6-diphosphat (Fru-1,6-dP) durch den Hefestamm Zygosaccharomyces rouxii. Der Zusatz von 1-13C-Fru-1,6-dP bzw. 13C6-D-Glucose zum Nährmedium der Hefe Z. rouxii zeigte, dass ausschließlich exogen zugesetztes Fru-1,6-dP durch die Hefe zu HDMF transformiert wird. Untersuchungen, in denen der Einfluss verschiedener Wachstumsbedingungen auf die HDMF-Bildung durch Z. rouxii getestet wurde, zeigten bezüglich der HDMF-Bildung ein pH-Optimum bei pH 5.1 sowie eine maximale Produktivität der Zellen bei einer NaCl-Konzentration von 20%. Mittels einer neu entwickelten cKZE-Methode wurde für durch Z. rouxii gebildetes HDMF eine Enantiomerenanreicherung von 27%ee nachgewiesen, was eine enantioselektive Biosynthese durch Enzymsysteme der Hefe impliziert. Als Grundvoraussetzung für den Nachweis einer Enantiomerenanreicherung im HDMF-Molekül stellte sich ein schwach-saurer pH-Wert des wässrigen Mediums heraus. Dies konnte durch Ermittlung der Tautomerisierungsgeschwindigkeit des HDMF-Moleküls mittels 1H-NMR-Spektroskopie belegt werden. Anhand von HPLC-MS/MS-Analysen wurde die Bildung von HMF in zellfreien cytosolischen Rohproteinextrakte aus Z. rouxii, welche mit Fru-1,6-dP und Nicotinamidadenindinucleotiden (NAD, NADH, NADP, NADPH) inkubiert worden waren, nachgewiesen. In Substratstudien wurde HMF nach Applikation von Fru-1,6-dP, D-Fructose-6-phosphat, D-Glucose-6-phosphat, 6-Phosphogluconsäure, D-Ribose-5-phosphat (Rib-5-P) und D-Ribulose-1,5-diphosphat an cytosolische Proteinextrakte nachgewiesen. Die für die Transformationen der Hexosephosphate zu D-Ribulose-5-phosphat (Ribu-5-P) benötigten Enzyme Fructose-1,6-diphosphatase, Phosphohexose-Isomerase, Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase und 6-Phosphogluconsäure-Dehydrogenase konnten mittels spezifischer Enzymassays in den cytosolischen Extrakten nachgewiesen werden. Gebildetes Ribu-5-P wird im Folgenden spontan in HMF umgelagert (> 1%). Die Inkubation von Phosphoribose-Isomerase mit Rib-5-P in Gegenwart von o-Phenylendiamin (o-PD) führte zur Bildung von 2-Methyl-3-(1,2-dihydroxyethyl)-quinoxalin, das anhand seiner UV-, MS- und NMR-Daten eindeutig identifiziert wurde. Daraus konnte die Bildung von 4,5-Dihydroxy-2,3-pentandion (DPD) in den Reaktionsansätzen abgeleitet werden, was durch die Synthese der entsprechenden deuterierten bzw. unmarkierten Alditolacetat-Derivate und anschließende HRGC-MS-Analyse abgesichert wurde. Durch Inkubation von 1-13C-Ribu-5-P bzw. 5-13C-Ribu-5-P mit o-PD und HPLC-MS/MS-Analyse der entstandenen Quinoxalinderivate konnte gezeigt werden, dass die Methylgruppe des DPD-Moleküls infolge einer nicht-enzymatischen Phosphat-Eliminierung gebildet wird. Nach Applikation von o-PD an reife Tomaten wurde mittels HPLC-MS/MS ebenfalls 2-Methyl-3-(1,2-dihydroxyethyl)-quinoxalin detektiert. Dieses Ergebnis impliziert ein genuines Vorkommen von DPD in Tomaten, in deren Aromaextrakten auch HMF nachgewiesen wurde. Somit ist in natürlichen Systemen ebenfalls von einer HMF-Bildung über diese Zwischenverbindung auszugehen. Anhand von HPLC-UV-MS/MS-Analysen wurde eine selektive Bildung von HDMF aus Fru-1,6-dP in Gegenwart von NADH unter milden Reaktionsbedingungen nachgewiesen. Durch Inkubation von 1-13C-Fru-1,6-dP mit [4R,S-2H2]-NADH und anschließender HRGC-MS-Analyse des gebildeten isotopen-markierten HDMF konnte gezeigt werden, dass HDMF infolge eines nicht-enzymatischen Hydrid-Transfers von NADH auf eine aus Fru-1,6-dP abgeleitete Zwischenverbindung gebildet wird. Das Hydrid-Ion wird hierbei selektiv auf C-5 oder C-6 des Kohlenhydratgrundgerüstes des Zuckerphosphates übertragen. Der Zusatz von o-PD und Fru-1,6-dP zum Z. rouxii-Nährmedium und anschließende HPLC-DAD-Analyse führte zur Detektion von drei Quinoxalinderivaten. Diese wurden anhand ihrer MS/MS-Daten und NMR-Spektren als phosphorylierte Quinoxalinderivate identifiziert, aus denen sich die Bildung von 2-Hexosulose-6-phosphat, 1-Deoxy-2,3-hexodiulose-6-phosphat und 1,4-Dideoxy-2,3-hexodiulose-6-phosphat in den Nährmedien ableiten ließ. Somit gelang erstmals der Beweis der Bildung von 1-Deoxy-2,3-hexodiulose-6-phosphat im Nährmedium, einem vielfach postulierten, aber bislang nicht nachgewiesenen Intermediat der HDMF-Bildung aus Fru-1,6-dP. Aufgrund der enantioselektiven Bildung von HDMF durch die Hefen wird daher bei der HDMF-Biosynthese durch Z. rouxii von einer Kombination aus nicht-enzymatischen Reaktionsschritten und einer durch Oxidoreduktasen der Hefezellen vermittelten Reduktion ausgegangen.
Im Rahmen der Arbeit werden Ergebnisse zu Untersuchungen an Fumonisinen, einer erts seit 1988 bekannten Gruppe von kanzerogenen Fusarium-Mykotoxinen, vorgestellt. Die Schwerpunkte liegen auf den Aspekten: 1)Qualitative und quantitative Erfassung von NCM-FB1, einem rektionsprodukt von FB1, in maishaltigen Lebensmitteln. 2)Charakterisierung weiterer Reaktionsprodukte der Fumonisine 3)Vorkommen von Fumonisisnen in Gemüse 4)Zellkuturstudien zur biologischen Aktivität der Fumonisine 5)Modellstudien zum Metabolismus von FB1 beim Menschen
Sorbitol fermentierende (SF) Shiga Toxin-Produzierende Escherichia coli (STEC)-Stämme des Serotyps O157:H- stellen bedeutsame Auslöser für Durchfallerkrankungen und des lebensbedrohlichen Hämolytisch-Urämischen Syndroms (HUS) in Mitteleuropa dar. Die Virulenzfaktoren und Krankheitsbilder solcher Stämme ähneln denen von STEC O157:H7-Stämmen, welche weltweit am häufigsten innerhalb der O157-Serogruppe isoliert werden. Für zwei STEC O157:H7-Stämme ist die komplette Genomsequenz bereits veröffentlicht. Über SF STEC O157:H- sind hingegen nur einige genetische Unterschiede mit STEC O157:H7 bezüglich der Ausstattung an Virulenzfaktoren bekannt. Diese sind vorwiegend auf den Plasmiden beider Serotypen kodiert. In einem Modell, das die Entstehungsweise des O157-Komplexes zu erklären versucht, wird der nicht begeißelte, Sorbit fermentierende O157:H- -Serotyp als eigene phylogenetische Linie angesehen. Um einen tieferen Einblick in die genomische Diversität dieser beiden O157-Linien zu erhalten, wurden verschiedene molekularbiologische Methoden eingesetzt. Als Modellstamm für SF STEC O157:H- diente der Stamm 493/89, welcher von einem HUS-Patienten aus Deutschland isoliert wurde. Zum einen wurde eine Cosmid-Genbank des Stamms 493/89 sequenziert und mit dem STEC O157:H7-Referenzstamm EDL933 verglichen. Des weiteren wurde eine subtraktive suppressive Hybridisierung (SSH) mit beiden Stämmen des gleichen Serotyps durchgeführt. Ein Vergleich beider Genome mit dem kompletten Genom des apathogenen Laborstammes E. coli K-12 erfolgte über die Makroarraytechnik. Schließlich wurde der Stamm 493/89 mit Hilfe eines Makroarrays, auf dem bekannte Virulenz-assoziierte DNA-Sequenzen untergebracht sind (Pathoarray) untersucht. Nach Anwendung dieser Techniken konnten zwei weitere Gene in SF STEC O157:H- identifiziert werden, die für potentielle Virulenzfaktoren kodieren. Mit dem Gen für den ?EHEC factor for adherence? (Efa1), welcher gleichzeitig auch als Lymphostatin (LifA) beschrieben wird, ist in SF O157:H- ein multifunktionelles Gen vorhanden, welches nur fragmentiert in O157:H7 präsent ist. In 90 % der getesteten SF O157:H- -Stämme wurden außerdem die Gene für das ?Cytolethal Distending Toxin? (CDT) detektiert. Diese weisen die größte Ähnlichkeit zu cdt-III des E. coli O15:H21-Stammes S5 auf, welche dort auf einem Plasmid kodiert vorliegen. Im Gegensatz dazu sprechen die flankierenden Sequenzen von cdt in E. coli 493/89 für ein Gen, das durch einen temperenten Phagen aufgenommen wurde. So konnte cdt, wenn auch nur in geringem Ausmaß in STEC O157:H7-Stämmen durch PCR-Analyse gefunden werden. Die beiden Makroarrays lieferten für beide Serovare eine bemerkenswerte Anzahl spezifischer Sequenzen. Der E. coli K-12 Makroarray bekräftigt zudem die größere Ähnlichkeit des nicht pathogenen E. coli K-12 Genoms mit SF STEC O157:H- als mit STEC O157:H7. Mit Hilfe der Cosmid-Genbank wurde in SF STEC O157:H- eine 8,8 Kb große Sequenz ermittelt, die phagenhomologe Bestandteile der Shigella-Resistance Locus (SRL)-Pathogenitätsinsel (PAI) von Shigella flexneri 2a enthält. Diese Sequenz fehlt in STEC O157:H7 und deutet Gemeinsamkeiten für SF STEC O157:H- und Shigella flexneri 2a bezüglich ihrer Phagentransduktion an. Die Präsenz von efa1/lifA, cdt und der 8,8 Kb großen SRL-homologen Sequenz wurde auch bei E. coli O55:H- -Stämmen durch PCR überprüft. Diese werden als vermutliche Vorstufe des O157-Komplexes angesehen. Die Ergebnisse lassen erkennen, dass efa1/lifA bereits in diesem E. coli O55-Vorläufer vorhanden war, die SRL-homologe Sequenz aber erst vor und cdt nach der Abzweigung in die O157:H- -Linie erhalten wurde. In O157:H7 wurden efa1/lifA und der SRL-homologe Genbereich teilweise oder vollständig deletiert. Die Ergebnisse bestätigen in ihrer Gesamtheit SF STEC O157:H- als ein eigenständig entwickeltes Pathogen mit klar erkennbaren Unterschieden zu STEC O157:H7 und bekräftigen damit seine bedeutsame Position innerhalb der epidemiologisch relevanten STEC-Serogruppen.
Die Fließeigenschaften von Pulvern spielen nicht nur in der pharmazeutischen Industrie, sondern auch in verschiedenen anderen Industriezweigen wie z.B. der Lebensmittelindustrie eine bedeutende Rolle. So werden Abfüllvorgänge durch schlechte Fließeigenschaften erschwert. Um die Fließeigenschaften zu verbessern werden Fließregulierungsmittel zugesetzt. Obwohl ihr Gebrauch weit verbreitet ist, ist über ihren Wirkungsmechanismus wenig bekannt. Deshalb sind im Rahmen dieser Arbeit 14 beliebige Nanomaterialien aus verschiedensten Einsatzgebieten auf ihre fließregulierende Wirkung hin untersucht und bewertet worden. Dafür wurden im Turbulamischer binäre Pulvermischungen hergestellt und mittels Zugspannungstester und Analyse von REM-Aufnahmen ausgewertet. Dabei zeigte sich, dass die Fähigkeit eines Stoffes, als Fließregulierungsmittel zu wirken, in erster Linie unabhängig von seiner chemischen Natur ist. Auch seine Primärpartikelgröße erweist sich zur Bestimmung der fließregulierenden Wirkung als nicht aussagekräftig. Vielmehr werden die Agglomerate eines Nanomaterials wie künstliche Rauigkeiten an die Oberfläche des Trägermaterials adsorbiert. Die Arbeitshypothese konnte dadurch bestätigt werden: Die Reduktion der Zugspannung ist allein von zwei Faktoren abhängig: von der Größe der Agglomerate des Nanomaterials und von der Dichte, mit der diese Agglomerate die Oberfläche des Trägermaterials belegen. Ein Fließregulierungsmittel ist um so potenter, je kleiner seine Agglomerate sind und je dichter sie auf dem Trägermaterial angeordnet werden können. Theoretisch kann den Ergebnissen zufolge ein „freifließender“ Wirkstoff mit einem identischen Wirkstoff in Nanogröße als Fließverbesserer hergestellt werden. Die Auswirkungen der Einflussfaktoren wie die spezifische Oberfläche, die Oberflächenbeschaffenheit, die chemisch-physikalischen Eigenschaften wie Hydrophobie / Hydrophilie, die elektrostatische Aufladbarkeit und die Struktur können wie folgt zusammengefasst werden: Sie bestimmen die innerhalb eines Agglomerats wirksamen Kräfte (Van-der-Waals-Kräfte, Wasserstoffbrückenbindungen, formschlüssige Bindungen). Können diese schnell überwunden werden, lassen sich die Agglomerate leicht zerkleinern. Somit belegen sie die Oberfläche des Trägers dicht und senken die Zugspannung dementsprechend stark ab. Da in hydrophoben Produkten keine Wasserstoffbrückenbindungen ausgebildet werden, sondern nur Van-der-Waals-Kräfte die Agglomerate aufbauen, setzen diese Produkte die Zugspannung insgesamt schneller und stärker herab als hydrophile Produkte. Es hat sich herausgestellt, dass der Mischvorgang neben der homogenen Verteilung des Nanomaterials zusätzlich eine Zerkleinerung der Agglomerate der hochdispersen Substanzen bewirkt. Dabei agieren die groben Trägerpartikel wie Kugeln in einer Kugelmühle, die hochdispersen Substanzen wie das zu zerkleinernde Gut. Daher steigt die Belegung des Trägermaterials während des Mischvorgangs an. Die Zugspannung sinkt. Nach Rumpf reduzieren Rauigkeiten die interpartikulären Haftkräfte.[1] Mit der vorliegenden Arbeit wird nachgewiesen, dass dieser Ansatz auch auf den Wirkmechanismus von Fließverbesserern übertragbar ist. Fließregulierungsmittel bewirken als künstliche Oberflächenrauigkeiten eine Verringerung der Kontaktfläche und eine Vergrößerung des Abstands zwischen zwei Partikeln. Dies führt zur Abnahme der Van-der-Waals-Kräfte. Der Versuch, die Wirkungsweise eines Fließverbesserers über den Kugellager-Effekt zu erklären, ist daher abzulehnen. Da der Ansatz von Rumpf mit einer Rauigkeit mittig im Kontaktbereich für reale Systeme nicht umfassend genug ist, konzentriert sich die vorliegende Arbeit besonders auf die tatsächliche Dichte der Belegung des Trägermaterials mit fließregulierenden Partikeln. Rechnerisch kann mit dem 3-Rauigkeiten-Modell begründet werden, warum die Belegungsdichte von besonderer Bedeutung ist. Literatur: [1] H. Rumpf, Chemie-Ingenieur-Technik 1974, 1, 1-11