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Staphylokokken, insbesondere Staphylococcus aureus sowie der Koagulase-negative Staphylococcus epidermidis, haben sich in den letzten Jahren als dominante Erreger nosokomialer Infektionen etabliert. Diese erstaunliche Anpassung an eine neue ökologische Nische beruht bei S. epidermidis vor allem auf drei Faktoren: (i) der Fähigkeit, Biofilme auf abiotischen Oberflächen auszubilden, (ii) dem Erwerb multipler Antibiotikaresistenzen und (iii) einer hohen genotypischen Variabilität. Ein markantes Beispiel für genotypische Variabilität ist die Phasenvariation der Biofilmbildung durch Insertion und präzise Exzision der Insertionssequenz IS256 aus dem ica-Operon. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde der „OFF-ON“ Mechanismus der Phasenvariation, die präzise Exzision von IS256, untersucht. Dabei wurde demonstriert, dass IS256 inklusive der 8 bp target site Duplikation in einem Transposase-unabhängigen Prozess vollständig aus dem Chromosom entfernt wird, ohne chromosomale Umordnungen oder neue Insertionen. Präzise Exzision war hingegen abhängig von der Integrität der target site Duplikationen. Auch nach Insertion von IS256-Derivaten auf einem Plasmidsystem (spc::IS256) konnte präzise Exzision Transposase-unabhängig erfolgen. Die Wahrscheinlichkeit der Exzision für die vollständige IS256-Sequenz betrug in diesem System ca. 1x10-11 pro Generation und Zelle. Ab einer Verkürzung der Mikrohomologien zwischen den 8 bp target site Duplikationen auf 6 bp war präzise Exzision nicht mehr nachweisbar. Bei Verkürzung der IS256-Sequenz auf ca. 160 bp (target site Duplikation und inverted repeats blieben intakt) wurde die Wahrscheinlichkeit der präzisen Exzision ca. dreifach erhöht. Diese Beobachtungen unterstützen die Hypothese, dass diese Form der illegitimen Rekombination durch replicational slippage verursacht wird. Gleichzeitig weisen die Daten darauf hin, dass bei der Phasenvariation durch IS256 Insertions- und Exzisionshäufigkeit im Ungleichgewicht stehen. Während der Durchführung der Experimente zur präzisen Exzision aus icaC wurden nach mehrtägiger Passage häufig Varianten isoliert, die trotz noch vorhandener icaC::IS256 Insertion starke Biofilmbildner waren. Derartige biofilmpositive, PIA-negative Phasenvarianten wiesen im Atomic force Mikroskop einen anderen Phänotyp als der Wildtyp auf. Anstelle von fädiger extrazellulärer Substanz wie beim Wildtyp wurde verstärkt eine polymorphe, aus globulären Untereinheiten bestehende Matrix produziert. Im Gegensatz zum Wildtyp, der in einem vorrangig polysaccharidbasierten Biofilm wuchs, wurde dieser alternative Biofilm durch Proteinkomponenten vermittelt. Die Regulation des proteinogenen Biofilms unterschied sich vom PIA-Biofilm. Zugabe von 4 % NaCl inhibierte den proteinogenen Biofilm vollständig, während es im Wildtyp die Biofilmbildung induzierte. Zusatz von 3 % Ethanol im Medium bewirkte eine wesentlich stärkere Induktion der Biofilmbildung als beim Wildtyp. Die Transkriptmenge des accumulation associated protein, aap, war in der Phasenvariante im Vergleich zum Wildtyp erhöht. Dies spiegelte sich auch auf Proteinebene in einer erhöhten Expression von Aap wider. Die Daten zeigen, dass S. epidermidis über einen alternativen Mechanismus der Biofilmbildung verfügt, der zu einer Modulation der IS256-bedingten Phasenvariation der Biofilmbildung führen kann. Im dritten Teil dieser Arbeit wurde die spezifische DNA-Bindung der IS256 Transposase in vitro näher charakterisiert. Dazu wurde die IS256 Transposase heterolog überexprimiert und mittels eines N-terminalen Calmodulin binding tag CBP)gereinigt. Im Electrophoretic Mobility Shift Assays (EMSA) band die CBP-Transposase spezifisch an IRL bzw. IRR DNA-Fragmente, zeigte jedoch eine leicht erhöhte Affinität zum IRR. Durch Atomic force Mikroskopie ließ sich die Bindung der CBP-Transposase an die inverted repeats innerhalb eines circle junction DNA-Fragments sowie unspezifische DNA-Endbindung nachweisen. Deletionen innerhalb der DNA-Sequenz des linken und rechten inverted repeats und anschließende EMSA-Experimente demonstrierten, dass die Transposase den inneren Bereich der inverted repeats erkennt und bindet. EMSA-Experimente mit verkürzten Transposasederivaten wiesen darauf hin, dass sich das DNA-Bindungsmotiv in der N-terminalen Domäne der Transposase befindet. Die identifizierte Proteinregion (Aa100-130) umfasste zwei a-Helices, getrennt durch einen kurzen turn, mit typischen Charakteristika eines Helix-turn-helix Motivs. Durch Punktmutationen wurden sechs konservierte Aminosäuren in diesem Bereich ausgetauscht und der Effekt im EMSA überprüft. Austausch von L103 und L127 gegen den Helixbrecher Prolin hatte keinen Effekt auf das Bindungsverhalten. Die Mutationen Y111A, G114W, T117A und R118A hingegen führten zu einer stark abgeschwächten Bindung bzw. zum Verlust des Bindungsvermögens. Damit wurde erstmals die DNA-Bindungsdomäne eines Elements der IS256-Familie näher beschrieben.
Staphylococcus epidermidis zählt zu den häufigsten Erregern nosokomialer Infektionen im Zusammenhang mit implantierten Fremdkörpern. Diese Bakterien zeigen eine außergewöhnliche phänotypische und genotypische Variabilität, von der auch die Expression wichtiger virulenz- und resistenzassoziierter Gene betroffen ist. Möglicherweise verfügen Staphylokokken damit über Anpassungsstrategien, die sie für das Überleben unter wechselnden Umweltbedingungen benötigen. In der vorliegenden Arbeit wurde die Rolle von bakteriellen Insertionssequenzen (IS) bei der Genomplastizität von Staphylococcus epidermidis untersucht. Im Mittelpunkt des Interesses stand dabei das Insertionselement IS256 und sein Einfluß auf die Biofilmbildung von Staphylococcus epidermidis. Die Fähigkeit von S. epidermidis, an Oberflächen zu haften und Biofilme zu bilden ist von der Präsenz und Expression des ica-Operons abhängig, das Enzyme für die Synthese eines Exopolysaccharids (PIA) kodiert. Die PIA-Produktion ist äußerst variabel und hat damit Einfluß auf das Virulenz- und Kolonisierungsverhalten dieser Bakterien. Im ersten Teil dieser Arbeit wurde gezeigt, daß die veränderliche PIA-Produktion bei S. epidermidis im wesentlichen auf drei Mechanismen zurückzuführen ist, an denen das IS-Element IS256 ursächlich beteiligt ist. Zunächst konnte durch den Vergleich der IS256-spezifischen Hybridisierungsmuster eines biofilmbildenden S. epidermidis-Wildtypstammes und dessen PIA-negativer Spontanvarianten gezeigt werden, daß die multiplen IS256-Kopien im Genom dieses Stammes außerordentlich aktiv sind. Die nähere Analyse der Varianten ergab bei einem Teil der PIA-negativen Abkömmlinge umfangreiche IS256-vermittelte genomische Umordnungen als Ursache für den Verlust der Biofilmbildung. Eine weitere Gruppe von Biofilm-negativen Varianten wies IS256-Insertionen im ica-Gencluster auf. Die Verteilung der Insertionsstellen im ica-Operon ließ darauf schließen, daß es sich bei dem icaC-Gen um einen Hot-spot für die Integration von IS256 handelt. Solche ica::IS256-Insertionen konnten bereits in zahlreichen S. epidermidis Stämmen nachgewiesen werden. Da diese Insertionen reversibel sind, bilden sie eine wesentliche Ursache für die Phasenvariation der Biofilmbildung von S. epidermidis. Bei einer dritten Gruppe von Varianten konnten Deletionen verschieden großer DNA-Abschnitte im S. epidermidis-Chromosom beobachtet werden, die zu einem Verlust der ica-Gene und damit der Fähigkeit, Biofilme auszubilden, führte. Um die Frage zu klären, welche Gene in der Umgebung des ica-Operons liegen und durch die Deletion von bis zu 250 kb-großen DNA-Fragmenten verloren gehen, wurde eine Cosmid-Genbank des S. epidermidis –Wildtypstammes erstellt. Die durch Nukleotidsequenzierung erhaltenen Informationen wurden mit der in der Genom-Datenbank zur Verfügung stehenden Sequenz des 1. A ZUSAMMENFASSUNG 2 Referenzstammes S. epidermidis RP62A verglichen und in einer Genkarte zusammengefaßt. Neben einzelnen Unterschieden zwischen den beiden S. epidermidis-Stämmen fiel vor allem auf, daß mehrere der von der Deletion betroffenen Leseraster für Proteine mit Ähnlichkeiten zu oberflächenassoziierten Proteinen kodieren, die an der Adhärenz der Bakterien beteiligt sein könnten. Daneben finden sich aber auch Leserahmen mit Ähnlichkeiten zu Transportsystemen und zahlreiche mobile genetische Elemente. Diese Ergebnisse lassen vermuten, daß das ica-Operon von S. epidermidis möglicherweise Teil einer Pathogenitätsinsel ist. Die Analyse der Deletionsrandbereiche einer Mutante ergab, daß der Verlust von mehr als 200 kb DNA durch homologe Rekombination zwischen zwei IS256-Elementen vermittelt wurde, die im Wildtypstamm in gleicher Orientierung zueinander vorlagen. Da IS256 offensichtlich eine wichtige Rolle bei der Genomplastizität von S. epidermidis spielt, konzentrierte sich der zweite Teil der Arbeit auf die Aufklärung des Transpositionsmechanismus dieses IS-Elements. Dabei konnte gezeigt werden, daß IS256 eine alternative Transpositionsreaktion nutzt, die durch die Bildung zirkulärer, extrachromosomaler DNA-Moleküle gekennzeichnet ist. Diese DNA-Zirkel bestehen aus einer vollständigen IS256-Kopie, bei der die beiden Enden des Elementes durch eine variable Anzahl von Nukleotiden fremder DNA als Brücke miteinander verbunden sind. Es konnte gezeigt werden, daß diese kurzen DNA-Abschnitte aus der Nachbarschaft der früheren IS256-Insertionsstelle stammen, wobei sowohl stromaufwärts als auch stromabwärts liegende Nukleotidsequenzen nachgewiesen wurden. Neben diesen vollständigen IS256-Zirkeln wurden aber auch Moleküle gefunden, bei denen entweder das rechte oder das linke Ende von IS256 fehlten. Die Daten legen nahe, daß beide IS256-Enden an der Zirkelbildung teilnehmen können und im Unterschied zu anderen zirkelbildenden Insertionssequenzen, die Strangtransferreaktion während der Zirkularisierung mit geringer Spezifität verläuft. Ringförmige IS256-Moleküle konnten sowohl in S. epidermidis als auch in rekombinanten S. aureus und E. coli-Stämmen nachgewiesen werden, was auf eine untergeordnete Rolle speziesspezifischer Faktoren bei diesem Prozeß schließen läßt. Dagegen konnte durch die Einführung einer Mutation in das putative Transposasegen des Elementes gezeigt werden, daß dieses Genprodukt für die IS256-Zirkularisierung essentiell ist. Es ist zu vermuten, daß die Bildung zirkulärer IS256-Moleküle die Voraussetzung für die präzise Exzision des Elementes während der Phasenvariation der Biofilmproduktion bildet. Außerdem ist die Generierung stabiler Mutationen durch das Zurücklassen von Teilen der duplizierten Zielsequenz oder durch die Vermittlung kleinerer Deletionen während der Zirkelbildung vorstellbar. Darüber hinaus bilden die multiplen Kopien des Elementes im Genom Kreuzungspunkte für homologe Rekombinationsereignisse. IS256 stellt damit sehr wahrscheinlich einen wesentlichen Faktor für die Flexibilität des Genoms von S. epidermidis dar. Die detaillierte Aufklärung der molekularen Mechanismen, die die Transposition von IS256 beeinflussen, könnten daher wertvolle Einblicke in die genetischen Anpassungsstrategien dieses bedeutenden nosokomialen Pathogens geben.