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Untersuchungen zur 2H/1H- und 13C/12C-Isotopenfraktionierung bei der Biogenese von Aromastoffen
(2008)
Für die Authentizitätsbewertung achiraler Aromastoffe ist die gaschromatographische Isotopenverhältnismessung mittels massenspektrometrischer Analyse ein etabliertes Verfahren. Diese Technik ermöglicht es, über geeignete Datenbanken authentischer Referenzproben gesicherte Aussagen hinsichtlich deren Herkunft aus natürlicher oder synthetischer Quelle zu treffen. Zunehmend ins Interesse rückt allerdings auch die Frage, ob es mittels Techniken der Stabilisotopenanalytik ebenso möglich ist, das breite Feld der legislativ als „natürlich“ deklarierten Aromastoffe analytisch weiter in deren Herkunft aus biotechnologischer oder natürlicher („ex plant“) Quelle aufzutrennen. Zwar kann dieser Fragestellung prinzipiell über die Erweiterung bestehender Stabilisotopen-Datenbanken mit authentischen Proben nachgegangen werden, sie scheitert jedoch häufig an der limitierten Verfügbarkeit authentischer biotechnologischer Referenzen oder der eingeschränkten Kenntnis über die der Produktion „natürlicher“ Aromastoffe zugrundeliegenden Verfahrenstechniken. Eine mögliche Vorgehensweise zur Umgehung dieses Sachverhalts stellt daher die in Anlehnung an beschriebene biotechnologische Verfahren im Labormaßstab durchgeführte Produktion ausgewählter und somit auch authentischer Referenz-Aromastoffe dar. Diese Methode hat zudem den Vorteil, dass gegebenenfalls zusätzliche Informationen über mögliche Isotopenfraktionierungen in solchen Systemen ermittelt werden können, welche sich nicht nur zur Authentizitätsprüfung als nützlich erweisen können, sondern auch zur stetig wachsenden Grunderkenntnis über Isotopenfraktionierungen in biologischen Systemen beitragen. Ziel der vorliegenden Arbeit war es daher, der geschilderten Fragestellung bezüglich ausgewählter Aromastoffe aus den Gruppen der C6-Aldehyde und -Alkohole („Grünnoten“) sowie der Gärungsalkohole nachzugehen. Zu diesem Zweck erfolgten zum einen im Labormaßstab die biogenetische Bildung von C6-Aldehyden und -Alkoholen ausgehend von den ungesättigten Fettsäuren Linol- und Linolensäure, ferner wurden parallel Edukte, Intermediate und Produkte isoliert und hinsichtlich ihrer Stabilisotopengehalte durch Bestimmung der Delta-2H(V-SMOW)- und Delta-13C(V-PDB)-Werte untersucht. Zum anderen sind auf fermentativem Wege ausgehend von unterschiedlichen Kohlenhydratquellen die Gärungsalkohole 2-Phenylethanol und 2-Methyl-1-propanol dargestellt worden. Des weiteren galt es, die bei den Gärungsalkoholen resultierende Datenlage dahingehend zu prüfen, ob sich diese über eine Korrelation der Delta-2H(V-SMOW)- und Delta-13C(V-PDB)-Werte dazu eignet, eine Authentizitätsbewertung dieser Aromastoffe hinsichtlich natürlicher oder synthetischer Herkunft zu ermöglichen.
In der vorliegenden Arbeit werden instrumentell-analytische Studien zur enzymatischen und chemischen Bildung von 4-Hydroxy-2,5-dimethyl-3(2H)-furanon (HDMF) und 4-Hydroxy-5-methyl-3(2H)-furanon (HMF) – zwei wichtigen Aromakomponenten zahl-reicher Früchte und verarbeiteter Lebensmittel – vorgestellt. Die Studien demonstrieren erstmals die Bildung dieser Verbindungen aus Zuckerphosphaten unter physiologischen Reaktionsbedingungen. Ein Schwerpunkt der Arbeiten lag dabei auf der Bildung von HDMF aus D-Fructose-1,6-diphosphat (Fru-1,6-dP) durch den Hefestamm Zygosaccharomyces rouxii. Der Zusatz von 1-13C-Fru-1,6-dP bzw. 13C6-D-Glucose zum Nährmedium der Hefe Z. rouxii zeigte, dass ausschließlich exogen zugesetztes Fru-1,6-dP durch die Hefe zu HDMF transformiert wird. Untersuchungen, in denen der Einfluss verschiedener Wachstumsbedingungen auf die HDMF-Bildung durch Z. rouxii getestet wurde, zeigten bezüglich der HDMF-Bildung ein pH-Optimum bei pH 5.1 sowie eine maximale Produktivität der Zellen bei einer NaCl-Konzentration von 20%. Mittels einer neu entwickelten cKZE-Methode wurde für durch Z. rouxii gebildetes HDMF eine Enantiomerenanreicherung von 27%ee nachgewiesen, was eine enantioselektive Biosynthese durch Enzymsysteme der Hefe impliziert. Als Grundvoraussetzung für den Nachweis einer Enantiomerenanreicherung im HDMF-Molekül stellte sich ein schwach-saurer pH-Wert des wässrigen Mediums heraus. Dies konnte durch Ermittlung der Tautomerisierungsgeschwindigkeit des HDMF-Moleküls mittels 1H-NMR-Spektroskopie belegt werden. Anhand von HPLC-MS/MS-Analysen wurde die Bildung von HMF in zellfreien cytosolischen Rohproteinextrakte aus Z. rouxii, welche mit Fru-1,6-dP und Nicotinamidadenindinucleotiden (NAD, NADH, NADP, NADPH) inkubiert worden waren, nachgewiesen. In Substratstudien wurde HMF nach Applikation von Fru-1,6-dP, D-Fructose-6-phosphat, D-Glucose-6-phosphat, 6-Phosphogluconsäure, D-Ribose-5-phosphat (Rib-5-P) und D-Ribulose-1,5-diphosphat an cytosolische Proteinextrakte nachgewiesen. Die für die Transformationen der Hexosephosphate zu D-Ribulose-5-phosphat (Ribu-5-P) benötigten Enzyme Fructose-1,6-diphosphatase, Phosphohexose-Isomerase, Glucose-6-phosphat-Dehydrogenase und 6-Phosphogluconsäure-Dehydrogenase konnten mittels spezifischer Enzymassays in den cytosolischen Extrakten nachgewiesen werden. Gebildetes Ribu-5-P wird im Folgenden spontan in HMF umgelagert (> 1%). Die Inkubation von Phosphoribose-Isomerase mit Rib-5-P in Gegenwart von o-Phenylendiamin (o-PD) führte zur Bildung von 2-Methyl-3-(1,2-dihydroxyethyl)-quinoxalin, das anhand seiner UV-, MS- und NMR-Daten eindeutig identifiziert wurde. Daraus konnte die Bildung von 4,5-Dihydroxy-2,3-pentandion (DPD) in den Reaktionsansätzen abgeleitet werden, was durch die Synthese der entsprechenden deuterierten bzw. unmarkierten Alditolacetat-Derivate und anschließende HRGC-MS-Analyse abgesichert wurde. Durch Inkubation von 1-13C-Ribu-5-P bzw. 5-13C-Ribu-5-P mit o-PD und HPLC-MS/MS-Analyse der entstandenen Quinoxalinderivate konnte gezeigt werden, dass die Methylgruppe des DPD-Moleküls infolge einer nicht-enzymatischen Phosphat-Eliminierung gebildet wird. Nach Applikation von o-PD an reife Tomaten wurde mittels HPLC-MS/MS ebenfalls 2-Methyl-3-(1,2-dihydroxyethyl)-quinoxalin detektiert. Dieses Ergebnis impliziert ein genuines Vorkommen von DPD in Tomaten, in deren Aromaextrakten auch HMF nachgewiesen wurde. Somit ist in natürlichen Systemen ebenfalls von einer HMF-Bildung über diese Zwischenverbindung auszugehen. Anhand von HPLC-UV-MS/MS-Analysen wurde eine selektive Bildung von HDMF aus Fru-1,6-dP in Gegenwart von NADH unter milden Reaktionsbedingungen nachgewiesen. Durch Inkubation von 1-13C-Fru-1,6-dP mit [4R,S-2H2]-NADH und anschließender HRGC-MS-Analyse des gebildeten isotopen-markierten HDMF konnte gezeigt werden, dass HDMF infolge eines nicht-enzymatischen Hydrid-Transfers von NADH auf eine aus Fru-1,6-dP abgeleitete Zwischenverbindung gebildet wird. Das Hydrid-Ion wird hierbei selektiv auf C-5 oder C-6 des Kohlenhydratgrundgerüstes des Zuckerphosphates übertragen. Der Zusatz von o-PD und Fru-1,6-dP zum Z. rouxii-Nährmedium und anschließende HPLC-DAD-Analyse führte zur Detektion von drei Quinoxalinderivaten. Diese wurden anhand ihrer MS/MS-Daten und NMR-Spektren als phosphorylierte Quinoxalinderivate identifiziert, aus denen sich die Bildung von 2-Hexosulose-6-phosphat, 1-Deoxy-2,3-hexodiulose-6-phosphat und 1,4-Dideoxy-2,3-hexodiulose-6-phosphat in den Nährmedien ableiten ließ. Somit gelang erstmals der Beweis der Bildung von 1-Deoxy-2,3-hexodiulose-6-phosphat im Nährmedium, einem vielfach postulierten, aber bislang nicht nachgewiesenen Intermediat der HDMF-Bildung aus Fru-1,6-dP. Aufgrund der enantioselektiven Bildung von HDMF durch die Hefen wird daher bei der HDMF-Biosynthese durch Z. rouxii von einer Kombination aus nicht-enzymatischen Reaktionsschritten und einer durch Oxidoreduktasen der Hefezellen vermittelten Reduktion ausgegangen.