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Die Methodik und Technik der Gaswechselmessung von Pflanzen wurde für den Modellorganismus Arabidopsis thaliana optimiert und für Untersuchungen zur Beteiligung des Aquaporins PIP1b an Wassertransportvorgängen während der Stomaöffnung verwendet. Die Messungen der Transpirationsraten von PIP1b-Antisense-Pflanzen ergaben keine Hinweise auf Veränderungen des zeitlichen Verlaufs der Stomaöffnung. Die Wasserpermeabilitäten von Schließzell-Plasmamembranen scheinen somit nicht von der Expression des Aquaporins PIP1b beeinflußt zu sein. - Gaswechselmessungen an Nicotiana tabacum NtAQP1-Antisense-Pflanzen zeigten eine Verringerung der Transpirationsraten im Licht und eine geringere Grundtranspiration im Dunkeln. Dies deutet auf eine Beteiligung von NtAQP1 am Wassertransport hin. - Ausgewählte Arabidopsis thaliana-Mutanten wurden hinsichtlich ihrer stomatären Antwort auf Rot- und Rot-/Blaulicht-Bestrahlung analysiert. Hierfür wurde ein Doppelbestrahlungs-Protokoll entwickelt. Vergleiche mit den Wildtypen ergaben signifikante Unterschiede bei der Phytochrom-Mutante phyA-103, der Abscisinsäure-Mutante aba3-2 und der Auxin-resistenten Mutante axr1-3. Ferner zeigte die Mutante npq1-2 nicht die beschriebene Abweichung der stomatären Antwort auf Blaulicht. - Die Expressionsmuster eines PIP1b-GFP-Reportergens in transgenen Arabidopsis thaliana-Pflanzen wurden analysiert. Hohe Promotor-Aktivitäten konnten in meristematischen Bereichen von Wurzel und Sproß, in Elementen der Leitbündel, in jungen Kotyledonen und in Staubblättern beobachtet werden. Es zeigte sich eine enge Korrelation zwischen PIP1b-Promotoraktivität und Streckungswachstum. - Eine Sequenzanalyse des NtAQP1-Promotors ergab Übereinstimmungen mit spezifischen Bindungsmotiven von MYB-ähnlichen Transkriptionsfaktoren. Mit Promotor-Reportergenen konnte die Beteiligung eines dieser Sequenzmotive an der GA- und ABA-induzierten Aktivierung des NtAQP1-Promotors gezeigt werden. Zur Analyse der Phytohormon-Wirkungen auf deletierte Promotorbereiche wurde ein duales Vektorsystem entwickelt und bei der transienten Transformation von BY2-Protoplasten eingesetzt. - Die Expression eines GFP::NtAQP1-Fusionsgens in BY2-Zellen zeigte die subzelluläre Lokalisation des Aquaporins in der Zytoplasmamembran. Ferner wurde Fusionsprotein in Vesikel-ähnlichen Strukturen beobachtet.
Ein Weg, der von Rezeptor-Tyrosin-Kinasen benutzt wird um Signale auf "downstream" gelegene Effektormoleküle zu übertragen, erfolgt über Adaptorproteine, die Bindungsstellen für verschiedene Proteine zur Verfügung stellen. Das daughter of sevenless (dos) Gen wurde in einem Screen nach Downstream-Komponenten der Sevenless (Sev) Rezeptor-Tyrosin-Kinase gefunden. Dos besitzt eine N-terminale PH-Domäne und mehrere Tyrosinreste in Konsensussequenzen für SH2-Domänen Bindungsstellen von verschiedenen Proteinen. Die strukturellen Merkmale von Dos und Experimente, die zeigten, daß Tyrosine im Dos Protein nach der Aktivierung von Sev phosphoryliert werden, legen den Schluß nahe, daß Dos zur Familie der Multi-Adaptor-Proteine gehört. Zu dieser Familie werden die Insulin-Rezeptor-Substrat (IRS) Proteine, Gab1 und Gab2 gerechnet. In dieser Arbeit wurde ein monoklonaler Maus anti-Dos Antikörper etabliert. Das Epitop dieses Antikörpers liegt im Bereich der C-terminalen 416 Aminosäuren des Dos Proteins. Mittels Westernblot Analysen wurde für Dos ein Molekulargewicht von 115 kD ermittelt. Antikörperfärbungen von wildtypischen Augenimaginalscheiben dritter Larven zeigten, daß das Dos Protein in Zellen in und posterior der morphogenetischen Furche exprimiert wird und in diesen Zellen apikal lokalisiert ist. Zur Charakterisierung des homozygot letalen dosR31 Allels, wurde der genomische Bereich sequenziert und die erhaltenen Daten mit der cDNA Sequenz verglichen. Die so etablierte Aminosäuresequenz für das DosR31 Protein hat sechs Aminosäuresubstitutionen, die möglicherweise die Tertiärstruktur beeinflussen. Zusätzlich wurde ein Stopcodon in Position 463 der Aminosäuresequenz gefunden. Bei dosR31 handelt es sich um ein "loss of function" Allel, das nicht in der Lage ist, die normale Dos Funktion zu erfüllen. Um die funktionelle Rolle der potentiellen SH2-Domänen Bindungsstellen für die Dos Funktion in der Rezeptor-Tyrosin-Kinasen vermittelten Signaltransduktion zu untersuchen, wurden mutierte dos Transgene in Fliegen exprimiert. Die potentiellen Bindungsstellen für die SH2-Domänen des SH2/SH3 Adaptorproteins Shc, der PhospholipaseC-g (PLCg), der regulatorische Untereinheit der Phosphatidylinositol-3-Kinase (PI3Kinase) und der Corkscrew (Csw) Tyrosin Phosphatase wurden durch den Austausch des für die Bindung wichtigen Tyrosins gegen ein Phenylalanin mutiert. Die ektopische Expression der mutierten Konstrukte ohne Bindungsstellen für die Shc, PLCg und PI3Kinasen SH2-Domänen konnte in Abwesenheit von endogenem Dos die fehlende Dos Funktion während der Entwicklung vollständig ersetzen. Im Gegensatz dazu ist das Tyrosin 801 als nachgewiesene Bindungsstelle für Csw SH2-Domänen essentiell für die Funktion von Dos. Ektopische Expression von Transgene durch Hitzeschock kann zu phänotypischen Effekten führen, die nicht auf das Transgen zurückzuführen sind. Um dieses Problem zu umgehen wurde das endogene dos Enhancer/Promotor Element kloniert, damit die Funktion von mutierten Transgenen auch im endogenen Expressionsmuster untersucht werden konnte. Das klonierte genE-dos Minigen war in der Lage, den Verlust von endogenem Dos in dosR31 und dosP115 Tieren vollständig zu ersetzen und zeigte eine völlig wildtypische Expression in Augenimaginalscheiben. Zur Untersuchung, welche Rolle die mutierten SH2-Domänen Bindungsstellen bei der Dos Funktion in der Augenentwicklung spielen, wurde ein neues in vivo Testsystem basierend auf der Flp/FRT Flipase Rekombinase Technik etabliert. Dieses klonale Testsystem erlaubt die Expression mutierter Transgene unter der Kontrolle der dos Enhancer/Promotor Sequenzen in Klonen von Zellen, denen die endogene Dos Funktion fehlt. Die klonale Analyse der mutierten Konstrukte konnte zeigen, daß das Tyrosin 801, als Bindungsstelle für eine Csw SH2-Domäne, eine essentielle Rolle für die Dos Funktion spielt. Die Tyrosinreste in den potentiellen SH2-Domänen Bindungsstellen für Shc, PLCg und PI3Kinase spielen hingegen keine essentielle Rolle für die Dos Funktion bei der Augenentwicklung. Das etablierte klonale Testsystem kann allgemein zur Untersuchung der in vivo Funktion von potentiellen Protein-Protein Interaktionsregionen im Dos Protein bei der Augenentwicklung eingesetzt werden unabhängig von deren Erfordernis für andere Entwicklungsprozesse.
Nach Aktivierung differenzieren B-Zellen entweder direkt zu IgM sezernierenden Plasmazellen oder treten in den Differenzierungsweg zur Gedächtniszelle ein, der sowohl durch die Affinitätsreifung als auch den Klassensprung zu sekundären Immunglobulin-Isotypen gekennzeichnet ist. Welchen Weg die B-Zelle durchläuft, ist abhängig von der Intensität und der Dauer des BZR-Signals, von der Verfügbarkeit und der Art der T-Zell-Hilfe und von weiteren Signalen in der speziellen Mikroumgebung des Keimzentrums. Der Transkriptionsfaktor Blimp-1 ("B lymphocyte induced maturation protein 1") wird als ein „Mastergen“ der terminalen B-Zell-Differenzierung betrachtet und ist in der Lage, die komplexen Differenzierungsprozesse zu Ig-sezernierenden Plasmazellen auszulösen und voranzutreiben. Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit identifizieren Blimp-1 als wichtigen Regulator, der bestimmt, ob eine B-Zelle zur Plasmazelle oder zur Gedächtniszelle differenziert. Unter Verwendung ruhender, primärer B-Zellen der Maus, die in vitro mit Interleukin-4 (IL-4), anti-mF(ab´)2 oder anti-CD40 in verschiedenen Kombinationen sowohl in An- als auch in Abwesenheit von LPS stimuliert wurden, konnte in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, dass die IgM-Sekretion und die Expression von Blimp-1 durch Signalgebung über den BZR oder CD40 und durch IL-4 entweder nicht induziert oder sogar unterdrückt wird. Die Zugabe von IL-2 und IL-5 induziert die Expression von Blimp-1 und erleichtert die Sekretion von IgM und IgG1 in diesem System. Gleiches kann durch direkte Transduktion der B-Zellen mit rekombinanten Retroviren erreicht werden, die für Blimp-1 codieren. Auf der anderen Seite wird der durch IL-4 induzierte Klassensprung nach IgG1 durch Blimp-1 gehemmt. Blimp-1 bewirkt daher ein Umschalten des B-Zell-Differenzierungsweges von der Gedächtniszelle zur Plasmazelle. Die Unterdrückung der Expression von Blimp-1 sowohl durch Antigen-BZR-Wechselwirkungen als auch durch die von T-Helferzellen abhängige Signalgebung über CD40 und IL-4 unterdrückt die terminale Differenzierung zur Plasmazelle und ist für den Eintritt und das Durchlaufen des Gedächtniszell-Differenzierungsweges notwendig. Zur Identifikation von Genen, deren Expression durch Blimp-1 direkt oder indirekt beeinflusst wird, wurde Blimp-1 in WEHI 231 B-Lymphomzellen unter Verwendung rekombinanter Retroviren überexprimiert. Messika et al. zeigten, dass die Überexpression von Blimp-1 in B-Lymphomzellen in Abhängigkeit vom Reifungsstadium der Zelle entweder einen Wachstumsnachteil, gefolgt vom Zelltod, induziert oder zur terminalen Differenzierung führt. Obwohl WEHI 231 Zellen unreife, d.h. sIgM+ B-Zellen repräsentieren, exprimieren Blimp-1 transduzierte WEHI 231 Zellen die J-Kette, zeigen eine erhöhte Konzentration der für die sekretorische Form der my-Kette codierenden mRNA, exprimieren den Plasmazellmarker Syndecan-1 auf ihrer Oberfläche und sezernieren für kurze Zeit IgM. Diese Differenzierungsprozesse gehen allerdings mit einem Wachstumsnachteil und Zellzyklus-Arrest, gefolgt vom Zelltod, einher. Blimp-1 exprimierende WEHI 231 Zellen zeigen somit den Phänotyp kurzlebiger Plasmazellen. Eine Langzeitkultur Blimp-1+ WEHI 231 Zellen führt zum Verlust des differenzierten Phänotyps, d.h der Erhalt IgM-sezernierender WEHI 231 Zellen ist nicht ohne weitere Maßnahmen möglich. Auf molekularer Ebene hemmt Blimp-1 die Expression von c-myc und diejenige des antiapoptotischen Bcl-2 Familienmitgliedes A1, stimuliert aber die Expression von mad4. Die Verschiebung des Verhältnisses von Myc/Max- zu Mad/Max-Heterodimeren zugunsten von Mad/Max-Komplexen und die daraus resultierende Inhibition der Transkription von Myc-abhängigen, proiliferationsfördernden Genen ist in vielen Systemen als von zentraler Bedeutung für die Initiation von Differenzierungsprozessen beschrieben und wurde auch bereits für B-Zellen diskutiert. Auch in primären B-Zellen führt Blimp-1 zu einer verstärkten Expression von mad4. Wird der durch Blimp-1 bewirkte Verlust der Expression von A1 durch dessen Überexpression in Blimp-1+ WEHI 231 Zellen kompensiert, so überleben diese Zellen wieder erheblich länger, bleiben aber weiterhin im Zellzyklus arretiert. Der differenzierte Phänotyp, charakterisiert durch die verstärkte Expression von mad4 und der Sekretion von IgM, wird dabei aufrechterhalten. Wachstumsnachteil und Zelltod können in diesem System daher entkoppelt werden. In primären Zellen führt Blimp-1 ebenfalls zur Erniedrigung der A1 Expression. Da diese Zellen aber nicht in dem Maße wie WEHI 231 Zellen absterben, kann der Verlust von A1 offensichtlich besser kompensiert werden. Die Lebensdauer einer Blimp-1+ Plasmazelle ist somit durch Manipulation der Expression von antiapoptotischen Molekülen wie A1 verlängerbar.
Der opportunistisch humanpathogene Hefepilz Candida albicans gehört bei vielen gesunden Menschen zur mikrobiellen Schleimhautflora, kann jedoch bei abwehrgeschwächten Patienten oberflächliche Infektionen sowie auch lebensbedrohliche tiefe Organmykosen verursachen. Obwohl der Immunstatus des Wirtes für eine Infektion mit diesem Erreger von entscheidender Bedeutung ist, tragen vermutlich auch eine Reihe von Virulenzfaktoren zur Pathogenität von C. albicans bei, indem sie Besiedlung, Ausbreitung und Vermehrung der Pilzzellen unter Anpassung an die verschiedensten Wirtsnischen unterstützen. Eine für die Pathogenität von C. albicans wichtige Eigenschaft ist die Bildung sekretorischer Aspartylproteasen (SAPs), die durch eine große Familie homologer Gene codiert werden. Es wird angenommen, dass die individuellen Proteasen während der Infektion verschiedene Aufgaben erfüllen bzw. optimal an unterschiedliche Wirtsnischen angepaßt sind. Jedoch ist der Beitrag der einzelnen SAP-Gene zur Pathogenese noch weitgehend unverstanden. Da die wirtsinduzierte Aktivierung dieser Virulenzgene während bestimmter Infektionsstadien Hinweise auf ihre spezifische pathogenetische Bedeutung liefern könnte, wurde in dieser Arbeit eine Methode für C. albicans entwickelt, mit der die Induktion eines Gens während der Infektion nachgewiesen werden kann. Die Methode beruht auf einer genetischen Rekombination als Reporter einer Genexpression, was bedeutet, dass nach Induktion des zu untersuchenden Gens eine site-spezifische Rekombinase spezifisch einen Mykophenolsäure-Resistenzmarker aus dem Genom der Zelle entfernt. Da diese Deletion ein irreversibles Ereignis darstellt, das auf die jeweiligen Nachkommen vererbt wird, kann selbst eine vorübergehende Genaktivierung während eines bestimmten Infektionsstadiums bzw. in einem bestimmten Organ in einzelnen Zellen nach deren Reisolierung aus infiziertem Gewebe durch Ausplattieren auf geeignetem Indikatormedium nachgewiesen werden. Durch Analyse der Expression des SAP2-Gens wurde bestätigt, dass mit diesem Reportersystem eine biologisch signifikante Genaktivierung in C. albicans nachgewiesen werden kann. SAP2 wird in C. albicans in vitro in einem Medium induziert, das Rinderserumalbumin als alleinige Stickstoffquelle enthält, ist in anderen gängigen Labormedien jedoch reprimiert. Diese in vivo-Expressionstechnologie (IVET) wurde verwendet, um die Expression von sechs verschiedenen SAP-Genen von C. albicans, SAP1-SAP6, in unterschiedlichen Tiermodellen zu studieren. Dabei konnte gezeigt werden, dass die einzelnen Proteasegene abhängig von der Art der Infektion, d.h. lokal begrenzte Schleimhautinfektion bzw. Systeminfektion, und auch vom Infektionsstadium differentiell reguliert werden. Dabei wurden sogar die äußerst homologen Gene SAP4-SAP6, die aufgrund von in vitro erzielten Ergebnissen als hyphenspezifische Gene galten, in vivo unterschiedlich reguliert. SAP5 und SAP6, aber nicht die anderen SAP-Gene, wurden in einem Maus-Ösophagus-Schleimhautmodell signifikant aktiviert, als die C. albicans-Hyphen in das Epithel invadierten. Eine stadienspezifische Expression der SAP-Gene wurde in einem Maus-Peritonitis-Modell beobachtet. Kurz nach Inokulation der C. albicans-Hefezellen in die Bauchhöhle der Tiere, zu einem Zeitpunkt, als noch keine Ausbildung von Hyphen zu beobachten war, wurde SAP5, aber nicht SAP6 oder eines der anderen analysierten SAP-Gene in einem signifikanten Anteil der infizierenden Zellen aktiviert. Demzufolge scheint SAP5 für die Gewebeinvasion während der Schleimhautinfektion und auch für die ersten Schritte während einer disseminierenden Infektion von Bedeutung zu sein. Durch die intravenöse Infektion der Maus, bei der frühe Infektionsschritte umgangen werden, wurde gezeigt, dass SAP5 und SAP6, aber auch SAP4, während der späteren Stadien einer disseminierenden Infektion weiterhin aktiviert werden. Dagegen wurde eine Induktion des SAP2-Gens vorwiegend im Spätstadium einer systemischen Infektion beobachtet, nachdem die Pilzzellen innere Organe befallen hatten. Daher fördert SAP2 vermutlich weniger die Invasion von Geweben, dafür aber die Vermehrung der Pilze nach Organbefall, möglicherweise durch die Bereitstellung von Nährstoffen. Dabei wurde gezeigt, dass die in vivo-Regulation von SAP2 durch bestimmte Repeatstrukturen innerhalb der Promotorregion dieses Gens beeinflußt wird. Während des Verlaufs einer systemischen Infektion wurden sogar die zwei SAP2-Allele des hier untersuchten C. albicans-Modellstammes CAI4, die sich in dieser Repeatregion unterscheiden, differentiell reguliert. Das SAP2-2-Allel wurde nämlich bereits deutlich früher induziert als das Allel SAP2-1. Eine Expression von SAP1 und SAP3 konnte im Gegensatz zu den anderen SAP-Genen nur in wenigen der infizierenden Zellen nachgewiesen werden, so dass diesen Genen ein Beitrag zur Pathogenität in den hier untersuchten Infektionsmodellen nicht beigemessen werden kann. Im Verlauf einer Infektion setzt C. albicans vermutlich viele verschiedene Virulenzfaktoren gleichzeitig für eine bestmögliche Anpassung an die jeweilige Wirtsnische ein. Ob in Abhängigkeit entsprechender Wirtssignale dabei unterschiedliche Eigenschaften der Pilzzelle koordiniert reguliert werden, ist kaum erforscht, erscheint jedoch für ein besseres Verständnis der Erreger-Wirts-Auseinandersetzung von besonderem Interesse. An der Kontrolle der Hyphenbildung von C. albicans sind wenigstens zwei Signaltransduktionskaskaden beteiligt, eine MAP-Kinase-Kaskade und ein cAMP-abhängiger Signalweg, die in den Transkriptionsregulatoren CPH1 bzw. EFG1 enden. Nachdem dimorphes Wachstum für die Infektion von Bedeutung ist und die Expression der Gene SAP4-SAP6 in vitro mit der Hyphenwachstumsphase verbunden ist, wurde eine mögliche Abhängigkeit hyphenassoziierter SAP-Aktivierung von diesen Regulatoren durch die Analyse der SAP5-Expression in entsprechenden Mutanten analysiert. Sowohl in cph1- als auch in efg1-Einzelmutanten wurde eine reduzierte Aktivierung des SAP5-Gens in vivo beobachtet. Dadurch konnte gezeigt werden, dass sowohl CPH1 als auch EFG1 zur SAP5-Aktivierung während der Infektion beitragen. Da cph1-Mutanten im infizierten Gewebe wie der Wildtyp-Stamm Hyphen ausbildeten, war die Hyphenbildung allein offensichtlich nicht für eine volle SAP5-Aktivierung in vivo ausreichend. Andererseits war die SAP5-Induktion in vivo nicht von der Hyphenwachstumsphase abhängig, da eine verminderte, aber dennoch signifikante SAP5-Expression auch in den efg1-Mutanten zu beobachten war, die in den infizierten Tieren nur in der Hefephase wuchsen. In Zellen, in denen beide Regulatoren fehlten, konnte eine Induktion von SAP5 kaum nachgewiesen werden. Das bedeutet, dass diese Signalwege in C. albicans für die Kontrolle verschiedener zellulärer Programme während der Infektion wichtig sind und die Expression von unterschiedlichen Virulenzgenen koordinieren. Durch die in vivo-Analyse der Virulenzgenexpression in C. albicans konnten Einblicke in regulatorische Anpassungsmechanismen dieses Mikroorganismus an verschiedene Wirtsnischen gewonnen werden. Einzelne Mitglieder einer Virulenzgenfamilie dieses Pilzes werden während der Infektion differentiell und in Abhängigkeit vom Infektionsstadium reguliert und tragen daher vermutlich sehr spezifisch zur Pathogenese bei. Unterschiedliche Virulenzmerkmale können zudem während der Infektion koordiniert reguliert werden und dadurch gemeinsam die Anpassungsfähigkeit von C. albicans an den Wirt unterstützen. Die erzielten Erkenntnisse sollten letztlich dazu beitragen, die Pathogenität dieses wichtigen opportunistisch humanpathogenen Erregers besser verstehen zu können.
Enterokokken gelten primär als opportunistische Erreger mit geringer Pathopotenz. Sie zeichnen sich allerdings durch ausgeprägte natürliche und erworbene Resistenzen gegen eine Vielzahl von Antibiotika aus. Besorgniserregend ist hierbei insbesondere das Auftreten von Vancomycin-resistenten Enterokokken. Glycopeptidantibiotika, wie Vancomycin und Teicoplanin, werden als Reserveantibiotika gegen multiresistente gram-positive Erreger, wie zum Beispiel Methicillin-resistente Staphylococcus aureus-Stämme (MRSA) eingesetzt. Der VanA-Typ der Glycopeptidresistenz, welcher zuerst in Enterococcus faecium beschrieben wurde, ist die in Zentraleuropa vorherrschende Variante der Glycopeptidresistenz. Das Transposon Tn1546, das die vanA-Resistenzdeterminante kodiert, liegt häufig auf großen konjugativen Plasmiden vor und kann zwischen Enterokokken-Stämmen transferiert werden. In dieser Arbeit wurde der direkte Einfluss von Vancomycin und eines weiteren Antibiotikums, Flavophospholipol (FPL), auf die Rate des konjugativen Transfers des vanA-Operons in E. faecium untersucht. Das Phosphoglycolipidantibiotikum FPL wird derzeit als Leistungsförderer in der Tiermast eingesetzt. Beide Antibiotika induzieren die Expression der Glycopeptidresistenz vom VanA-Typ. Es konnte gezeigt werden, dass Flavophospholipol in unterschiedlichen Konzentrationen die Häufigkeit des Transfers von konjugativen VanA-Plasmiden sowohl in klinischen E. faecium-Isolaten, als auch in E. faecium-Stämmen aus Tierfaeces signifikant hemmte. Vancomycin zeigte keinen signifikanten Effekt auf die Transferrate der VanA-Plasmide. Somit konnte nachgewiesen werden, dass in E. faecium kein funktionaler Zusammenhang zwischen der Induktion des vanA-Operons durch Vancomycin und FPL und der Transferfrequenz der konjugativen VanA-Plasmide unter dem Einfluss der beiden Antibiotika besteht. Weiterhin wurde die Induktion des vanA-Operons unter dem Einfluss verschiedener Antibiotika in einem E. faecium-Isolat näher untersucht. Hierbei wurde die Expression des 39 kDa VanA-Ligase Proteins direkt durch das Western Blot-Verfahren dargestellt. Eine Induktion der Expression des VanA-Ligase Proteins erfolgte durch Inhibitoren der späten Phase der Zellwandsynthese, wie Vancomycin, Flavophospholipol, Bacitracin und Tunicamycin. Außerdem konnte eine leichte Induktion des VanA-Ligase Proteins durch Fosfomycin, Cefalexin und Cefuroxim, Meropenem und Clindamycin nachgewiesen werden. Somit konnte gezeigt werden, dass Cefuroxim und Clindamycin zwei Antibiotika, die in klinischen Studien eine Besiedelung mit VRE begünstigen, auch eine geringe Zunahme der VanA-Ligase Expression bewirken. Zudem wurde deutlich, dass durch den Einfluss von Hitzestress und osmotischem Stress keine Induktion der 39 kDa VanA-Ligase Bande erfolgt. Ein weiteres Ziel dieser Arbeit war die Identifizierung einer putativen Resistenz-determinante gegen Flavophospholipol. Die Eigenschaft der FPL-Resistenz konnte nicht durch in vitro-Filterkonjugation von FPL-resistenten auf FPL-sensitive E. faecium-Stämme übertragen werden. Zur molekularen Untersuchung der Resistenz gegen Flavophospholipol wurde ein resistenter E. faecium-Stamm durch das konjugative Transposon Tn916 mutagenisiert. In allen identifizierten FPL-sensitiven Mutanten war die Insertionstelle des Transposons und dessen Orientierung im Chromosom identisch und es deletierte ein 1,5 kb großer genomischer Bereich „downstream“ der Transposon-Insertionsstelle. Dieser Bereich umfasste das 3´-Endes des Gens für eine putative Threonyl-tRNA Synthetase und den Genlocus für einen putativen Transkriptionsregulator. Die Sequenzen in allen Mutanten begannen ca. 200 bp vor dem Startcodon eines Gens für ein putatives Penicillin-Bindeprotein (PBP). In Northern Blot-Analysen konnte gezeigt werden, dass die Transkription des putativen PBP in der Mutante 64/3-1 schwächer war als im Wildtyp 64/3. Außerdem wurden durch 3H Penicillin-Markierung von PBP-Extrakten Unterschiede im Expressionsmuster der Penicillin-Bindeproteine im Wildtyp und in der Mutante deutlich. Während im Wildtyp fünf Penicillin-Bindeproteine zu erkennen waren, fehlten PBP2 und PBP3 in der Mutante 64/3-1. Die Größe von PBP3 entsprach hierbei der geschätzten Größe des putativen PBP von 79 kDa. In der Mutante 64/3-1 fand wahrscheinlich durch den Verlust eines putativen Regulators oder wichtiger regulatorischer Bereiche eine Veränderung im Expressionsmuster der Penicillin-Bindeproteine statt, welche zum FPL-sensitiven Phänotyp führte. In dieser Arbeit konnte zudem gezeigt werden, dass Flavophospholipol in E. faecium an PBP2 und PBP3 bindet und es sich hierbei um bifunktionale „high molecular weight“ Penicillin-Bindeproteine mit Transglycosylase- und Transpeptidase-Untereinheit handeln muss.
Helicobacter pylori ist ein an seine ökologische Nische hochgradig angepasstes Bakterium, das den Magen von mehr als 50% der Weltbevölkerung chronisch besiedelt. Bei 10 bis 20% der Infizierten können schwerere Krankheitsverläufe von Magengeschwüren bis hin zu Karzinomen auftreten. Die Chemotaxis-gesteuerte Motilität von H. pylori, vermittelt durch ein Bündel von 2-8 polaren Flagellen, ist für die Besiedelung und persistente Infektion des Wirtes essenziell. Mehr als 40 Komponenten des Flagellen- und Chemotaxissystems konnten mit Hilfe der beiden sequenzierten H. pylori-Genome identifiziert werden, wobei die Gene einzeln oder in kleinen transkriptionellen Einheiten über das gesamte Genom verteilt angeordnet sind. Mit der vorliegenden Arbeit sollte die Organisation und Vernetzung der transkriptionellen Regulation der Flagellenbiogenese und mögliche Querverbindungen zu anderen zellulären Funktionen in H. pylori umfassend charakterisiert werden. H. pylori verfügt über zwei unterschiedliche Flagellingene, flaA und flaB, deren Transkription von den beiden alternativen Sigma-Faktoren Sigma28 und Sigma54 kontrolliert wird. Um die transkriptionelle Regulation der beiden Gene in zwei unterschiedlichen Flagellenregulons zu untersuchen, wurde die Genexpression von flaA und flaB abhängig von der Wachstumsphase analysiert. Mit flaA- und flaB-Promotorfusionen wurde hier erstmalig ein sensitives, Biolumineszenz-basiertes Reportersystem für Expressionsstudien in H. pylori etabliert und genutzt. Die Transkriptmengen der beiden Flagellingene wurden weiterhin direkt mittels Northern Blot-Hybridisierungen und RT-PCR bestätigt. Es ergab sich eine Wachstumsphasen-abhängige, differentielle Regulation, bei der in Übereinstimmung mit der strukturellen Anordnung der Flagelline im Filament und der Zugehörigkeit der Gene zu zwei Regulationsklassen, das Verhältnis der flaA- zur flaB-Expression im Verlauf der Wachstumskurve stark anstieg. Um genomweite Analysen durchführen zu können, wurde in dieser Arbeit zunächst eine Plattform zur Untersuchung von H. pylori mit DNA-Microarrays etabliert. Hierzu wurde in Kooperation mit dem Max-Planck-Institut für Infektionsbiologie in Berlin ein PCR-Produkt-Microarray mit 1590 H. pylori-spezifischen Sonden produziert. Zusätzlich wurde ein industriell gefertigter, Oligonukleotid-basierter, H. pylori-Microarray erstmalig verwendet und validiert. Mit Hilfe der Microarray- Technologie wurden verschiedene zentrale Regulatoren der H. pylori-Flagellenbiogenese zum ersten Mal auf genomweiter Ebene untersucht. Hierzu zählten die beiden alternativen Sigma-Faktoren FliA und RpoN, der Anti-Sigma28-Faktor FlgM, das RpoN-spezifische Zwei-Komponenten System FlgS/FlgR und die Flagellen-Basalkörperkomponenten FlhA und FlhF. Bis auf die fliA- und flgM-Mutanten, die, in Übereinstimmung mit ihrer antagonistischen Funktion, Stummelflagellen bzw. eine leicht erhöhte Flagellenzahl aufwiesen, bewirkten die Mutationen in allen anderen untersuchten Genen einen flagellenlosen unbeweglichen Phänotyp. Die Klassen 2 und 3 des H. pylori-Flagellenregulons konnten durch die Analysen des FliA- und des RpoNRegulons neu definiert und um zehn neue Gene ergänzt werden. Für FlhA und FlhF konnte eine Funktion als übergeordnete Regulatoren der Klassen 2 und 3 des Flagellenregulons gezeigt werden. Des Weiteren wurden 24 Gene einer neuen regulatorischen Zwischenklasse zugeordnet. Diese Gene werden von mehr als einem Promotor kontrolliert und umfassen Flagellen- sowie Nicht-Flagellengene. Durch globale Untersuchungen von Doppelmutanten wurde die komplexe Einbindung des Anti-Sigma-Faktors FlgM in die FlhA- und FlhF-vermittelte transkriptionelle Rückkopplung nachgewiesen. Basierend auf den Ergebnissen der Arbeit konnte ein neues Modell der Regulation der Flagellenbiogenese für H. pylori entwickelt werden. Es beinhaltet drei regulatorische Genklassen mit einer intermediären Klasse, die von den drei H. pylori-Sigma-Faktoren Sigma80, Sigma54 und Sigma28 zusammen mit den assoziierten Regulatoren FlgS/FlgR und FlgM kontrolliert werden. FlgM vermittelt als Anti-Sigma28-Faktor die transkriptionelle Rückkopplung auf die Klasse 3- und, im Zusammenspiel mit FlhA, auch auf die Klasse 2-Flagellengene. FlhF kontrolliert die Expression der Klasse 2-Flagellengene durch einen FlgM-unabhängigen, bislang ungeklärten Mechanismus. Die Sigma80-abhängigen Klasse 1-Flagellengene werden, anders als bei vielen anderen Bakterien, mit Stoffwechselgenen koreguliert und beinhalten auch die Flagellenmotor- und Chemotaxisgene. Dies spiegelt die Anpassung von H. pylori an seine spezifische ökologische Nische wieder, mit der Notwendigkeit, während der gesamten Infektion die Motilität aufrecht zu erhalten.
Analyse polymorpher Sequenzbereiche des Promotors des Humanen Cystein-Reichen Proteins 61 (hCYR61/CCN1) Ziel ist es den Promotor des Wachstumsfaktor und 1,25-Dihydroxy Vitamin D3 regulierten immediate early Genproduktes von Osteoblasten und Signalmolekül im Mikroenvironment des Knochens, hCYR61/CCN1, funktionell zu charakterisieren. Zum ersten sollten 4 unterschiedliche hCYR61/CCN1 Promotorkonstrukte, mit den Längen von 200bp-1000bp auf ihre Promotoraktivität getestet werden, um so eine Vorstellung der Regulationsmechanismen des hCYR61/CCN1 Promotors zu gewinnen. Die andere Fragestellung befasste sich mit der Relevanz eines CA-Repeat Polymorphismus innerhalb des hCYR61/CCN1 Promotors, der anhand einer Gesundenpopulation nachgewiesen worden war. Das Interesse war hierbei, ob unterschiedliche CA-Repeat Längen in einem hCYR61/CCN1 Promotorkonstrukt von 450bp Länge auch unterschiedliche Promotoraktivitäten erzeugen. Die hCYR61/CCN1 Promotorkonstrukte der Länge 200bp-1000bp wurden mittels PCR eines Templates (J23219 aus einer Lambda Phagendatenbank) hergestellt. Die Länge und die Sequenz der Promotorkonstrukte überprüften wir durch Sequenzierung und Fragmentanalysen. Ausgewählte hCYR61/CCN1 Promotorkonstrukte wurden daraufhin in ein Luziferase-Vektor-System kloniert. Die entstandenen hCYR61/CCN1 Promotor-Vektorkonstrukte wurden in zwei Zellsyteme, h-fob Zellen (humane Osteoblaten) und T/C28a2 Zellen (humane Chondrozyten) durch Elektroporation transfiziert. Die Zellen wurden über 48h kultiviert, geerntet und die Promotoraktivität in einem Luminometer in Fluoreszenz Units (FU) gemessen. Es wurden zwei verschiedene Kultivierungsbedingungen der beiden Zelllinien geprüft, nämlich eine serumfreie und eine serumhaltige, um einen in der Literatur beschriebenen Seruminduktionseffekt nachweisen und überprüfen zu können. Insgesamt wurden für die hCYR61/CCN1 Promotorkonstrukte der Länge 200bp-1000bp Experimente in h-fob Zellen und T/C28a2 Zellen, jeweils unter serumfreien und serumhaltigen Bedingungen durchgeführt. Für die 450bp langen hCYR61/CCN1 Promotorkonstrukte mit den variierenden CA-Repeats von 17-22 CA-Repeats, wurden ebenso Transfektionsexperimente in beiden Zelllinien und unter beiden Kultivierungsbedingungen durchgeführt. Als Ergebnisse ist zusammengefasst festzuhalten, dass ein statistisch signifikanter Zusammenhang zwischen den hCYR61/CCN1 Promotorkonstrukten unterschiedlicher Länge von 200bp-1000bp und ihrem Promotoraktivitätsniveau besteht. Die hCYR61/CCN1 Promotorkonstrukte der Länge 200bp-800bp besitzen eine sehr hohe basale Promotoraktivität, die um den Faktor 4-5 bei serumfreier Kultivierung über der Hintergrundsaktivität liegt. Die Aktivität des 1000bp Promotorfragmentes ist signifikant niedriger (p=0,024 in h-fob Zellen und p=0,037 für T/C28a2 Zellen bei serumhaltiger wie serumfreier Kultivierung), als die der übrigen Promotorfragmente, die sich untereinander nicht signifikant in ihren Aktivitäten unterscheiden (p=0,57 in h-fob Zellen und p=0,66 für T/C28a2 Zellen bei serumfreire Kultivierung). Es besteht weiterhin ein signifikanter Seruminduktionseffekt, der für alle Konstrukte und beide Zelllinien nachzuweisen ist. Dieser ist bei den hCYR61/CCN1 Promotorkonstrukten der Länge 200bp-1000bp, ebenso wie bei den hCYR61/CCN1 Promotorkonstrukte 450bp mit den variablen 17-22 CA-Repeats nachweisbar (p=0,001 in h-fob Zellen und p=0,002 für T/C28a2 Zellen). Der Seruminduktionseffekt ist für alle Konstrukte proportional und wirkt signifikant stärker auf die T/C28a2 Zellen, als auf die h-fob Zellen. So liegt die durchschnittliche Steigerung der hCYR61/CCN1 Promotoraktivität etwa bei dem Faktor 1,5-3 in h-fob Zellen, in T/C28a2 Zellen jedoch um den Faktor 8-11. Dieser Effekt wirkt auf den Promotor von hCYR61/CCN1, da die basale Hintergrundsaktivität gemessen anhand der Transfektion des leeren Expressionsvektors pgl3-Baisc, davon unbeeinflusst bleibt. Es besteht kein statistisch signifikanter Zusammenhang zwischen den CA-Repeat Polymorphismen 17-22 CA-Repeats in dem hCYR61/CCN1 Promotorkonstrukt der Länge 450bp und deren Promotoraktivitäten (p=0,495 in h-fob Zellen und p=0,514 für T/C28a2 Zellen bei serumfreier Kultivierung und p=0,397 in h-fob Zellen und p=0,488 für T/C28a2 Zellen bei serumhaltiger Kultivierung). Die Konstrukte haben also unabhängig von der Zahl der CA-Repeats keine unterschiedliche Promotoraktivität gemessen im Luziferase Assay. Somit lässt sich in diesem in vitro System kein relevanter Effekt hinsichtlich der funktionellen Relevanz diese CA-Repeat Polymorphismus nachweisen. Weitere Experimente werden Auskunft über kausale Regulationsmechanismen des hCYR61/CCN1 Promotors und die Relevanz von hCYR61/CCN1 innerhalb des Knochenstoffwechsels geben.
Zur Gattung Bordetella gehören mehrere zum Teil sehr eng miteinander verwandte Keime, die bislang, mit Ausnahme des Umweltisolats B. petrii, ausschließlich in Assoziation mit einem Wirtsorganismus nachgewiesen werden konnten. Hierzu gehören zum einen die „klassischen“ Arten, deren pathogenes Potential vom obligat humanpathogenen Erreger des Keuchhustens, B. pertussis, dem ebenfalls humanpathogenen Keim B. parapertussis bis hin zu B. bronchiseptica, dem Erreger von Atemwegserkrankungen in verschiedenen Säugetieren, reicht. Zum anderen wurde dieser Gattung mit B. avium, B. hinzii, B. trematum, B. holmesii und B. petrii in den letzten Jahren „neue“ Arten zugeordnet, die zum Teil humanpathogenes, zum Teil tierpathogenes Potential besitzen. Da die evolutionären Beziehungen der „neuen“ Bordetella-Arten innerhalb der Gattung Bordetella bislang noch wenig untersucht wurden, wurde im Rahmen dieser Arbeit die Verbreitung und Konservierung von bekannten Bordetella-Genen und IS-Elementen bei den „neuen“ Bordetella-Arten untersucht. Aufgrund der vermehrten Hinweise auf ein humanpathogenes Potential von B. holmesii und seiner Assoziation mit einem dem Keuchhusten ähnlichen Krankheitsbild wurde der Schwerpunkt dieser Untersuchungen auf die Analyse der phylogenetischen Beziehungen zwischen B. holmesii und dem B. bronchiseptica-Cluster gelegt. Während durch den Nachweis der bei dem B. bronchiseptica-Cluster vorkommenden IS-Elemente IS481 und IS1001 die durch die 16S rDNA-Sequenz ermittelte Position von B. holmesii innerhalb des B. bronchiseptica-Clusters bestätigt werden konnte, ergab eine vergleichende Sequenzanalyse der in der Gattung Bordetella hoch konservierten Proteine OmpA, BvgA und BvgS die interessante Beobachtung, dass dieser Organismus in dieser Hinsicht viel mehr Ähnlichkeiten zu den „neuen“ Bordetella-Arten besitzt und in diesem Zusammenhang phylogenetisch eher im Umfeld von B. avium anzusiedeln ist. Bei der Charakterisierung von vier unterschiedlichen B. holmesii-Blutisolaten wurden im Rahmen dieser Arbeit zwei variante B. holmesii-Stämme identifiziert, die sich hinsichtlich der fehlenden Expression des intakten Response-Regulators BvgABH von wildtypischen B. holmesii-Isolaten unterscheiden. Im weiteren konnte gezeigt werden, dass bei diesen phasenvarianten Stämmen die fehlende Expression auf eine Punktmutation innerhalb der bvgABH-Nukleotidsequenz zurückzuführen ist. Diese wird in beiden Fällen an der selben Nukleotidposition durch die Insertion eines Adenosinrestes hervorgerufen. Obwohl dieser Sequenzabschnitt nicht durch eine repetitive Nukleotidfolge gekennzeichnet ist und somit keinerlei Ähnlichkeiten mit einer für Frameshift-Mutationen anfälligen Stelle besitzt, könnte es sich bei der identifizierten DNA-Region dennoch um einen „hot spot“ für eine Punktmutation handeln, da die zwei varianten B. holmesii-Stämmen unabhängig voneinander aus unterschiedlichen Blutkulturen isoliert wurden. Von besonderer Bedeutung war zudem die Beobachtung, dass sich unter diesen varianten Stämmen auch der bei den Stammsammlungen als Referenzstamm abgelegte B. holmesii-Stamm ATCC51541 befindet. Da im Rahmen dieser Arbeit keinerlei offensichtliche phänotypische Unterschiede zwischen den varianten und den wildtypischen B. holmesii-Stämmen festgestellt werden konnten, bleibt die Bedeutung der Phasenvariation bei B. holmesii bislang noch ungeklärt. Im weiteren wurde mit Hilfe eines „Genome Walks“ die an den bvgABH-Leserahmen angrenzenden DNA-Bereiche für B. holmesii ermittelt. Dabei konnte 5 bp nach dem bvgABH-Stoppcodon ein weiterer Leserahmen (bvgSBH) identifiziert werden, welcher Homologien zu der Histidinkinase BvgS aus B. pertussis besitzt. Interessanterweise stellte sich bei der Sequenzanalyse heraus, dass der Konservierungsgrad des bvgASBH-Locus aus B. holmesii und des bvgAS-Locus aus B. pertussis auf DNA-Ebene sehr gering ist. Diese Beobachtung erklärt wiederum, warum der bvgASBH-Genlocus aus B. holmesii früher nicht durch DNA/DNA- Hybridisierungs-Experimente mit einer B. pertussis spezifischen DNA-Sonde nachgewiesen werden konnte und sein Vorhandensein erst nach dem Einsatz von degenerierten Primern über PCR-Analysen detektiert werden konnte. Im weiteren konnte über den „Genome Walk“ gezeigt werden, dass die an dem bvgAS-Locus angrenzenden DNA-Bereiche innerhalb der Gattung Bordetella nicht konserviert sind. Zum einen ist der bvgASBH-Locus aus B. holmesii nicht wie bei dem B. bronchiseptica-Cluster in 5´-Richtung von dem fhaB-orthologen Genlocus benachbart, da sich an dieser Stelle ein weiterer, potentieller Response-Regulator befindet. Ebenso konnten stromaufwärts von bvgASBH keinerlei Hinweise auf das Vorhandensein eines, dem bvgR-Gen der „klassischen“ Arten orthologen Leserahmens erzielt werden. Über weitere Sequenzanalysen konnte darüber hinaus gezeigt werden, dass der Promotorbereich des bvgASBH-Genlocus überraschenderweise keinerlei offensichtliche Sequenzhomologien zu dem entsprechenden Promotorbereich der bvgAup-Region der „klassischen“ Arten zeigt. Dennoch konnten über in silico-Analysen mehrere Sequenzmotive innerhalb der bvgABHup-Region identifiziert werden, die als „inverted repeat“-Strukturen angeordnet sind und die zum Teil eine hohe Übereinstimmung zu der für die „klassischen“ Bordetella-Arten beschriebene BvgA-Konsensussequenz 5´-T/A T T C C/T T A-3 besitzen. Während sich diese Wiederholungssequenzen hinsichtlich ihrer Symmetrie und ihrer Anordnung von denen innerhalb der für das B. bronchiseptica-Cluster beschriebenen bvgAup-Region unterscheiden, konnten auffällige Parallelen zu der Promotorregion des vag- (virulence activated gene) Gens bvgR festgestellt werden. Obwohl sowohl der Response-Regulator BvgABH aus B. holmesii als auch das BvgA-Protein aus B. pertussis in vitro an die „inverted repeat“ Strukturen der bvgABHup-Region binden kann, führte eine Analyse der GFP-Expression der Reportergenfusion bvgABHup-gfp zu der erstaunlichen Beobachtung, dass die Reportergenfusion in B. pertussis durch die Bindung des BvgA-Proteins reprimiert wird, während sie im Gegensatz dazu in B. holmesii durch die Bindung des BvgABH-Proteins aktiviert wird. Die molekulare Grundlage für diese unterschiedlichen Regulationsmechanismen konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht ermittelt werden. Trotz einer umfangreichen Sequenzkonservierung zwischen dem Response-Regulator BvgABH aus B. holmesii und BvgA aus B. pertussis ist das BvgABH-Protein nicht in Lage, die Funktion des BvgA-Proteins aus B. pertussis in vitro bzw. in vivo zu ersetzen. Im Gegensatz dazu konnte mit Hilfe von Komplementationsexperimenten gezeigt werden, dass die Histidinkinase BvgSBH aus B. holmesii in der Lage ist, die Funktion des in dem B. pertussis Stamm 347 mutierten BvgS-Proteins zu übernehmen. Überraschenderweise unterschiedet sich jedoch das BvgSBH-Protein hinsichtlich der Wahrnehmung der Umweltstimuli von BvgS, da die Aktivität der Histidinkinase BvgSBH in dem hybriden B. pertussis Stamm BP 347 (pRK415-bvgASBH ATCC51541) nicht vollständig durch Sulfationen moduliert werden kann. Dies ist möglicherweise darauf zurückzuführen, dass im Gegensatz zu den cytoplasmatischen Regionen die BvgSBH- und BvgS- Sensorproteine vor allem in ihren sensorischen Bereichen einen sehr geringen Konservierungsgrad aufweisen.
Bakterien müssen ständig in der Lage sein auf Veränderungen in ihrer Umwelt reagieren zu können. Zur Wahrnehmung dieser Veränderungen haben sich unterschiedliche Signaltransduktionssysteme entwickelt. Ein weit verbreiteter und gut charakterisierter Mechanismus zur Signaltransduktion sind die so genannten Zwei-Komponentensysteme. Im Genom von H. pylori konnten nur wenige Bestandteile von Zwei-Komponentensystemen identifiziert werden. Dazu zählen neben dem Chemotaxis-System lediglich drei Histidin-Kinasen, ArsS, CrdS und FlgS, und fünf Response-Regulatoren HP1021, HP1043, ArsR, CrdR und FlgR, die vermutlich Transkriptions-regulatorische Funktionen haben. Zwei der Response-Regulatoren, HP1043 und ArsR als essentiell für das Überleben von H. pylori, während HP1021 einen deutlichen Einfluss auf das Zellwachstum hat, da ein Wachstums-Defekt zu erkennen ist, wenn das entsprechende Gen hp1021 deletiert wird. Eine Deletion von arsS, dem Gen der zugehörigen Histidin-Kinase von ArsR, hat unter Standard-Wachstumsbedingungen keine Auswirkung auf das Zellwachstum von H. pylori. Diese Beobachtung spricht für die Hypothese, dass der Response-Regulator ArsR die Transkription zweier unterschiedlicher Sets von Zielgenen kontrolliert. Demzufolge reguliert der Response-Regulator ArsR nach Säure-induzierter Phosphorylierung durch ArsS die Transkription von Genen, die zur Säureresistenz beitragen, während ArsR im nicht-phosphorylierten Zustand die Transkription von weiteren Zielgenen kontrolliert, von denen mindestens eines für das Zellwachstum essentiell sein sollte. Das durch ArsR~P kontrollierte Regulon konnte bereits weitgehend charakterisiert werden allerdings sind die Zielgene des unphosphorylierten Regulators bislang unbekannt. In der vorliegenden Arbeit konnte die zuvor beschriebene Hypothese bestätigt werden, da gezeigt wurde, dass ein Derivat von ArsR, mit einer Mutation der Phosphorylierungsstelle D52 zu N52, das wildtypische Protein bezüglich des Zellwachstums unter Standardbedingungen funktionell ersetzen kann. Für die Response-Regulatoren HP1021 und HP1043 konnte bislang keine zugehörige Histidin-Kinase identifiziert werden und interessanterweise findet man in der Receiver-Domäne dieser Response-Regulatoren atypische Abweichungen von der Konsensus-Sequenz. Um die Bedeutung dieser atypischen Primärsequenzen für die Funktion dieser Response-Regulatoren zu untersuchen wurden mutierte H. pylori-Stämme konstruiert, die ausschließlich Derivate von HP1021 bzw. HP1043 exprimieren, die in ihrer Receiver-Sequenz der Konsensus-Sequenz entsprachen. Da diese Mutanten sich bezüglich ihres Zellwachstums nicht vom Wildtyp unterscheiden, konnte nachgewiesen werden, dass die atypischen Receiver-Sequenzen der beiden Response-Regulatoren nicht entscheidend für die Funktionen der Response-Regulatoren sind. Weiterhin konnten Indizien dafür gesammelt werden, dass HP1021 und HP1043 hinsichtlich ihrer Aktivierung vermutlich vom üblichen Zwei-Komponentenparadigma abweichen. Derivate von HP1021 und HP1043 mit Mutationen ihrer putativen atypischen Phosphorylierungsstelle sind in der Lage ihre wildtypischen Pendants hinsichtlich der bekannten Phänotypen funktionell zu ersetzen. Somit ist eine Phosphorylierung der Receiver-Domäne dieser Response-Regulatoren keine Voraussetzung für ein normales Zellwachstum von H. pylori. Diese Hypothese wird gestützt durch die Beobachtung, dass ein Ortholog von HP1043 aus C. jejuni CJ0355, das natürlicherweise an der potentiellen Phosphorylierungsstelle einen nicht phosphorylierbaren Aminosäurerest trägt, HP1043 in seiner Funktion ersetzen kann. Es konnte gezeigt werden, dass in vitro keine Phosphorylierung durch radioaktiv markiertes Acetylphosphat stattfindet und dass ein H. pylori-Stamm mit einer Deletion der Gene pta und ackA, welche Proteine kodieren, die bei der Synthese von zellulärem Acetylphosphat benötigt werden, einen normalen Wachstums-Phänotyp zeigt. Zusätzlich konnten in einer massenspektrometrischen Analyse des Proteins HP1021, welches nach Zweidimensionaler Gelelektrophorese von Gesamtzellproteinlysaten aus H. pylori isoliert wurde, keine Hinweise auf eine Serinphosphorylierung entdeckt werden. Es ist daher fraglich ob in vivo eine funktionell relevante Phosphorylierung stattfindet. Die Mechanismen zur Modulation der Regulator-Aktivität von HP1043 und HP1021 bleiben unklar. In der vorliegenden Arbeit konnte demonstriert werden, dass eine strikte Transkriptionskontrolle nicht für die Zellwachstums-assoziierten Funktionen von HP1021 von Bedeutung ist. Dagegen wurden Hinweise darauf erzielt, dass die Expression von HP1043 auf einem posttranskriptionellen und/oder auf einem posttranslationellen Level reguliert wird. Es waren bislang keine Zielgene von HP1021 bekannt. Durch vergleichende Zweidimensionale Gelelektrophorese der H. pylori Stämme 26695 und 26695 1021Δ konnten einige potentielle Zielgene des Response-Regulators HP1021 identifiziert werden.
Listeria monocytogenes ist ein weit verbreitetes, Gram-positives humanpatho-genes Bakterium, welches in immunsupprimierten Personen das Krankheitsbild der Listeriose auslösen kann. Der Infektionszyklus der Listerien im Wirt ist im Hinblick auf die Pathogenese dieses Erregers intensiv untersucht worden. Die Regulation der verschiedenen beteiligten Virulenzfaktoren unterliegt in L. monocytogenes einer starken Kontrolle, die einerseits durch regulatorische Proteine aber auch durch Umweltfaktoren beeinflusst wird. Die Mechanismen, die auf transkriptionaler wie auch auf translationaler Ebene die Expression verschiedener listerieller Virulenzgene regulieren, wurden kürzlich näher charakterisiert. Es wurden für verschiedene listerielle Virulenzgene Riboswitch-mechanismen zur Expressionskontrolle in Listerien neu beschrieben. Durch Vorarbeiten wurde auch für das inlAB-Operon ein posttranskriptionaler Regu-lationsmechanismus postuliert. Dabei wurde der anaerobe Stoffwechsel der Listerien als möglicher Auslöser für die beobachtete Translationssteigerung des inlA- und inlB-Gens diskutiert. Innerhalb der vorliegenden Arbeit sollte nun weitergehend untersucht werden, in welchem Bereich der Sequenz des inlAB-Operons sich regulatorische Strukturen zur posttranskriptionalen Regulation unter anaeroben Wachstumsbedingungen befinden. Dazu wurden verschiedene Mutanten mit unterschiedlichen Deletionen im inlAB-Operon konstruiert und die Transkription und Translation sowohl des inlA-, als auch des inlB-Gens betrachtet. Eine Deletion im aroA-Gen bewirkt das Wachstum der Bakterien bei anaerobem Stoffwechsel. Diese Deletion wurde in die konstruierten Stämme eingefügt, um die Expression der Gene unter den verschiedenen Wachstumsbedingungen vergleichen zu können. Außerdem wurden verschiedene gus-Reportergen-Fusionsmutanten und Promotor-austauschmutanten konstruiert, um quantitativ aussagekräftigere Daten zu erheben. Die Charakterisierung der Mutanten ließ erkennen, dass keiner der deletierten Bereiche des inlAB-Operons von L. monocytogenes für die beobachtete Translationssteigerung im inlA-Gen bei anaerobem Stoffwechsel verantwortlich zu sein scheint. Das inlB-Gen war innerhalb der hier gezeigten Experimente nicht posttranskriptional reguliert, wie im Vorfeld postuliert. Nach plasmidkodierter Expression verschiedener Bereiche des inlAB-Operons konnte, verglichen mit genomischer Expression, keine Veränderung in der inlA-Expression beobachtet werden. Die mögliche Beteiligung eines potentiellen Regulatorproteins konnte innerhalb dieser Arbeit daher nicht näher eingegrenzt werden. Auch ein Einfluss der regulatorischen Faktoren Hfq und CcpA auf die Expression des InlA Proteins in der L. monocytogenes ΔaroA-Mutante konnte nicht gefunden werden. Es zeigte sich interessanterweise außerdem, dass weitere Virulenzgene wie actA und hly unter den anaeroben Bedingungen ebenfalls eine Translations-steigerung zeigten. Somit stellt sich abschließend die Frage, ob es sich bei der beobachteten Translationssteigerung des inlA-Gens wirklich um einen durch bestimmte Strukturen in der inlAB-mRNA ausgelösten Mechanismus handelt. L. monocytogenes ist als intrazellulär replizierendes, Gram-positives Bakterium interessant für den Einsatz in immun- und tumortherapeutischen Anwendungen. Attenuierte L. monocytogenes-Stämme wurden dazu bereits erfolgreich im Mausmodell als Trägerbakterien für Impfstoffstrategien eingesetzt. Die gezielte Infektion von Geweben ist jedoch aufgrund des wenig ausgeprägten Zelltropismus der Listerien im Wirt bisher ein Problem für einen Einsatz in bakterienbasierten Anwendungen, wie z.B. der Tumor- oder Gentherapie. Innerhalb dieser Arbeit wurden L. monocytogenes-Stämme konstruiert, bei denen chromosomal das für die Integrase codierende Gen gegen das Gen für das Staphylokokken Protein A (SPA) unter der Kontrolle listerieller Promotoren ausgetauscht wurde. Die erfolgreiche Oberflächenlokalisation von Protein A in der Zellwand von Listerien konnte im Western Blot oder in funktionellen Immunfluoreszenzfärbungen in Mikroskop- und FACS-Analysen nachgewiesen werden. Diese Stämme sollen im Cell Targeting zur gezielten Infektion von Geweben eingesetzt werden. Dazu konnten die Bakterien über Herceptin®-HER2/neu-vermittelte Adhäsion an SK-BR-3-Zellen erfolgreich in diese aufgenommen werden und innerhalb dieser replizieren. Die neu konstruierten Listeria-Stämme zeigten im Mausmodell keine Veränderung in ihrer Virulenz verglichen mit nicht-SPA-exprimierenden Stämmen. Die in dieser Arbeit vorgestellte Antikörper-Rezeptor-vermittlelte Aufnahme der Listerien in Zellen stellt einen neuen, bisher nicht beschriebenen Mechanismus dar, der in vielen therapeutischen Anwendungen zur Infektion spezifischer Gewebe durch Listerien genutzt werden kann.