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Die vorliegende Arbeit untersucht die positiven Auswirkungen des Angiotensin-II-Rezeptor-Antagonisten Telmisartan auf die endotheliale Funktion und Thrombozytenaktivierung bei Ratten mit Streptozotocin-induziertem Diabetes mellitus. In Gefäßreaktivitätsstudien, Luminometer- und Fluoreszenzmessungen und mit Hilfe der Durchflusszytometrie wurden die Wirkungen des Medikamentes überprüft. Es konnte gezeigt werden, dass sich durch Telmisartan die NO-Bioverfügbarkeit verbessert, welche maßgeblich für die endotheliale Funktion verantwortlich ist und durch Ca2+-abhängige Aktivierung der eNOS und dehnungsinduzierte, Ca2+-unabhängigen NO-Bildung beeinflusst wird. Positiv wird des Weiteren die Sensitivität der glatten Gefäßmuskelzellen gegenüber NO beeinflusst, was zur Vasodilatation führt. Die atherosklerosefördernde Superoxidbildung wird zusätzlich reduziert. Es erfolgten außerdem Messungen von thrombozytengebundenem Fibrinogen, dementsprechend der GP IIb/IIIa-Aktivität, und der VASP-Phosphorylierung, demzufolge dem NO/cGMP-Signalweg, in Thrombozyten durch FITC-markierte Antikörper mit Hilfe der Durchflusszytometrie. Es wurde gezeigt, dass die Thrombozytenaktivierung, die für den initialen Schritt der Atherosklerose verantwortlich gemacht wird, durch Telmisartan verringert wird. Alle Messungen wurden vergleichend in einer Kontroll-, Placebo- und Telmisartangruppe durchgeführt. Die beobachtete Blutdrucksenkung ist, nach früheren Betrachtungen, nicht alleine verantwortlich für die verbesserte endotheliale Funktion, welche bei dem Einsatz von AT-II-Antagonisten beobachtet wird. Telmisartan wirkt, laut einer Studie, als einziger AT-II-Antagonist als partieller PPAR-Rezeptor, so dass Insulinresistenz und metabolische Parameter verbessert werden. Über diese Wirkungen beeinflusst Telmisartan auch die endotheliale Funktion und die Thrombozytenaktivierung. Zur Reduktion von vaskulären Komplikationen bei Diabetes mellitus erscheint Telmisartan aufgrund der vorliegenden Ergebnisse als sinnvolle medikamentöse Therapie.
Diabetes ist assoziiert mit einer endothelialen Dysfunktion sowie einer vermehrten Aktivierung von Thrombozyten. Beides erhöht wahrscheinlich das Risiko eines kardiovaskulären Ereignisses. In der vorliegenden experimentellen Arbeit wurde untersucht, ob der Hydroxy-3-Methyl-Glutaryl (HMG)-CoA-Reduktase-Inhibitor Rosuvastatin zu einer Verbesserung der Endotheldysfunktion und einer Reduktion der Thrombozyten-Aktivierung im diabetischen Tiermodell beiträgt. Zu diesem Zweck wurde männlichen Wistar Ratten einmalig Beta-Zell-toxisches Streptozotocin injiziert und dadurch künstlich ein Diabetes mit persistierender Hyperglykämie erzeugt. Die Behandlung mit Rosuvastatin (20 mg/kg Körpergewicht täglich) beziehungsweise Placebo wurde zwei Wochen nach Induktion der Hyperglykämie begonnen und über zwei weitere Wochen fortgeführt. Die Gefäßfunktion wurde anschließend an isolierten Aortensegmenten im Organbad gemessen, die Bestimmung der Thrombozyten-Aktivierung erfolgte in frischem Vollblut. Die endothelabhängige Relaxation der Gefäße, induziert durch den rezeptorabhängigen Agonisten Acetylcholin, war in diabetischen Ratten signifikant vermindert und konnte durch die Rosuvastatin-Therapie verbessert werden. Dies ließ sich hauptsächlich auf eine deutlich reduzierte Sensitivität der Gefäßmuskulatur für Stickstoffmonoxid (NO) zurück führen, welche bei den diabetischen Tieren durch eine gesteigerte Superoxidbildung bedingt war. Rosuvastatin reduzierte signifikant die Bildung der Sauerstoffradikalen und verbesserte darüber hinaus die NO-Sensitivität. Weiterhin konnte durch die HMG-CoA-Reduktase-Inhibition die Bindung von Fibrinogen an aktiviertes GPIIb/IIIa, sowie die P-Selektin-Expression auf der Thrombozytenoberfläche als Marker der Thrombozyten-Degranulation reduziert werden, während diese beiden Marker der Thrombozyten-Aktivierung in der Placebo-behandelten diabetischen Versuchsgruppe erhöht waren. Aus diesen Ergebnissen lässt sich schlussfolgern, dass eine Behandlung mit dem HMG-CoA-Reduktase-Inhibitor Rosuvastatin bei diabetischen Ratten die Endotheldysfunktion der Gefäße verbessert und die Aktivierung von Thrombozyten durch eine verbesserte Verfügbarkeit des endogenen Thrombozyten-Inhibitors NO vermindert. Übertragen auf das menschliche Gefäßsystem könnte dieser Effekt zu einer Verminderung kardiovaskulärer Ereignisse durch eine Statin-Therapie bei Patienten mit Diabetes beitragen.
Verbesserung der vaskulären Dysfunktion bei Diabetes mellitus durch Aktivierung der Guanylatzyklase
(2009)
Die vorliegende Arbeit untersucht den Effekt des Guanylatzyklase-Aktivators HMR1766 auf die vaskuläre Dysfunktion bei Streptozotozin-(STZ-)induziertem Diabetes mellitus im experimentellen Rattenmodell. Zunächst wird anhand funktioneller Studien die vaskuläre Reaktivität aortaler Gefäßringe gesunder, Placebo- und HMR1766-behandelter Tiere verglichen. Davon ausgehend werden weiterführende experimentelle Daten dargestellt, die mögliche Wirkungsmechanismen von HMR1766 im STZ-Diabetes-Modell beschreiben und einen Erklärungsansatz für die funktionell gewonnenen Daten liefern. Es wird gezeigt, dass eine chronische Behandlung mit HMR1766 die endotheliale Dysfunktion im STZ-Diabetes signifikant verbessern kann. HMR1766 verstärkt den Stickstoffmonoxid-(NO-)Signalweg über die lösliche Guanylatzyklase zum zyklischen Guanosinmonophosphat (cGMP), normalisiert die eingeschränkte Vasorelaxation, führt zu einer gesteigerten NO-Bioverfügbarkeit und erhöht so die inhibitorische Wirkung von NO auf die Superoxid-produzierende NADPH-Oxidase. Dadurch wird der oxidative Stress signifikant reduziert und die NO-Inaktivierung durch Superoxid verringert. Die vorgelegten Daten stellen ferner einen Zusammenhang her zwischen dem vaskulären Kontraktionsdefizit bei Diabetes und einem Ungleichgewicht im Arachidonsäuremetabolismus. Durch eine Überexpression von Cytochrom-P450-2E1 (CYP2E1) im STZ-Modell kommt es zu einem Defizit der vasokonstriktorisch wirkenden 20-Hydroxyeicosatetraensäure (20-HETE). Dies führt zu einem verminderten Ansprechen der Gefäße auf Vasokonstriktoren wie Phenylephrin. HMR1766 kann durch die Verbesserung des NO/cGMP-Signals die katalytische Aktivität von CYP2E1 hemmen, dadurch das 20-HETE-Defizit ausgleichen und die vaskuläre Reaktivität wieder normalisieren. Zusammenfassend zeigen die dargestellten Ergebnisse, dass eine Behandlung mit HMR1766 bei STZ-induziertem Diabetes mellitus zu einer signifikanten Verbesserung der vaskulären Dysfunktion führt. Eine Behandlung mit HMR1766 könnte daher ein sinnvoller Ansatz sein zur Vermeidung vaskulärer Komplikationen bei Diabetes mellitus.
In der vorliegenden Arbeit wurden die Wirkungen einer 10-wöchigen Therapie mit dem 3-Hydroxy-3-Methylglutaryl-CoenzymA-(HMG-CoA)-Reduktase-Inhibitor Rosuvasta-tin auf die endotheliale Funktion, die Stickstoffmonoxid (NO)-Bioverfügbarkeit und die Phosphorylierung des „vasodilator-stimulated phosphoprotein“ (VASP) in Thrombozy-ten im Rattenmodell der chronischen Herzinsuffizienz (CHF) nach Koronarligatur un-tersucht. Die Phenylephrin-induzierte Vasokonstriktion war in Gefäßringen von Versuchstieren mit CHF im Vergleich zu Tieren ohne Herzinsuffizienz deutlich verstärkt, was sich auf eine Reduktion der tonischen NO-Freisetzung in Aortenringen von CHF-Ratten zurück-führen ließ. Die Behandlung mit Rosuvastatin erhöhte die NO-Freisetzung und normali-sierte die gesteigerte Kontraktionsantwort bei CHF-Tieren. Die durch Acetylcholin in-duzierte endothelabhängige Vasorelaxation war bei CHF signifikant beeinträchtigt und wurde durch die Behandlung mit Rosuvastatin ebenfalls deutlich verbessert. Da sich keine Unterschiede in der endothelunabhängigen Relaxation nach Gabe eines NO-Donors zwischen den Untersuchungsgruppen zeigten, ist die Reduktion der Acetylcho-lin-Antwort demnach eindeutig endothelial bedingt und lässt sich nicht auf eine vermin-derte NO-Sensitivität der Muskelzellen zurückführen. Diese endotheliale Dysfunktion scheinen Statine zumindest teilweise normalisieren zu können. Die Bildung von Super-oxidanionen in Aorten von CHF-Tieren war im Vergleich zu Tieren ohne Herzinsuffi-zienz signifikant gesteigert. Durch chronische Therapie mit Rosuvastatin konnte dies signifikant reduziert werden. Passend hierzu war die intraluminale NO-Bioverfügbarkeit, gemessen als basale VASP-Phosphorylierung an Ser239 in Thrombo-zyten, bei CHF-Tieren erniedrigt und wurde durch die Rosuvastatin-Behandlung nor-malisiert. Die Ergebnisse dieser Arbeit zeigen, dass es durch chronische Therapie mit dem HMG-CoA-Reduktase-Inhibitor Rosuvastatin zu einer Steigerung der NO-Bioverfügbarkeit und damit zu einer Verbesserung der Endothelfunktion bei Ratten mit Herzinsuffizienz kommt.
In der vorliegenden Arbeit werden die positiven Effekte des Phosphodiesterase-5-Inhibitors Sildenafil auf die Gefäßfunktion in einem experimentellen Diabetes-Modell (Streptozotocin-induziert) beschrieben. Diabetes und seine kardiovaskulären Folgeerkrankungen, welche bis zu 80 % der Todesfälle bei diabetischen Patienten verursachen, gehen mit einer Endotheldysfunktion einher, bei der eine verminderte NO-Bioverfügbarkeit sowie eine verstärkte Sauerstoffradikalbildung eine Schlüsselrolle spielen. Endotheliales NO aktiviert die lösliche Guanylatzyklase in glatten Gefäßmuskelzellen, welche über erhöhte zyklische Guanosinmonophosphat-Konzentrationen eine Gefäßrelaxation bewirkt. Sildenafil reduziert als potenter und selektiver PDE 5-Inhibitor den Abbau von cGMP. Bei diabetischen und nicht-diabetischen Ratten führte Sildenafil in-vitro zu einer direkten dosisabhängigen Gefäßrelaxation an vorkontrahierten Aortenringen und zu einer Verbesserung der endothelabhängigen und –unabhängigen Gefäßrelaxation. Auch nach akuter und chronischer Behandlung zeigte sich eine verbesserte endothelabhängige und -unabhängige Gefäßrelaxation. Ferner zeigte sich nach chronischer Behandlung mit Sildenafil eine signifikante Reduktion des bei diabetischen Tieren erhöhten oxidativen Stresses. Die signifikant höhere Expression der NAD(P)H-Oxidase Untereinheit gp91phox und der Rac-Untereinheit Rac-1 in den Aortenringen diabetischer Ratten - welche für erhöhten oxidativen Stress bei Diabetes spricht -, sowie die zum anderen bei diabetischen Ratten verstärkte Superoxid(O2-)-Produktion konnten durch eine chronische Behandlung mit Sildenafil signifikant reduziert werden. Desweiteren konnte Sildenafil das im diabetischen Tiermodell verminderte eNOS-Dimer/Monomer-Verhältnis zurück auf ein Niveau ähnlich dem von Kontrolltieren erhöhen. Eine chronische Behandlung mit Sildenafil könnte demnach die vaskuläre Hämostase im Hinblick auf die Sauerstoffradikalbildung und die Gefäßfunktion verbessern. Jedoch bleibt der klinische Einsatz aufgrund der kurzen Wirkdauer der Substanz limitiert; aktuell wird Sildenafil in der Therapie der erektilen Dysfunktion beim Diabetiker und der pulmonalen arteriellen Hypertonie verwendet.
Stickstoffmonoxid (NO) ist ein gasförmiges, relativ stabiles Radikal, das in Pflanzen u. a. durch Reduktion aus Nitrit unter Katalyse des Enzyms Nitratreduktase gebildet wird. In tierischen Organismen wird NO dagegen über einen oxidativen Syntheseweg aus der Ami-nosäure L-Arginin katalysiert durch verschiedene Isoformen der NO-Synthasen (NOS) hergestellt. Es besitzt im tierischen System vielfältige Funktionen u. a. als Neurotransmitter sowie Blutfluss und -druck regulierendes Agens. Im Pflanzenreich werden NO u. a. Aufgaben bei der Regulierung von Spaltöffnungen, der Abwehr von Pathogenen sowie der Differenzierung der Xylemelemente zugeschrieben. Die vorliegende Arbeit verfolgte zwei Ziele: - Erforschung alternativer oxidativer Synthesewege von NO in Pflanzen und - Untersuchung der NO-Spezifität der DAF-Fluoreszenzfarbstoffe ausgehend Diskrepanzen zwischen Daten aus Floureszenzanalysen und der Gasphasen-Chemilumineszenz in früheren Arbeiten unserer Arbeitsgruppe und zahlreichen weiteren Publikationen. a) NO-Produktion aus Hydroxylaminen Hydroxylamin ist ein Zwischenprodukt bei der bakteriellen Denitrifizierung und wurde auch als Intermediat bei der Nitratreduktion in Pflanzen diskutiert. Hier wird gezeigt, dass Tabaksuspensionzellen in der Lage waren, exogenes Hydroxylamin schon in sehr niedrigen Konzentrationen (4 µM) zu NO zu oxidieren. Auch ein anderes HA-Derivat, nämlich der Hemmstoff der Alternativen Oxidase (AOX) in Mitochondrien, Salicylhydroxamsäure (SHAM), wurde zu NO oxidiert. Die Vermutung, reaktive Sauerstoffspezies (ROS) könn-ten bei diesem Oxidationsprozess eine Rolle spielen, wurde überprüft: Nach Einwirkung des ROS-abbauenden Enzyms Superoxid-Dismutase (SOD) konnte aber überraschender-weise keine Verminderung, sondern eher eine Steigerung der NO-Emission beobachtet werden. Die Rolle der SOD in diesem Reaktionsprozess ist daher noch nicht verstanden. b) NO-Detektion mittels Fluoreszenzindikatoren Zur Visualisierung und Lokalisierung von NO in tierischen und pflanzlichen Zellen und Geweben (in situ) mittels mikroskopischer (LSM) oder fluorimetrischer Methoden werden Fluoreszenzfarbstoffe, z. B. DAF-2 oder DAF-FM verwendet. Diese Farbstoffe reagieren mit NO zu stark fluoreszierenden Triazol-Derivaten. Eine Situation, in der Pflanzen u. a. mit NO-Freisetzung reagieren, ist der Pathogenbefall. Wir untersuchten die Reaktion von Tabaksuspensionszellen auf den pilzlichen Elicitor Cryptogein, ein Protein des Oomyceten Phytophthora cryptogea. Im Filtrat der Zellen, die mit Cryptogein behandelt wurden, zeigte sich nach Zugabe von DAF-Farbstoffen ein starker Fluoreszenzanstieg. Um die fluoreszenzerhöhenden Stoffe zu charakterisieren, wurde das Filtrat vor der DAF-Zugabe verschiedentlich behandelt. Bei Zugabe von KCN bzw. Katalase zum Überstand, verringerte sich der Fluoreszenzanstieg. Gleichzeitige Behandlung der Zellen mit Cryptogein sowie dem NADPH-Oxidase-Inhibitor DPI unterband den Fluoreszenzanstieg im Überstand nahezu komplett. Enzym-Assays mit Amplex Rot zeigten die Anhäufung von H2O2 im Filtrat der elicitierten Zellen. Neben ROS werden von Pflanzenzellen auch Peroxidasen in den Apoplasten sekretiert, die mit Hilfe von H2O2 für eine verstärkte Quervernetzung der Zellwand sorgen. Sowohl in unbehandelten Kontrollzellen als auch in elicitierten Zellen wurde Peroxidase-Aktivität nachgewiesen. Nach Zugabe von H2O2 und DAF-2 zum Filtrat von Kontrollzellen ergab sich ein Fluoreszenzanstieg ähnlich dem im Filtrat von behandelten Zellen. Mit Hilfe eines einfachen In-vitro-Systems aus Meerettich-Peroxidase (MR-PO), Wasser-stoffperoxid (H2O2) und DAF-2 konnten noch höhere Fluoreszenzwerte erzielt werden, was die Vermutung der Fluoreszenzerhöhung ohne Anwesenheit von NO erhärtete. Um diese nicht aus einer Reaktion mit NO resultierenden DAF-Produkte näher zu charak-terisieren, wurden Trennungen mittels Umkehrphasen-Hochdruck-Flüssigkeitschro-matographie mit Fluoreszenzdetektion (RP-HPLC-FL) und Massenspektrometrie (UPLC-MS) durchgeführt. Dabei wurden tatsächlich zwei neue Reaktionsprodukte festgestellt, die sich eindeutig von DAF-2T unterschieden. Letzteres konnte nur bei Hinzufügen des NO-Donors DEA-NO detektiert werden. Zur Erfassung von intrazellulären Reaktionsprodukten von DAF wurden die chromatogra-phischen Trennmethoden auch auf Extrakte von mit DAF-2 DA aufgeladenen und danach elicitierten Zellen angewandt. Bei dieser Auftrennung tauchten noch mehr DAF-Reaktionsprodukte auf. Die Hauptfluoreszenz, die auch bei nicht inkubierten Zellen auf-trat, konnte auf eine Reihe sehr früh eluierender Substanzen zurückgeführt werden. Die zwei DAF-Derivate aus dem Überstand inkubierter Zellen bzw. der In-vitro-Reaktion (MR-PO+H2O2+DAF-2) tauchten jedoch überhaupt nicht auf. Vorläufige massenspektrometrische Analysen legen nahe, dass es sich bei den in Abwe-senheit von NO gebildeten zwei Verbindungen um isomere Dimere von DAF-2 handelt.
Der Prozess der adulten Neurogenese wird durch eine Vielzahl von Faktoren beein-flusst. Zu diesen zählt auch der Neurotransmitter und Second Messenger Stickstoffmonoxid (NO). Ziel der vorliegenden Arbeit war es, explizit den Einfluss des von der neuronalen NO-Synthase (nNOS) gebildeten NO-Moleküls auf die Teilprozesse des Überlebens und der Migration neu gebildeter Zellen im Bereich des Gyrus dentatus (DG) adulter Mäuse zu untersuchen. Um ausschließlich den Einfluss von nNOS untersuchen zu können, wurden die Experimente der vorliegenden Arbeit mit einem genetischen Modell der nNOS-defizienten Maus durchgeführt. Die Untersuchung des Überlebens und der Migration neu gebildeter Zellen im Bereich des DG der unterschiedlichen nNOS-Genotypen fand anhand des immunhistochemischen Nachweises des Thymidin-Analogons 5-Brom-2'-desoxyuridin (BrdU) sowie der quantitativen Analyse der BrdU-positiven Zellen statt. Um eine Aussage zum Überleben (sog. Survival) und zur Migration treffen zu können, wurde das Gewebe der Versuchstiere erst vier Wochen nach den erfolgten BrdU-Injektionen entnommen. Die Survivaluntersuchung zeigte eine im Vergleich zu den Kontrollen hochsignifikant erhöhte Anzahl bzw. Konzentration überlebender neu gebildeter Zellen in der Subgranulärzone (SGZ) und Körnerzellschicht (KZS) des DG der nNOS-Knockout(KO)-Mäuse. Die Migrationsuntersuchung ergab einen signifikant erhöhten Anteil der nach vier Wochen in die KZS eingewanderten neu gebildeten Zellen in den nNOS-KO-Mäusen. Das von nNOS gebildete NO scheint somit einen hemmenden Einfluss auf das Überleben und die Migration neu gebildeter Zellen im Bereich des DG adulter Mäuse zu besitzen. Um zu untersuchen, auf welche Weise das von Neuronen gebildete NO-Molekül die Teilprozesse des Überlebens und der Migration hemmen könnte, wurde zunächst die räumliche Nähe zwischen neuronalen Stamm- bzw. Vorläuferzellen und nNOS-positiven Zellen mit Hilfe von Kolokalisationsstudien mit fluorochrommarkierten Antikörpern gegen die Antigene BrdU und nNOS untersucht. Dazu wurden Mäuse verwendet, denen zum Nachweis der Proliferation adulter Stamm- bzw. Vorläuferzellen erst kurz vor der Gewebeentnahme BrdU injiziert worden war. Da die im Bereich des DG nur in geringer Anzahl vorliegenden nNOS-positiven Zellen relativ weit entfernt von den BrdU-positiven Zellen detektiert wurden, erscheint ein direkter Einfluss des von Neuronen gebildeten NO-Moleküls auf die neuronalen Stamm- bzw. Vorläuferzellen unwahrscheinlich. Um zu erforschen, ob der hemmende Einfluss von nNOS durch neurotoxische Eigen-schaften des NO-Moleküls bedingt ist, fand die Fluoro-Jade B(F-J B)-Färbung zum Nachweis degenerierender Neurone statt. Im Rahmen dieser Untersuchung zeigte sich kein signifikanter Unterschied hinsichtlich der Anzahl degenerierender Neurone im Bereich des DG der nNOS-KO- und nNOS-Wildtyp-Tiere. Die hemmende Wirkung des von Neuronen gebildeten NO-Moleküls auf das Überleben und die Migration muss folglich auf einen anderen Mechanismus als auf den der Neurotoxizität zurückzuführen sein. Das Ergebnis der F-J B-Färbung ist jedoch angesichts des hochsignifikant erhöhten Überlebens neu gebildeter Zellen im Bereich des DG der nNOS-KO-Mäuse bei vergleichbarem KZS-Volumen der verschiedenen nNOS-Genotypen durchaus kritisch zu bewerten und sollte durch andere Nachweise der Zelldegeneration überprüft werden. Der hemmende Einfluss von nNOS auf das Überleben neu gebildeter Zellen im Bereich des DG adulter Mäuse wurde schließlich auf dem Hintergrund der vielfach beschriebenen antiproliferativen und einer die Differenzierung fördernden Wirkung des NO-Moleküls interpretiert. So scheint das von nNOS gebildete NO den Prozess des Überlebens dadurch zu hemmen, dass es als antiproliferatives Agens den Übergang der neuronalen Vorläuferzellen aus dem Stadium der Proliferation in das der Differenzierung induziert. Diese Hypothese ließe sich durch entsprechende Kolokalisationsstudien zur Differenzierungsrichtung neu gebildeter Zellen im Bereich des DG adulter Mäuse erhärten. Zur Klärung der Zusammenhänge zwischen NO und Migration bedarf es erst noch grundlegender Untersuchungen zum physiologischen Ablauf der Migration neu gebildeter Zellen im Bereich des DG.
Protamin antagonisiert die antikoagulierende Wirkung von Heparin. Nach intravenöser Protaminapplikation treten als häufige unerwünschte Wirkungen ein systemischer Blutdruckabfall, Herzfrequenzabfall sowie eine Erhöhung des pulmonalarteriellen Widerstandes auf. Die Protamin-assoziierten Nebenwirkungen sind zum Teil lebensbedrohlich. Der ihnen zugrunde liegende Mechanismus wurde in der vorliegenden Arbeit auf Zellkultur- und Gesamttierebene analysiert sowie mögliche Therapieoptionen aufgezeigt. Heparin-Protamin-Komplexe aktivieren auf Endothelzellen den Blutgerinnungsfaktor XII. Aktiver Faktor XII startet über sein Substrat Plasmakallikrein die Freisetzung des Peptidhormons Bradykinin aus hochmolekularem Kininogen. Funktions-inhibierende Antikörper oder pharmakologische Inhibitoren von Plasmakallikrein oder Faktor XII blockierten die Heparin-Protamin induzierte Bradykininbildung auf Zellen. Stickstoffmonoxid-spezifische Fluorophore zeigten, dass Bradykinin-Bindung an Kinin B2 Rezeptoren die endotheliale Stickstoffmonoxid-Synthase aktiviert. B2 Rezeptorantagonisten blockierten die Heparin-Protamin induzierte Stickstoff-monoxidbildung. Die intravenöse Infusion von Protamin in heparinisierte Wildtypmäuse senkte den systemischen Blutdruck und die Herzfrequenz. Im Gegensatz dazu waren Faktor XII und B2 Rezeptor Gen-defiziente Mäuse oder Tiere, die Faktor XII Inhibitoren oder B2 Rezeptorantagonisten infundiert bekamen, vor Heparin-Protamin-Effekten geschützt. Mit dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass Heparin-Protamin-Komplikationen durch eine Faktor XII-getriebene Bradykininbildung verursacht werden. Eine Blockade der Bradykininbildung oder -wirkung eröffnet eventuell eine Möglichkeit, die Heparin-Protamin-Nebenwirkungen auch beim Patienten zu therapieren.
Die NADPHd-Färbung stellt bekanntermaßen Neurone dar, die die neuronale NOS exprimieren. Die Anfärbung der Neurone ist in ihrer Qualität dabei mit Golgi-basierten Versilberungstechniken vergleichbar. Aufgrund dieser Eigenschaften ermöglicht diese Methode morphologische und funktionelle Untersuchungen. Somit ist sie geradezu zur Bearbeitung neuropathologischer Fragestellungen prädestiniert. Im Putamen werden durch diese Technik vorwiegend Interneurone angefärbt. Anhand morphologischer Kriterien wurden die nitrinergen Neurone klassifiziert. Im menschlichen Putamen konnten dabei 12 Neuronentypen (NADPHd I bis XII) unterschieden werden, die nur zum Teil in bereits bestehende Klassifikationssysteme eingeordnet werden konnten. Ausgehend von dieser Klassifikation ist es möglich, in vergleichenden Studien Veränderungen NADPHd-positiver Neurone im Rahmen neurodegenerativer Erkrankungen festzustellen. Im Falle der vorliegenden Arbeit wurde dabei das Putamen schizophrener Patienten untersucht. Aufgrund der geringen Anzahl von drei untersuchten schizophrenen Gehirnen ließen sich nur vorläufige Aussagen in Bezug auf Unterschiede NADPHd-positiver Neurone im Putamen Gesunder und Schizophrener treffen. Solche Unterschiede wurden in der Morphologie dieser Neurone gefunden, aber auch in deren Dichte: Im Putamen Schizophrener lag die Dichte NADPHd-positiver Neurone signifikant unter der bei der gesunden Kontrollgruppe ermittelten Dichte. Neben diesem numerischen Unterschied konnten auch morphologisch auffällige Neurone gefunden werden, die in der gesunden Kontrollgruppe nicht vorhanden waren. Sowohl im Claustrum als auch in der das Claustrum umgebenden weißen Substanz der Capsulae externa et extrema konnten NADPHd-positive Neurone nachgewiesen werden. Die NADPHd-positiven Neurone des Claustrums ließen sich zum Teil nach bereits bestehenden Einteilungen klassifizieren. In den äußeren Kapseln lagen sie zumeist parallel zur Richtung der Fasermassen angeordnet und zählten zu den interstitiellen Zellen der weißen Substanz.
Lokalisation und Bedeutung der NO-sensitiven Guanylyl-Cyclase bei der Leberfibrose in der Maus
(2019)
Mittels der im Rahmen dieser Arbeit behandelten Untersuchungen konnten neue Erkenntnisse über die Rolle der NO-GC bei der Pathogenese der Lungen- und der Leberfibrose gewonnen wer- den. Infolge einer Fibrose in Lunge und Leber kommt es zu einer übermäßigen Akkumulation von EZM, die zum Organversagen führen kann. Bis jetzt existieren nur wenige Therapiemöglichkeiten, die zur Behandlung von Organfibrose dienen. Jedoch konnte bereits gezeigt werden, dass durch den Einsatz von NO-GC-Stimulatoren/Aktivatoren es zu Verbesserung/Heilung bei verschiedenen Organfibrosen kommt. Deshalb wird vermutet, dass die NO-GC eine modulatorische Rolle bei der Entwicklung einer Organfibrose einnimmt. Die Effektorzellen sind bisher unbekannt.
Im ersten Teil dieser Arbeit sollten die Effektorzellen der Lunge in vitro untersucht werden. Da bekannt ist, dass in der Lunge Perizyten NO-GC exprimieren, wurde ein Protokoll etabliert, das es ermöglichte, Perizyten spezifisch aus der Lunge zu isolieren und in Kultur zu bringen. Durch den Einsatz von verschiedenen Markern wurden im Anschluss diese isolierten Perizyten weiter charakterisiert. Zum einen konnte festgestellt werden, dass die NO-GC in diesen isolierten Zellen exprimiert wird. Zum anderen stellte sich heraus, dass die Perizyten auch durch einen Marker (SM/MHC) identifiziert werden können, der eigentlich als VSMC-Marker gilt. Diese Daten waren analog zu den In-vivo-Daten von Aue et al. Zusätzlich sollte untersucht werden, ob diese NO-GC- exprimierenden Perizyten in Kultur zu Myofibroblasten differenziert werden können. Dies gelang jedoch nicht durch Stimulation mit TGF-β1.
Im zweiten Teil dieser Arbeit sollte herausgefunden werden, in welchen Zellen in der Leber die NO-GC exprimiert wird. Es konnte in vivo gezeigt werden, dass die NO-GC in der Leber in den HSC exprimiert wird. Da bekannt ist, dass die NO-GC Einfluss auf die Organfibrose nimmt, sollte die NO-GC-Expression in der Leberfibrose untersucht werden. Dabei konnte festgestellt werden, dass es zu einer gesteigerten NO-GC-Expression in der CCl4-induzierten Leberfibrose kommt. Diese war vor allem in den Myofibroblasten lokalisiert – den Zellen, die wahrscheinlich für den übermäßigen Einbau der EZM sorgen. Um den Einfluss der NO-GC auf die Leberfibrose genau- er zu untersuchen, wurde die Fibrose zwischen WT- und GCKO-Tieren verglichen. Dabei konnte beobachtet werden, dass es in den GCKO-Tieren zu einer stärkeren Fibrose als in WT-Tieren kam, die sich durch eine vermehrte Einlagerung von Kollagen und einer erhöhten Expression von TGF-β1 auszeichnete. Damit konnte nachgewiesen werden, dass die NO-GC eine wahrschein- lich protektive Rolle in der Leberfibrose einnimmt.
Im dritten Teil dieser Arbeit wurde die Rolle der HSC in der Leberfibrose genauer untersucht. Dabei konnte zum ersten mal festgestellt werden, dass sich die HSC in Subpopulation unter- teilen lassen. Durch den Einsatz von Reportermäusen, bei denen unter dem SM/MHC- oder PDGFRβ-Promotor das Flurophor tdTomato exprimiert wurde, ließen sich die HSC in 3 Subpo- pulationen einteilen: (1) SM/MHC-Tomato− und PDGFRβ-Tomato−; (2) SM/MHC-Tomato− und PDGFRβ-Tomato+ und (3) SM/MHC-Tomato+ und PDGFRβ-Tomato−. Durch Lineage-Tracing- Versuche konnte den beschriebenen Subpopulationen Aufgaben in der Leberfibrose und in deren Auflösung zugeordnet werden. Die Subpopulation 1 ist in der gesunden Leber hauptsächlich in den Zonen 2 und 3 des Leberazinus lokalisiert. In der Fibrose wandern diese Zellen zu den fibrotischen Regionen und differenzieren dort zu Myofibroblasten. In der Auflösung der Fibrose verschwinden diese Zellen durch Apoptose aus der Leber. Die HSC-Subpopulation 2 befindet sich in der gesunden Leber in der Zone 1 des Leberazinus. Auch in und nach Auflösung der Leberfibrose verweilen diese Zellen dort. Zwar befindet sich die HSC-Subpopulation 3 in der ge- sunden Leber ebenfalls nur in Zone 1 des Leberazinus, jedoch wandern die Zellen in der Fibrose in die Zone 2 und 3 und ersetzen dort die HSC-Subpopulation 1, die in die fibrotische Region gewandert ist. Nach Auflösung der Leberfibrose hat die HSC-Subpopulation 3 die Population 1 vollständig ersetzt.
Nach Identifizierung der HSC-Subpopulationen stellte sich die Frage, ob ein spezifischer Aus- schnitt der NO-GC zu einer veränderten Leberfibrose führt im Vergleich zum WT. Dazu wurde unter dem SM/MHC- und PDGFRβ-Promotor die NO-GC deletiert und die Fibrose in diesen Knockouts untersucht. Während bei der Deletion der NO-GC unter dem PDGFRβ-Promotor kein Unterschied im Vergleich zum WT gesehen werden konnte, ließ sich beim SM/MHC-GCKO Unterschiede feststellen. Durch den Ausschnitt der NO-GC in den Zellen der HSC-Subpopulation 3 kam es zu einer verringerten Expression von PPARγ in der gesunden Leber. Da PPARγ als Gegenspieler von TGF-β1 fungiert, konnte eine erhöhte TGF-β1-Expression in der gesunden und fibrotischen Leber des SM/MHC-GCKO im Vergleich zum WT-Tier gesehen werden. Diese Ergebnisse sprechen dafür, dass die NO-GC über die Steuerung des PPARγ ihren protektiven Effekt auf die Leberfibrose ausübt.