Refine
Has Fulltext
- yes (2)
Is part of the Bibliography
- yes (2)
Document Type
- Doctoral Thesis (2)
Keywords
- nucleus (2) (remove)
Institute
- Institut für Anatomie und Zellbiologie (2) (remove)
Der plasmamembran assoziierte Transportregulator RS1 bindet Ubiquitin und gelangt in den Zellkern
(2001)
Die vorliegende Arbeit liefert wichtige Erkenntnisse über die subzelluläre Verteilung und die Funktion des RS1-Proteins vom Schwein (pRS1), einem Regulator von Plasmamembran-transportern. Das grün fluoreszierende Protein (GFP) wurde mit pRS1 fusioniert und in LLC-PK1 Zellen exprimiert. Das GFP-pRS1 Fusionsprodukt (96 kD) konnte an der Plasmamembran, im Zytosol und im Zellkern entdeckt werden. Bei GFP-Fusion mit trunkierten pRS1-Proteinen zeigte sich, dass der C-Terminus die Kernlokalisierung beeinflusst. Dagegen wurde die Kernlokalisierung durch eine Trunkierung des N-Terminus nicht gestört. Im C-Terminus des pRS1 konnte von AS 579 bis 616 eine Ubiquitin associated domain (UBA) identifiziert werden, die auch in den anderen bisher bekannten RS1-Proteinen aus Mensch, Kaninchen und Maus konserviert vorliegt. Eine Ubiquitin-Affinitätschromatographie zeigte, dass das pRS1-Protein Ubiquitin auf nicht kovalente Weise bindet. Nach der Trunkierung der UBA-Domäne war keine Wechselwirkung des pRS1-Proteins mit Ubiquitin mehr feststellbar. Ein konserviertes Di-Leucin-Endozytose-Motiv (pRS1 AS 366/67) deutet eine Funktion des pRS1-Proteins bei der Internalisierung von Plasmamembranproteinen an. Deshalb wurde das Endozytoseverhalten von pRS1 überexprimierenden LLC-PK1 Zellen untersucht, wobei sich zeigte, dass diese Zellen eine deutlich höhere Aufnahme des Endozytosefarbstoffes RH 414 aufwiesen als Zellen, die pRS1 nicht überexprimierten. Die in dieser Arbeit gesammelten Daten zum RS1-Protein wurden zusammen mit früher erhobenen Ergebnissen zum RS1-Protein im Rahmen eines Modells zusammengefasst. In diesem hypothetischen Modell wird angenommen, dass RS1 ein Adapterprotein ist, welches die ubiquitinabhängige Endozytose von Plasmamembrantransportern vermittelt und als Signalmolekül in den Zellkern gelangen kann, wo es an der Transcriptionsrepression des SGLT1 beteiligt ist.
The RS1 protein (gene RSC1A1) participates in regulation of Na+-D-glucose cotransporter SGLT1 and some other solute carriers. In subconfluent LLC-PK1 cells, RS1 inhibits release of SGLT1 from the trans-Golgi network and transcription of SGLT1. In subconfluent cells, RS1 is localized in the nucleus and the cytoplasm whereas confluent cells contain predominantly cytoplasmic RS1. In the present study, the mechanism and regulation of confluence-dependent nuclear location of RS1 was investigated. Confluence dependent nuclear location of RS1 was shown to be regulated by the cell cycle. A nuclear shuttling signal (NS) in pRS1 was identified that ensures confluence-dependent distribution of pRS1 and comprises nuclear localization signal (NLS) and nuclear export signal (NES). The NLS and NES of RS1 mediate translocation into and out of the nucleus via importin ß1 and CRM1, respectively, and the nuclear/cytoplasmic distribution of the RS1 protein is determined by the nuclear export activity. The adjacent protein kinase C (PKC) phosphorylation site at serine 370 of pRS1 was shown to control nuclear localization driven by NS and is necessary for the differential localization of RS1 in quiescent versus proliferating cells. Basing on the data of site-directed mutagenesis, PKC activation experiments and mass spectrometry analysis of RS1 phosphorylation, the following model of the regulation of RS1 nuclear location in LLC-PK1 cells was proposed. In subconfluent cells, RS1 is actively imported into the nucleus whereas nuclear export of RS1 is not active leading to accumulation of RS1 in the nucleus. After confluence, phosphorylation of serine 370 of pRS1 by PKC takes place leading to enhancement of RS1 nuclear export and predominantly cytoplasmic distribution of the protein in the confluent cells. The confluence-dependent regulation of RS1 localization may control SGLT1 expression during regeneration of enterocytes in small intestine and during regeneration of renal tubular cells after hypoxemic stress. Moreover, the gene expression profiling of mouse embryonic fibroblasts with RS1-/- genotype suggests that transcriptional regulation by RS1 might be important for the cell cycle and cell division. Since RS1 localization depends on the cell cycle, RS1 might play a role in the regulation of the solute carriers during specific phases of the cell cycle.