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Inhaltsübersicht zum Schwerpunktthema: - Die Zelle: Signale, Membranen und Moleküle - Charakterisierung der Durchlässigkeit von Membranfiltern - Kernporen: Transportkanäle für den Kern-Cytoplasma Austausch - Zelltransformation: Verlust der Ordnung - G-Proteine: Zentrale Schaltstellen für Wirkungen von Hormonen und Arzneimitteln - Beteiligung genetischer Faktoren an Tumorprozessen - Wachstum und Anpassung von Pflanzen u.a.
Inhaltsübersicht zum Schwerpunktthema: - Genexpression in Vertebraten-Zellen - Funktionsanalyse von Genen mittels gezielter Keimbahn-Mutagenese in Mäusen - Zellkooperation bei der Immunreaktion - Die transkriptionelle Kontrolle von Lymphokin-Genen - Selenocystein-tRNA und die Funktion von Selen in menschlichen Zellen - Start und Stopp der DNA-Replikation: Wie Gene kontrolliert verdoppelt werden - Antigenerkennung durch T-Lymphozyten - Genexpression und Tumorentstehung: Zuviel des Guten? - Molekularbiologie humaner Coronaviren - Molekulare Mechanismen persistierender Masernvirusinfektionen - Polyomavirus-Infektionen im zentralen Nervensystem - Molekulare Mechanismen von intrazellulären Bakterien - Über "simple" und "komplexe" Retroviren - Hilfe für die Zelle im Kampf mit dem AIDS-Virus u.a.
Ziel der Arbeit war es, die wissenschaftlichen und technischen Voraussetzungen zu schaffen, um eine effiziente Elektroporation von großen aber auch kleinen Zellzahlen zu erreichen. Ein großer Teil der Arbeit diente der Entwicklung eines neuen Elektroporationsgerätes, des Multiporators. Die synergetischen Effekte dieser Technik tragen dazu bei, dass sehr hohe Ausbeuten bei der Elektrotransfektion von Zellen erzielt werden. Damit konnte zum ersten Mal der Gentransfer durch künstliche Säugerzell-Chromosomen (MACs) nachgewiesen werden. Eine weitere Anwendung der Elektroporation liegt in der Transfektion von primären Zellen. Dabei ist der entscheidende Punkt für eine hohe Transfektionseffizienz der Zellzyklus. Des Weiteren wurde in dieser Arbeit ein Konzept entwickelt, das als Basis für ein neues Elektroporationssystem benutzt werden kann.
Inhaltsübersicht zum Schwerpunkthema: - Das Biozentrum, eine Erfolgsgeschichte - In der Lehre wird das Maximum herausgeholt - Wenn die Nerven versagen - Wie Pilze Pflanzen erkennen - Auf der Suche nach Wörtern in der Sprache des Lebens - Im Erbgut der Ratte lag die Antwort - Wandernde Zellen hüllen unreife Herzen ein - Fyn lässt Melanom-Zellen wandern und sich teilen - Von der Farbmakierung zum RFID-Chip u. a.
Die Entwicklung und Zulassung von Arzneimitteln sowie die Bewertung von Xenobio-tika erfordern eine Reihe von Testsystemen zur Toxizitätsermittlung. Für die Überprüfung der Gentoxizität stehen eine Vielzahl etablierter Testsysteme zur Verfügung, die oft auf Krebszelllinien basieren. Krebszelllinien haben jedoch die Eigenschaft, neben den für die Testung notwendigen Veränderungen weitere Veränderungen zu tragen, die zu Reaktionen führen können, wie sie in den Primärzellen des Organismus nicht auftreten. Daher ist die Kenntnis des genetischen Hintergrunds der verwendeten Krebszelllinien wertvoll, um Testergebnisse bewerten und gentoxische Risikopotentiale abschätzen zu können. Die Mauslymphomzelllinie L5178Y nimmt unter den auf Krebszellen basierenden Testsystemen eine besondere Stellung ein, da sie die weltweit in der Gentoxizi-tätsprüfung am häufigsten eingesetzte Zelllinie ist. In der vorliegenden Arbeit wurde in dieser Zellllinie eine Veränderung nachgewiesen, die das Mismatch-Reparatur-System (MMR-System) betrifft. Bei der MMR handelt es sich um einen Mechanismus, der daran beteiligt ist, die Integrität des Genoms zu gewährleisten. In MMR-profizienten Zellen werden Fehler in der DNA, die bei der Replikation, der homologen Rekombination oder durch äußere gentoxische Einwirkungen entstehen, entweder erkannt und repariert, oder die geschädigten Zellen werden durch die Induktion von Apoptosen eliminiert. Im Gegensatz dazu überleben MMR-defiziente Zellen trotz gravierender DNA-Schäden und akkumulieren diese. In der vorliegenden Arbeit wurde die Akkumulierung von Genomschäden bei L5178Y-Zellen als Reaktion auf Behandlung mit alkylierenden Agenzien beobachtet, während andere Vergleichszelllinien Apoptosen induzierten. Dieses Verhalten der L5178Y-Zellen, das in der Literatur bei MMR-defizienten Zellen für alkylierende Agenzien beschrieben ist, führte zu der Vermutung, dass die L5178Y-Zellen einen MMR-defizienten Phänotyp aufweisen. Dieser MMR-defiziente Phänotyp wurde durch gezielte Behandlung von L5178Y-Zellen und Zellen mit bekanntem MMR-Status mit dem alkylierenden Agenz MNNG und dem anschließenden Vergleich der Reaktionen geprüft und bestätigt. Der Ver-gleich erfolgte durch den Nachweis gentoxischer Effekte im Mikrokern-Test und im Comet Assay. Auf Proteinebene konnte für den gezeigten MMR-defizienten Phänotyp bei den drei wichtigsten, in die MMR involvierten Proteine, MLH1, MSH2 und MSH6 keine Ursa-che gefunden werden: Alle untersuchten Proteine zeigten eine Expression, die mit denen der MMR-profizienten Kontrollzelllinien vergleichbar war. Auf DNA-Ebene wurde durch die Analyse aller bekannter, in die MMR involvierter Gene durch die Sequenzierung der kodierenden Bereiche als wichtigste Verände-rung eine Insertions-Mutation (964(insC)) in pms2 gefunden. Diese führt nach 260 Aminosäuren zu einer Leserasterverschiebung und nach 313 Aminosäuren zu einem Abbruch der Aminosäuresequenz aufgrund eines Stop-Codons. Zwar ist somit die Information für den N-terminalen Bereich von PMS2, der die DNA-Bindedomäne und die ATP-ase aktiven Stellen beinhaltet, vorhanden, die für den C-Terminus hingegen, der für die Dimerisierung mit dem MMR-Protein MLH1 und damit für die Funktion essentiell ist, fehlt. Insgesamt wurde in dieser Arbeit gezeigt, dass die L5178Y-Zelllinie MMR-defizient ist. Mit der Insertions-Mutation (964(insC)) in pms2 wurde eine molekulare Ursache gefunden, die diese Defizienz erklären kann. Daraus folgt für den Einsatz der L5178Y-Zelllinie in Gentoxizitätstests, dass die Berücksichtigung ihrer MMR-Defizienz die Möglichkeit der Bewertung von Testergebnissen erheblich erweitern kann.
Precise control of mitotic progression is vital for the maintenance of genomic integrity. Since the loss of genomic integrity is known to promote tumorigenesis, the identification of knew G2/M regulatory genes attracts great attention. LINC, a human multiprotein complex, is a transcriptional activator of a set of G2/M specific genes. By depleting LIN9 in MEFs, a core subunit of LINC, Gas2l3 was identified as a novel LINC target gene. The so far uncharacterized Gas2l3 gene encodes for a member of the family of growth arrest specific 2 (GAS2) proteins, which share a highly conserved putative actin binding CH and a putative microtubule binding GAS2 domain. In the present study GAS2L3 was identified as a LINC target gene also in human cells. Gene expression analysis revealed that GAS2L3 transcription, in contrast to all other GAS2 family members, is highly regulated during the cell cycle with highest expression in G2/M. The GAS2L3 protein showed a specific localization pattern during the M phase: In metaphase, GAS2L3 localized to the mitotic spindle, relocated to the spindle midzone microtubules in late anaphase and concentrated at the midbody in telophase where it persisted until the end of cytokinesis. Overexpression of a set of different GAS2L3 deletion mutants demonstrated that the localization to the mitotic microtubule network is dependent on the C-terminus, whereas the midbody localization is dependent on full length GAS2L3 protein. Additionally, exclusive overexpression of the CH domain induced the formation of actin stress fibers, suggesting that the CH domain is an actin binding domain. In contrast, the GAS2 domain was neither needed nor sufficient for microtubule binding, indicating that there must be an additional so far unknown microtubule binding domain in the C-terminus. Interestingly, immunoblot analysis also identified the C-terminus as the domain responsible for GAS2L3 protein instability, partially dependent on proteasomal degradation. Consistent with its specific localization pattern, GAS2L3 depletion by RNAi demonstrated its responsibility for proper mitosis and cytokinesis. GAS2L3 depletion in HeLa cells resulted in the accumulation of multinucleated cells, an indicator for chromosome mis-segregation during mitosis. Also the amount of cells in cytokinesis was enriched, indicating failures in completing the last step of cytokinesis, the abscission. Strikingly, treatment with microtubule poisons that lead to the activation of the spindle assembly checkpoint (SAC) indicated that the SAC was weakened in GAS2L3 depleted cells. Although the exact molecular mechanism is still unknown, fist experiments support the hypothesis that GAS2L3 might be a regulator of the SAC master kinase BUBR1. In conclusion, this study provides first evidence for GAS2L3 as a novel regulator of mitosis and cytokinesis and it might therefore be an important guardian against tumorigenesis.
Platelet activation and adhesion results in thrombus formation that is essential for normal hemostasis, but can also cause irreversible vessel occlusion leading to myocardial infarction or stroke. The C-type lectin-like receptor 2 (CLEC-2) was recently identified to be expressed on the platelet surface, however, a role for this receptor in hemostasis and thrombosis had not been demonstrated. In the current study, the involvement of CLEC-2 in platelet function and thrombus formation was investigated using mice as a model system. In the first part of the thesis, it was found that treatment of mice with a newly generated monoclonal antibody against murine CLEC-2 (INU1) led to the complete and highly specific loss of the receptor in circulating platelets (a process termed “immunodepletion”). CLEC-2-deficient platelets were completely unresponsive to the CLEC-2-specific agonist rhodocytin, whereas activation induced by all other tested agonists was unaltered. This selective defect translated into severely decreased platelet aggregate formation under flow ex vivo; and in vivo thrombosis models revealed impaired stabilization of formed thrombi with enhanced embolization. Consequently, CLEC-2 deficiency profoundly protected mice from occlusive arterial thrombus formation. Furthermore, variable bleeding times in INU1-treated mice indicated a moderate hemostatic defect. This reveals for the first time that CLEC-2 significantly contributes to thrombus stability in vitro and in vivo and plays a crucial role in hemostasis and arterial thrombosis. Thus, CLEC-2 represents a potential novel anti-thrombotic target that can be functionally inactivated in vivo. This in vivo down-regulation of platelet surface receptors might be a promising approach for future anti-thrombotic therapy. The second part of the work investigated the effect of double-immunodepletion of the immunoreceptor tyrosine-based activation motif (ITAM)- and hemITAM-coupled receptors, platelet glycoprotein (GP) VI and CLEC-2, on hemostasis and thrombosis using a combination of the GPVI- and CLEC-2-specific antibodies, JAQ1 and INU1, respectively. Isolated targeting of either GPVI or CLEC-2 in vivo did not affect expression or function of the respective other receptor. However, simultaneous treatment with both antibodies resulted in the sustained loss of GPVI and CLEC-2 signaling in platelets, while leaving other activation pathways intact. In contrast to single deficiency of either receptor, GPVI/CLEC-2 double-deficient mice displayed a dramatic hemostatic defect. Furthermore, this treatment resulted in profound impairment of arterial thrombus formation that far exceeded the effects seen in single-depleted animals. Importantly, similar results were obtained in Gp6-/- mice that were depleted of CLEC-2 by INU1-treatment, demonstrating that this severe bleeding phenotype was not caused by secondary effects of combined antibody treatment. These data suggest that GPVI and CLEC-2 can be independently or simultaneously down-regulated in platelets in vivo and reveal an unexpected functional redundancy of the two receptors in hemostasis and thrombosis. Since GPVI and CLEC-2 have intensively been discussed as potential anti-thrombotic targets, these results may have important implications for the development of novel, yet save anti-GPVI or anti-CLEC-2-based therapies.