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Untersuchung zur NO/cGMP-Signaltransduktion in der glatten Muskulatur von NO-GC-defizienten Mäusen
(2013)
Die Stickstoffmonoxid (NO)/cGMP-Signaltransduktion besitzt eine entscheidende Rolle bei der Tonusregulation der glatten Muskulatur. Dabei ist NO neben seiner herausragenden Bedeutung für das vaskuläre System einer der wichtigsten inhibitorischen Neurotransmitter im Gastrointestinaltrakt. Die Wirkung von NO beruht hauptsächlich auf der Aktivierung der NO-sensitiven Guanylyl-Cyclase (NO-GC), die aus zwei Untereinheiten aufgebaut ist (α und ß). Die Deletion der ß1-Untereinheit in Mäusen resultiert in einem vollständigen NO-GC-Knockout (GCKO). Im Gastrointestinaltrakt ist die Expression von NO-GC in glatten Muskelzellen (SMC), interstitiellen Zellen von Cajal (ICC) und Fibroblasten-ähnlichen Zellen (FLC) nachgewiesen. In dieser Arbeit wurde die Bedeutung des NO/cGMP-Signalweges für die Regulation von Kontraktion und Relaxation innerhalb dieser drei Zelltypen anhand von zellspezifischen GCKO-Tieren untersucht. SMC- und ICC-spezifische GCKO-Tiere waren bereits vorhanden. FLC-spezifische GCKO-Tiere wurden generiert und mit den vorhandenen ICC- und SMC-GCKO-Linien gekreuzt, um Doppel- und Tripel-Knockout-Tiere zu erhalten. FLC-GCKO-Tiere zeigen eine NO-induzierte Relaxation glattmuskulären Gewebes, die der von WT-Tieren gleicht. Auch Gewebe von FLC/ICC- und FLC/SM-GCKO-Tieren kann durch NO relaxiert werden. Erst die Deletion der NO-GC in allen drei Zelltypen (Tripel-GCKO) führt zu einer Unterbrechung der NO-Relaxation, wie sie aus GCKO-Tieren bekannt ist. Überraschenderweise zeigt sich bei FLC-GCKO-Tieren eine beschleunigte Darmpassagezeit. Die Ergebnisse dieser Arbeit lassen darauf schließen, dass die NO-GC in allen drei Zelltypen des Gastrointestinaltrakts an der nitrergen Signaltransduktion beteiligt ist, wenn auch auf unterschiedliche Weise. Es besteht demnach eine Interaktion zwischen den verschiedenen Zelltypen, die durch weiterführende Versuche mit den vorhandenen Doppel-Knockout-Tieren sowie der Tripel-GCKO-Linie nähergehend untersucht werden muss. Der zweite Teil der Arbeit beschäftigte sich mit der Rolle der NO-GC im unteren Harntrakt. Dort liegt die NO-GC in verschieden Zelltypen vor. In Urethra-Gewebe wird die NO-GC ausschließlich in SMC exprimiert, während sie in der Harnblase einzig in interstitiellen Zellen, nicht aber in SMC, befindet. Funktionell hat dies zur Folge, dass die NO-induzierte Urethra-Relaxation ausschließlich von glatten Muskelzellen vermittelt wird. Die Harnblasenmuskulatur hingegen zeigt keine Relaxation auf NO-Gabe hin. Die Identifizierung der NO-GC-exprimierenden interstitiellen Zellen sowie ihre Funktion sind bislang ungeklärt. In einem dritten Projekt wurden Untersuchungen zur Effektivität der NO-GC-Inhibitoren ODQ und NS2028 durchgeführt. Die Ergebnisse zeigen, dass bei einem Einsatz der Inhibitoren nicht von einer vollständigen Hemmung der NO-GC ausgegangen werden sollte. Drei Faktoren beeinflussen nachhaltig die Inhibitor-Effektivität: (1) die Klasse des NO-Donors, (2) die Inkubationszeit mit dem Inhibitor und dem NO-Donor sowie (3) die Stärke der Vorkontraktion bei Versuchen mit Glattmuskelgewebe. Die Wahl dieser Parameter bestimmt, in welchem Ausmaß ODQ und NS2028 die NO-stimulierte NO GC inhibieren können. Aus diesem Projektteil resultiert, dass man den Einsatz dieser Inhibitoren nicht, wie vielfach in der Literatur vorzufinden, als Beweis für cGMP unabhängige Effekte nutzen sollte.
During the last few years an increasing number of physiological processes in plants have been shown to be regulated by NO. NO plays important roles in growth and development, plant disease resistance, abiotic stress, and in above and underground plant organs. In recent years several enzymatic pathways and few non-enzymatic pathways were proposed for nitric oxide production in plants. The major goal of this work was to quantify NO production by plants and especially by roots, and to identify the enzymes responsible for NO production. As a major method, NO production by roots was followed through on-line measurement of NO emission into the gas phase by chemiluminescence (= direct chemiluminescence), and also by indirect chemiluminescence where trace amounts of oxidized products like NO2- and NO3- can be easily measured. Plants used were tobacco wild-type (N. tabacum cv Xanthi or cv Gatersleben), NR-free mutants grown on ammonium in order to prevent NR induction, plants grown on tungstate to inhibit synthesis of functional MoCo-enzymes, and a NO-overproducing nitrite reductase (NiR)-deficient transformant as well as barley, rice and pea. Induction of a hypersensitive response (HR) in tobacco leaves was achieved by using avirulent Pseudomonas syringae pv phaseolicola. At oxygen concentrations of <1%, even completely nitrate reductase (NR)-free root tissues reduced added nitrite to NO, indicating that in roots, NR was not the only source for nitrite-dependent NO formation. By contrast, NR-free leaf slices were not able to reduce nitrite to NO. Root NO formation was blocked by inhibitors of mitochondrial electron transport (Myxothiazol and SHAM), whereas NO formation by NR containing leaf slices was insensitive to the inhibitors. Consistent with that, mitochondria purified from roots, but not those from leaves, reduced nitrite to NO at the expense of NADH. The inhibitor studies suggest that, in root mitochondria, both terminal oxidases participate in NO formation, and they also suggest that even in NR-containing roots, a large part of the reduction of nitrite to NO was catalysed by mitochondria, and less by NR. The differential capacity of root and leaf mitochondria to reduce nitrite to NO appears to be common among higher plants, since it was observed with Arabidopsis, barley, pea, and tobacco. Nitrite and NADH consumption by mitochondria were also measured. Anaerobic, nitrite-dependent NO emission was exclusively associated with the membrane fraction, without participation of matrix components. It was also examined whether root mitochondria and mitochondrial membranes produce nitric oxide (NO) exclusively by reduction of nitrite or also via a nitric oxide synthase (NOS),- and to what extent direct NO measurements could be falsified by NO oxidation. In addition to chemiluminescence, Diaminofluoresceins (DAF) were used as an NO indicators for comparison. In air, mitochondria apparently produced no nitrite-dependent NO, and no NOS activity was detected by direct or indirect chemiluminescence. In contrast, with DAF-2 and DAR-4M an L-arginine-dependent fluorescence increase took place. However, the response of this apparent NOS activity to inhibitors, substrates and cofactors was untypical when compared with commercial iNOS and is considered an artefact. With iNOS, about 2/3 of the NO were oxidized to (nitrite + nitrate). Mitochondria also appear to consume NO without increasing oxidation to (nitrite+ nitrate). We therefore assume formation of NO to a volatile intermediate (eventually N2O3). It was recently shown that the hypersensitive response (HR) of tobacco triggered by the fungal elicitor cryptogein occurred independent of the presence or absence of nitrate reductase (NR). One conclusion was that NR-dependent NO formation played no role in the HR. Here we present evidence that the described scenario may be specific for cryptogein. Pseudomonas syringae pv. phaseolicola was infiltrated into tobacco leaves from WT plant and from the NiR-deficient NO-overproducing clone 271, grown either on nitrate or ammonium. Lesion development as well as bacterial growth and sugar concentrations in leaves and in the leaf apoplast was monitored. Lesion development was positively and bacterial growth was negatively correlated with nitrate nutrition and eventually with NO formation. Bacterial growth was positively correlated with ammonium nutrition and apoplastic sugar concentrations. Total (free and conjugated) SA content were always drastically increased by bacterial infection, but there was no clear correlation with NO production. In the presence of cryptogein, Pseudomonas growth was drastically reduced. This shows that the assumed interdependence of bacterial growth, NO production and the HR is complex and not unifactorial.