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Background
Cutaneous leishmaniasis (CL) is a neglected tropical disease caused by protozoan parasites of the genus Leishmania. CL causes enormous suffering in many countries worldwide. There is no licensed vaccine against CL, and the chemotherapy options show limited efficacy and high toxicity. Localization of the parasites inside host cells is a barrier to most standard chemo- and immune-based interventions. Hence, novel drugs, which are safe, effective and readily accessible to third-world countries and/or drug delivery technologies for effective CL treatments are desperately needed.
Methodology/Principal
Findings Here we evaluated the antileishmanial properties and delivery potential of polyhexamethylene biguanide (PHMB; polyhexanide), a widely used antimicrobial and wound antiseptic, in the Leishmania model. PHMB showed an inherent antileishmanial activity at submicromolar concentrations. Our data revealed that PHMB kills Leishmania major (L. major) via a dual mechanism involving disruption of membrane integrity and selective chromosome condensation and damage. PHMB's DNA binding and host cell entry properties were further exploited to improve the delivery and immunomodulatory activities of unmethylated cytosine-phosphate-guanine oligodeoxynucleotides (CpG ODN). PHMB spontaneously bound CpG ODN, forming stable nanopolyplexes that enhanced uptake of CpG ODN, potentiated antimicrobial killing and reduced host cell toxicity of PHMB.
Conclusions
Given its low cost and long history of safe topical use, PHMB holds promise as a drug for CL therapy and delivery vehicle for nucleic acid immunomodulators.
Cutaneous leishmaniasis is endemic in tropical and subtropical regions of the world. Effective vaccination strategies are urgently needed because of the emergence of drug-resistant parasites and severe side effects of chemotherapy. The research group of Heidrun Moll previously established a DC-based vaccination strategy to induce complete and long-lasting immunity to experimental leishmaniasis using LmAg-loaded and CpG ODN-activated DC as a vaccine carrier. Prevention of tissue damages at the site of L. major inoculation can be achieved if the BALB/c mice were systemically given LmAg-loaded BMDC that had been exposed to CpG ODN. The interest in further exploring the role of IL-4 aroused as previous studies allowed establishing that IL-4 was involved in the redirection of the immune response towards a type 1 profile. Thus, wt BALB/c mice or DC-specific CD11ccreIL-4Rα-/lox BALB/c mice were given either wt or IL-4Rα-deficient LmAg-loaded BMDC exposed or not to CpG ODN prior to inoculation of 2 x 105 stationary phase L. major promastigotes into the BALB/c footpad. The results provide evidence that IL4/IL-4Rα-mediated signaling in the vaccinating DC is required to prevent tissue damages at the site of L. major inoculation, as properly conditioned wt DC but not IL-4Rα-deficient DC were able to confer resistance. Furthermore, uncontrolled L. major population size expansion was observed in the footpad and the footpad draining LN in CD11ccreIL-4Rα-/lox mice immunized with CpG ODN-exposed LmAg-loaded IL-4Rα-deficient DC, indicating the influence of IL-4R-mediated signaling in host DC to control parasite replication. In addition, no footpad damage was observed in BALB/c mice that were systemically immunized with LmAg-loaded wt DC doubly exposed to CpG ODN and recombinant IL-4. Discussing these findings allow the assumption that triggering the IL4/IL4Rα signaling pathway could be a precondition when designing vaccines aimed to prevent damaging processes in tissues hosting intracellular microorganisms.
Dendritische Zellen stellen ein essentielles Bindeglied zwischen angeborener und adaptiver Immunität dar. Sie stammen aus dem Knochenmark und bilden ein Netzwerk von heterogenen Zellpopulationen. In peripheren Geweben liegen sie als unreife Zellen mit einem hohen Potential zur Aufnahme und Prozessierung von Mikroorganismen vor. Nach der Aufnahme von eindringenden Mikroorganismen beginnen dendritische Zellen jedoch, sich von einem prozessierenden in ein präsentierendes Stadium zu differenzieren, und wandern zu den sekundären lymphatischen Organen, um dort den naïven T-Zellen die mikrobiellen Antigene zu präsentieren. Die gerichtete Wanderung von dendritischen Zellen ist hierbei ein zentraler Bestandteil der immunstimulatorischen und -modulatorischen Funktion dieser Zellen. Eine essentielle Rolle bei diesem Migrationsverhalten spielen chemotaktische Zytokine (Chemokine). Chemokine sind Proteine mit einem niedermolekularen Gewicht (8-10 kDa), welche anhand ihres strukturellen Cysteinmotifs in vier Gruppen unterteilt und entweder als CXC-, CC-, C- und CX3C- Chemokine oder als α-, β-, δ- und γ-Chemokine bezeichnet werden. Arbeiten der eigenen Arbeitsgruppe am Modell der kutanen Leishmaniose haben jedoch gezeigt, dass die Funktion von Chemokinen weitaus mehr umfasst, als lediglich die zielgerichtete Steuerung der Migration immunologisch wichtiger Zellen. So konnte in diesen Studien nicht nur gezeigt werden, dass das Muster der Expression von Chemokinen mit der Schwere des Krankheitsbildes korreliert, sondern auch, dass das Chemokin CCL2/MCP-1 in der Lage ist, einen direkten Einfluss auf die intrazelluläre Erregerabwehr zu nehmen. Diese Arbeiten bezogen sich jedoch auf humane Hautbiopsien und aus Humanblut isolierten Zellen. Eine detaillierte Analyse des Infektionsverlaufes unter definierten Bedingungen (konstante Infektionsdosis und -art, kontrollierte Infektionsdauer, Verwendung von klonierten Parasiten, einheitlicher genetischer Hintergrund des Wirts) ist bei Patienten jedoch nicht möglich. Deshalb wurde die experimentelle Leishmanieninfektion von Inzuchtmäusen (suszeptible BALB/c- und resistente C57BL/6-Mäuse) herangezogen, um die Kinetik der Chemokinexpression und deren Korrelation mit dem Verlauf der kutanen Leishmaniose zu bestimmen. Die Arbeiten dieser Doktorarbeit zeigen erstmals, dass ebenso wie im humanen System bei der experimentellen Leishmaniose in der Maus die Fähigkeit zur Abwehr dieses Erregers mit einer verstärkten Expression von CCL2/MCP-1 in der infizierten Haut korreliert. Des Weiteren konnte zwar eine CCL2/MCP-1-induzierte leishmanizide Wirkung in murinen Makrophagen festgestellt werden, ein vergleichbarer Effekt blieb bei Langerhans-Zellen, den dendritischen Zellen der Haut, jedoch aus. Weiterhin sollte der Einfluss einer Leishmanieninfektion auf das CCL2/MCP-1- induzierte Wanderungsverhalten von Langerhans-Zellen untersucht werden, da aus der Literatur bekannt ist, dass das Chemokin CCL2/MCP-1 die Migration dendritischer Zellen induziert. Die Studien der Doktorarbeit ergaben hierbei, dass eine Infektion mit Leishmania major zu einer signifikanten Verminderung der durch CL2/MCP-1 oder CCL3/MIP-1α induzierten Migration von Langerhans-Zellen führt. Eine mögliche Ursache für dieses Resultat war hierbei in dem Einfluss einer Infektion mit Leishmanien auf die Expression von Chemokinrezeptoren in dendritischen Zellen zu finden. Anschließende Untersuchungen der mRNA-Expression dieser Rezeptoren konnten diese Vermutung bestätigen. So wurde nach einer Infektion von dendritischen Zellen mit L. major eine Reduktion der mRNA-Expression der Chemokinrezeptoren CCR2 und CCR5 festgestellt. Anschließende FACS-Analysen und Studien mit Hilfe des konfokalen Lasermikroskops führten zu einem ähnlichen Resultat. Interessanterweise bewirkt die Infektion mit L. major andererseits eine Hochregulation der mRNA-Expression von CCR7 in dendritischen Zellen. Von diesem Rezeptor ist bekannt, dass er die Chemokine CCL19/MIP-3β und CCL21/6Ckine, welche im Lymphknoten konstitutiv exprimiert werden, mit großer Affinität bindet und für die zielgerichtete Migration dendritischer Zellen in dieses Organ essentiell ist. Weitere Versuche ergaben zudem eine verstärkte CXCL10/IP-10-mRNA-Expression in dendritischen Zellen aus L. major-resistenten C57BL/6-Mäusen, welche bei dendritischen Zellen aus BALB/c-Mäusen nicht festgestellt worden ist. Zusammenfassend konnte in dieser Doktorarbeit gezeigt werden, dass eine Infektion dendritischer Zellen mit L. major sowohl bei suszeptiblen als auch bei resistenten Mäusen zu einer Modulation der Expression von Chemokinrezeptoren führt, die sowohl für die Lokalisation der Zellen in den entzündeten Hautarealen verantwortlich sind (CCR2 und CCR5), als auch ihre Wanderung in die Lymphknoten steuern CCR7). Darüber hinaus lässt die wirtsspezifische Modulation des Chemokins CXCL10/IP-10 in resistenten Tieren vermuten, dass sie zur Kontrolle der Infektion beiträgt.