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Marine Schwämme (Phylum Porifera) sind sessile Invertebraten, deren Biomasse bis zu 60% aus Mikroorganismen bestehen kann. Während die mikrobielle Diversität in Schwämmen in den letzten Jahren recht gut beschrieben wurde, weiß man noch sehr wenig über mögliche Funktionen und Interaktionen zwischen Schwamm-assoziierten Mikroorganismen mit ihren Wirten. Das Ziel dieser Promotionsarbeit war es, den Prozess der mikrobiellen Nitrifikation im bakterienhaltigen Mittelmeerschwamm Aplysina aerophoba nachzuweisen und im Kontext der Symbiose näher zu untersuchen. Die Nitrifikation beschreibt die zweistufige Oxidation von Ammoniak zu Nitrit und weiter zu Nitrat und wird von bestimmten Mikroorganismen zur Energiegewinnung durchgeführt. Um dieser Fragestellung nachzugehen, wurden physiologische Untersuchungen an lebenden Schwämmen während Freilandexkursionen nach Rovinj (Kroatien) durchgeführt. Frisch gesammelte Schwämme wurden zu unterschiedlichen Jahreszeiten in experimentellen Aquarien jeweils über einen Zeitraum von über 24 Stunden gehältert. Die Konzentrationen von Ammonium, Nitrit und Nitrat wurden in Zeitintervallen mittels photometrischer Nachweise gemessen und die Aufnahme- und Exkretionsraten berechnet. Nitrit wurde in keinem der Experimente messbar ausgeschieden. Ammonium, als natürliches Stoffwechselendprodukt mariner Schwämme, wurde von A. aerophoba in Raten ausgeschieden, die saisonal variabel waren. Im Frühjahr wurde keine Ammonium-ausscheidung beobachtet während die Exkretionsrate zum Sommer hin stetig anstieg. Nitrat, welches natürlicherweise nur durch mikrobielle Nitrifikation entstehen kann, wurde saisonunabhängig konstant ausgeschieden. Ammoniumaufnahme-Experimente zeigten auf, dass Ammonium im Frühjahr rasch aufgenommen wurde und dass Ammonium die Nitratexkretionsrate bis zu vierfach stimulierte, wohingegen im Sommer keine Ammoniumaufnahme und keine Stimulation der Nitratexkretion stattfanden. Durch Zugabe des spezifischen Inhibitors der Nitrifikation, Nitrapyrin, konnte die Nitratexkretion in A. aerophoba vollständig gehemmt werden. Im Gegensatz zu bakterienhaltigen Schwämmen zeigten sogenannte bakterienfreie Schwämme erwartungsgemäß keine Nitratausscheidung. Das 16S rRNA- und das amoA-Gen wurden als molekulare Marker verwendet, um nitrifizierende Mikroorganismen in Schwämmen phylogenetisch zu identifizieren. Es konnten zahlreiche 16S rRNA-Gene aus insgesamt sechs Schwammarten inklusive Aplysina aerophoba amplifiziert und dem marinen Nitrosospira Cluster 1 zugeordnet werden. Aus A. aerophoba konnten auch Nitrosospira amoA-Gensequenzen gewonnen werden. Archaeale 16S rRNA- und amoA-Gensequenzen wurden ebenfalls aus A. aerophoba gewonnen, wobei die 16S rRNA-Gene mit anderen aus Schwämmen stammenden Sequenzen ein Schwamm-spezifisches Cluster innerhalb der Crenarchaea Gruppe I.1A bildeten. Unter Verwendung spezifischer Fluoreszenz-markierter 16S rRNA Sonden konnten den Nitrosospira Cluster 1 und Crenarchaea Gruppe 1 zugehörige Zellen innerhalb des mikrobiellen Konsortiums aus A. aerophoba nachgewiesen werden. Basierend auf der geschätzten Menge nitrifizierender Mikroben in der Schwammmesohylmatrix und den Nitratexkretionsraten wurde eine zellspezifische Ammoniakoxidationsrate von 1,6 fmol Zelle-1 h-1 errechnet. Der Nachweis von 16S rRNA- oder funktionellen Genen des anaeroben mikrobiellen N-Kreislaufs in A. aerophoba verlief negativ. Darüber hinaus wurde eine in vorherigen Arbeiten aus dem mit A. aerophoba assoziierten mikrobiellen Konsortium erstellte Metagenombank auf das Vorhandensein von funktionellen (amoA) Nitrosospira- und Crenarchaea-Genen untersucht. Aus der Sequenzierung des archaealen Metagenomklons 58F6 resultierte die Sequenz des kompletten AMO-Operons eines möglicherweise Schwamm-spezifischen Crenarchaeoten. Diese Ergebnisse liefern erste funktionelle Einblicke in die komplexen Stoffflüsse und Wechselwirkungen zwischen Schwämmen und den mit ihnen assoziierten mikrobiellen Konsortien. Aufgrund dieser Arbeit wurde ein Modell des Stickstoffkreislaufs in A. aerophoba erstellt, welches die Mikroorganismen mit möglichen Stoffwechselfunktionen in dem Wirtsschwamm verknüpft. Diese Arbeit trägt zu dem Informationsstand über die Interaktionen zwischen Schwämmen und Mikroorganismen bei und leistet einen Beitrag zur Aufklärung des Stickstoffkreislaufs in A. aerophoba.
Schwämme (Phylum Porifera) sind der älteste rezente Tierstamm der Erde. Insbesondere marine Vertreter dieser sessilen Invertebraten sind oftmals mit einem mikrobiellen Konsortium assoziiert, welches hochgradig wirtsspezifisch und phylogenetisch divers ist. Die Biomasse dieser Mikroflora kann dabei rund die Hälfte der Masse eines Schwamms ausmachen. Die Komplexität des Konsortiums sowie der Mangel an kultivierbaren Vertretern der Schwamm-spezifischen Kladen erschwert dabei eine gezielte funktionelle Charakterisierung. Von besonderem Interesse hierbei ist das exklusiv in marinen Schwämmen vorzufindende Candidatus Phylum Poribacteria, für das bislang kein kultivierter Vertreter vorliegt. Die metabolisch aktiven und hochabundanten Poribakterien liegen in der extrazellulären Matrix des Schwammes vor und zeichnen sich durch das Vorhandensein einer Nukleoid-ähnlichen intrazellulären Struktur aus. Ziel dieser Promotionsarbeit war es, neue Einzelzell-basierte Methoden auf das Gebiet der funktionellen Charakterisierung von Bakterien anzuwenden, welche spezifisch mit dem mediterranen Schwamm Aplysina aerophoba assoziiert sind. Dabei wurden sowohl kultivierungs-abhängige, als auch kultivierungs-unabhängige Versuchsansätze verfolgt. Das Hauptaugenmerk dieser Studien lag dabei auf dem Candidatus Phylum Poribacteria. Während auf dem ‚dilution-to-extinction‘-Prinzip beruhende Hochdurchsatz-Kultivierungen nicht zum Erhalt einer Schwammsymbionten-Reinkultur führten, konnten durch eine Kombination aus FACS-Vereinzelung von Schwamm-assoziierten Bakterien und anschließenden Einzel-Genom-Amplifizierungen (‚whole genome amplifications‘) umfassende Einblicke in die metabolischen Kapazitäten von Schwammsymbionten gewonnen werden. Ferner gelang durch die Anwendung dieser neuen kultivierungs-unabhängigen Methode eine spezifische Verknüpfung von Phylogenie und Funktion Schwamm-assoziierter, nicht-kultivierbarer Bakterien. So konnte im Rahmen dieser Dissertation eine neue nicht-ribosomale Peptidsynthetase (NRPS) einem Vertreter einer Schwamm-spezifischen Chloroflexi-Klade zugewiesen werden. Ferner gelang die Zuordnung einer exklusiv in marinen Schwämmen vorgefundenen Polyketidsynthase (Sup-PKS) zu den Poribacteria. Die Klonierung von hochmolekularer, Einzel-Genom-amplifizierter DNA in Cosmide gewährte zudem Einblicke in den genomischen Kontext dieser, mit dem bakteriellen Sekundärmetabolismus assoziierten Gene. Die Pyrosequenzierung eines amplifizierten, von einem einzelnen Poribakterium abstammenden Genoms führte zudem zum Erhalt von rund zwei Megabasen an genetischer Information über diese Schwammsymbionten. Dadurch wurden detaillierte Informationen über den poribakteriellen Primär- und Sekundärstoffwechsel gewonnen. Die Auswertung der automatisch annotierten 454-Daten erlaubte die Rekonstruktion von Stoffwechselwegen, so z.B. der Glykolyse oder des Citratzyklus und bestätigte das Vorhandensein eines Sup-PKS-Gens im poribakteriellen Genom. Ferner konnten Gemeinsamkeiten mit den Schwesterphyla Planctomycetes, Chlamydiae und Verrucomicrobia gefunden werden. Zudem zeigte die vergleichende Analyse mit einem poribakteriellen Referenzklon aus einer bestehenden Metagenombank die genomische Mikroheterogenität innerhalb dieses Phylums. Nicht zuletzt konnte die Auswertung der poribakteriellen 454-Sequenzierung eine Reihe von möglichen Symbiose-Determinanten aufdecken, die beispielsweise am Austausch von Metaboliten zwischen den Interaktionspartnern beteiligt sind. Die Ergebnisse dieser Dissertationsarbeit stellen die Basis für eine gezielte und detaillierte funktionelle Beschreibung einzelner Bakterien innerhalb komplexer mikrobieller Konsortien dar, wie sie in marinen Schwämmen vorzufinden sind. Dieser Studie gewährte erstmalig umfassende Einblicke in das genomische Potential der nicht-kultivierten, Schwamm-assoziierten Poribacteria. Weiterführende Einzelzell-basierte Experimente werden in Zukunft dazu beitragen, das Bild von der Interaktion zwischen Bakterien und eukaryontischen Wirten zu komplettieren.