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Die Blut-Hirn-Schranke (BHS) stellt eine wichtige Barriere zwischen dem Blutsystem und dem Gehirngewebe dar. An der Bildung dieser Barriere sind hauptsächlich die Endothelzellen der Blutkapillaren beteilig. Dabei verschließen die Tight Junction Proteine und die Adherens Junction Proteine den interzellulären Spalt zwischen zwei benachbarten Endothelzellen. Dieser Verschluss sorgt dafür, dass keine Noxen aus dem Blut in das Zentralnervensystem gelangen können. Damit jedoch der Transport wichtiger Nährstoffe in das ZNS und der Abtransport von Abfallprodukten aus dem ZNS gewährleistet sind, sind spezielle Rezeptoren und Transporter notwendig. Diese sorgen auch dafür, dass in die Endothelzellen eingedrungene schädliche Substanzen wieder zurück in das Blutsystem befördert werden. Dafür sind Effluxpumpen, Proteine der Solute Carrier Familie und zelluläre Rezeptoren verantwortlich.
Die immortalized mouse cerebral/cerebellar capillary endothelial cells (cEND/cerebEND) Modellsysteme sind in-vitro Modellsysteme der BHS und wurden in der AG: Förster in der Anästhesiologie im Universitätsklinikum Würzburg bereits erfolgreich isoliert und schon dazu benutzt verschiedene physiologische und pathophysiologische Prozesse in der BHS zu beschreiben und zu erklären. Die Zellen werden in diesem BHS-Modell mit Hilfe des Polynoma large T Antigens immortalisiert.
Das Ziel der Doktorarbeit war der Vergleich der mRNA Expressions- und Proteinlevel verschiedener Tight Junction-Proteine, Adherens Junctions, Effluxpumpen, Proteine der SLC-Familie und zellulärer Rezeptoren der BHS zwischen cEND/cerebEND und primären Zellen, die aus dem Großhirn isoliert wurden, sowohl in 10% FCS als auch in 1% FCS Nährmedium. Es sollte ermittelt werden, ob durch die Immortalisierung der Hirnendothelzellen eine Veränderung in der Expression der Proteine herbeigeführt wird und ob es Unterschiede in der Expression bezüglich der Mediumkonzentration gibt.
Untersucht wurden die mRNA Expressionslevel mit Hilfe der RT-PCR und die Proteinlevel mittels Western Blot.
Es hat sich heraus gestellt, dass cEND und cerebEND in vielen Fällen ähnliche Mengen an ABC-Transportern, Proteinen der SLC-Familie, zellulärern Rezeptoren und Tight Junction Proteinen wie primäre Zellen, sowohl in 10% FCS als auch in 1% FCS Medium exprimieren. Dabei sind die mRNA- und Proteinexpressionslevel von Tight Junctions und der zellulären Rezeptoren, Insulin- und Transferrinrezeptor, im Vergleich zu primären Zellen am ähnlichsten. In diesen Fällen wird die Expression der untersuchten Proteine durch die Immortalisierung der Hirnendothelzellen nicht signifikant verändert. Somit lässt sich die Barrierefunktion der Hirnendothelzellen besonders gut mit den in-vitro Modellsystemen untersuchen.
Die Modellsysteme cEND und cerebEND zeigen allerdings auch einige Schwachstellen. Bcrp, Mct1, Lrp1 und P-gp lassen sich nur bedingt mit diesen Modellsystemen untersuchen, da ihre mRNA- und Proteinexpression sehr stark hoch, im Fall von Bcrp, oder runter reguliert wird, im Fall von Mct1 und Lrp1 in cEND/cerebEND und P-gp in cerebEND.
Im Hinblick auf Veränderungen in der Expression durch Mediumreduktion wird deutlich, dass sie zu höheren Expressionsraten in cEND, mehr noch in cerebEND, führt. Dies zeigt sich auf mRNA-Ebene noch deutlicher als auf Proteinebene. Diese Tatsache scheint sich allerdings nicht im Vergleich mit primären Zellen sichtbar zu machen. Es zeigt sich kein Unterschied im Vergleich zu primären Zellen zwischen 10% FCS und 1% FCS Nährmedium.
Damit stellen cEND und cerebEND in vielen verschiedenen, jedoch nicht in allen Fragestellungen geeignete Modellsysteme dar.
Die Blut-Hirn-Schranke reguliert den Transport von Molekülen aus dem Blut in das Gehirn und aus dem Hirngewebe in das Blut. Die Grundlage dieser für den Erhalt der Homöostase im Gehirn wichtigen Schranke bilden zwischen Endothelzellen der Gehirnkapillaren (BCECs) entwickelte, besonders dichte Zonulae Occludentes (Tight Junctions). Viele Krankheiten, zum Beispiel die Multiple Sklerose, gehen mit einer Dysfunktion der BBB einher, die molekularen Grundlagen verschiedener Störungen und damit die Therapiemöglichkeiten sind bisher jedoch oftmals noch unbekannt. Ein grundlegendes Problem der Forschung an der BBB war bislang das Fehlen eines geeigneten immortalisierten in vitro-Modelles zum Verständnis der Differenzierung und Regulierung der Schrankenfunktion. Es gelang nun erstmals, aus murinen BCECs ein solches in vitro-Modell der BBB zu entwickeln, welches wichtige Charakteristika der BBB in vivo aufweist. Zu den Eigenschaften der BBB in vivo zählen allgemein ein hoher transendothelialer elektrischer Widerstand (TER) von bis zu 2000  x cm², die Expression der TJ-Proteine Occludin, Claudin-1, Claudin-3 und Claudin-5 sowie eine geringe Rate transzellulärer Transportvorgänge. Die Entwicklung einer immortalisierten Zelllinie als in vitro-Modell der BBB beinhaltete das Bereitstellen einer möglichst natürlichen Umgebung für die Endothelzellen. Durch Zugabe von Wachstums- und Differenzierungsfaktoren sowie Serumreduktion im Differenzierungsmedium konnte eine dichte Schrankenfunktion induziert werden, welche sich anhand von TER-Messungen nachweisen ließ. Mittels immuncytochemischen und molekularbiologischen Methoden wurde außerdem die Expression verschiedener TJ-Proteine in den immortalisierten BCECs gezeigt. Die Permeabilität der BBB wird durch eine Reihe von Faktoren beeinflusst. So war zu erkennen, dass Glucocorticoide und Insulin die Barrierenfunktion der BBB induzieren und die Zugabe dieser Faktoren die in vitro-Kultivierung von BCECs ermöglicht, ohne dass diese dabei für die BBB in vivo wesentliche Charakteristika verlieren. Diese Ergebnisse stimmen überein mit anderen Studien, denenzufolge für die Induktion und Aufrechterhaltung komplexer Tight Junctions bei kultivierten Endothelzellen Glucocorticoide förderlich sind. Auch klinisch wird dieser Einfluss von Glucocorticoiden bereits genutzt: so konnten im Falle der Multiplen Sklerose Therapieerfolge durch die Gabe von Corticosteroiden erzielt werden.