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Sphingobasen bilden das Grundgerüst und die Ausgangsbausteine für die Biosynthese von Sphingolipiden. Während komplexere Sphingolipide einen wichtigen Bestandteil von eukaryotischen Membranen bilden, sind Sphingobasen, die auch als long-chain bases (LCBs) bezeichnet werden, als Signalmoleküle bei zellulären Prozessen in Eukaryoten bekannt. Im tierischen System wurden antagonistische Effekte von nicht-phosphorylierten Sphingobasen (LCBs) und ihren phosphorylierten Gegenstücken (LCB-Ps) bei vielen Zellfunktionen, insbesondere der Apoptose, nachgewiesen und die zugrundeliegenden Signalwege umfassend aufgeklärt. Im Gegensatz dazu sind in Pflanzen weniger Belege für einen antagonistischen Effekt und mögliche Signaltransduktionsmechanismen bekannt. Für eine regulatorische Funktion von Sphingobasen beim programmierten Zelltod (PCD) in Pflanzen existieren mehrere Hinweise: (I) Mutationen in Genen, die den Sphingobasen-Metabolismus betreffen, führen zum Teil zu spontanem PCD und veränderten Zelltodreaktionen. (II) Die Gehalte von LCBs sind bei verschiedenen Zelltod-auslösenden Bedingungen erhöht. (III) Nekrotrophe Pathogene produzieren Toxine, wie Fumonisin B1 (FB1), die mit dem Sphingolipid-Metabolismus der Wirtspflanze interferieren, was wiederum die Ursache für den dadurch ausgelösten PCD darstellt. (IV) Die Behandlung von Pflanzen mit LCBs, nicht aber mit LCB-Ps, führt zu Zelltod.
In dieser Arbeit wurde die Rolle von Sphingobasen in der pflanzlichen Zelltodreaktion untersucht, wobei der Fokus auf der Überprüfung der Hypothese eines antagonistischen, Zelltod-hemmenden Effekts von LCB-Ps lag. Anhand von Leitfähigkeit-basierten Messungen bei Blattscheiben von Arabidopsis thaliana wurde der durch Behandlung mit LCBs und separater oder gleichzeitiger Zugabe von LCB-Ps auftretende Zelltod bestimmt. Mit dieser Art der Quantifizierung wurde der an anderer Stelle publizierte inhibierende Effekt von LCB-Ps auf den LCB-induzierten Zelltod nachgewiesen. Durch parallele Messung der Spiegel der applizierten Sphingobasen im Gewebe mittels HPLC-MS/MS konnte dieser Antagonismus allerdings auf eine reduzierte Aufnahme der LCB bei Anwesenheit der LCB-P zurückgeführt werden, was auch durch eine zeitlich getrennte Behandlung mit den Sphingobasen bestätigt wurde. Darüber hinaus wurde der Einfluss einer exogenen Zugabe von LCBs und LCB-Ps auf den durch Pseudomonas syringae induzierten Zelltod von A. thaliana untersucht. Für LCB-Ps wurde dabei kein Zelltod-hemmender Effekt beobachtet, ebenso wenig wie ein Einfluss von LCB-Ps auf den PCD, der durch rekombinante Expression und Erkennung eines Avirulenzproteins in Arabidopsis ausgelöst wurde. Für LCBs wurde dagegen eine direkte antibakterielle Wirkung im Zuge der Experimente mit P. syringae gezeigt, die den in einer anderen Publikation beschriebenen inhibierenden Effekt von LCBs auf den Pathogen-induzierten Zelltod in Pflanzen relativiert.
In weiteren Ansätzen wurden Arabidopsis-Mutanten von Enzymen des Sphingobasen-Metabolismus (LCB-Kinase, LCB-P-Phosphatase, LCB-P-Lyase) hinsichtlich veränderter in-situ-Spiegel von LCBs/LCB-Ps funktionell charakterisiert. Der Phänotyp der Mutanten gegenüber Fumonisin B1 wurde zum einen anhand eines Wachstumstests mit Keimlingen und zum anderen anhand des Zelltods von Blattscheiben bestimmt und die dabei akkumulierenden Sphingobasen quantifiziert. Die Sensitivität der verschiedenen Linien gegenüber FB1 korrelierte eng mit den Spiegeln der LCBs, während hohe Gehalte von LCB-Ps alleine nicht in der Lage waren den Zelltod zu verringern. In einzelnen Mutanten konnte sogar eine Korrelation von stark erhöhten LCB-P-Spiegeln mit einer besonderen Sensitivität gegenüber FB1 festgestellt werden.
Die Ergebnisse der vorliegenden Arbeit stellen die Hypothese eines antagonistischen Effekts von phosphorylierten Sphingobasen beim pflanzlichen Zelltod in Frage. Stattdessen konnte in detaillierten Analysen der Sphingobasen-Spiegel die positive Korrelation der Gehalte von LCBs mit dem Zelltod gezeigt werden. Die hier durchgeführten Experimente liefern damit nicht nur weitere Belege für die Zelltod-fördernde Wirkung von nicht-phosphorylierten Sphingobasen, sondern tragen zum Verständnis der Sphingobasen-Homöostase und des Sphingobasen-induzierten PCD in Pflanzen bei.
1. Im Rahmen dieser Arbeit konnten neue Erkenntnisse hinsichtlich des angenomme-nen gerichteten Ionentransports zwischen Schließ- und Nebenzellen von Zea mays gewonnen werden: a. Mittels der Patch-Clamp-Technik wurden in beiden Zelltypen S-Typ-ähnliche Anionenkanäle identifiziert. In Nebenzellen konnten sie durch steigende zytosolische Ca2+-Konzentrationen gehemmt und durch ABA und zytosolische Alkalisierung stimuliert werden. Die S-Typ-Anionenkanäle der Schließzellen wurden hingegen durch eine Alkalisierung kaum beeinflusst und durch steigende zytosolische Ca2+-Konzentrationen stimuliert. b. Darüber hinaus konnte an intakten Mais-Pflanzen mit der Einstich-Elektroden-Technik gezeigt werden, dass Nebenzellen eine gegenläufige Polarisation des Membranpotentials während der Licht-/Dunkel-induzierten Stomabewegung aufweisen. Da das Membranpotential der Nebenzellen von Hordeum vulgare ein zu Mais ähnliches Verhalten während der Stomabewegung zeigte und gegenläu-fig zur Membranpolarisation der benachbarten Schließzellen war, ist ein ähnli-ches Verhalten bei Zea mays Schließzellen naheliegend. c. Zudem wurde in intakten Nebenzellen von Zea mays eine zytosolische Alkali-sierung während der Licht-induzierten Stomaöffnung beobachtet, die bei Stomaschluss wieder auf den Ursprungswert zurückkehrte. d. Mit Hilfe rekonstruktierter 3D-Modelle von intakten Mais-Stomakomplexen konnte ein Volumenverhältnis zwischen Schließ- und Nebenzellen von 1:6 bzw. 1:4 bei geöffneten und geschlossenen Stomata ermittelt werden. Unter Einbeziehung der Vorarbeiten unserer Arbeitsgruppe konnten die hier gewon-nenen Erkenntnisse schlüssig in ein Modell zur Beschreibung des Shuttle-Ionentransports zwischen Neben- und Schließzellen während der Licht-induzierten Stomabewegung eingebunden werden. 2. Des Weiteren wurden die S-Typ-Anionenstromantworten von A. thaliana Schließ-zellen in Patch-Clamp-Experimenten näher untersucht. Dabei waren die S-Typ-Anionenströme bei Ca2+- bzw. ABA-Stimulation in CPK23- und OST1-Verlustmutanten im Vergleich zum Wildtyp stark reduziert. Diese in vivo generierten Daten untermauern die in vitro Ergebnisse der Arbeitsgruppe von Prof. R. Hedrich (Universität Würzburg), dass OST1 und CPK23 Interaktionspartner des S-Typ-Anionenkanals SLAC1 in A. thaliana sind. Das SLAC1-homologe Gen SLAH3 ko-diert für einen Nitrat-permeablen S-Typ-Anionenkanal in Schließzellen, der zudem durch externes Nitrat aktiviert wird. Da in slac1-3 Verlustmutanten S-Typ-ähnliche Anionenströme generiert werden konnten, wenn Nitrat das dominierende Anion dar-stellte oder den Chlorid-basierten Lösungen externes Nitrat zugegeben wurde, scheint SLAH3 unter bestimmten Bedingungen einen alternativen Weg für die Ent-lassung von Anionen aus der Schließzelle darzustellen. 3. Die elektrophysiologische Charakterisierung der R-Typ-Anionenkanäle in A. thaliana Schließzellen belegt, dass dieser Kanal ähnliche Grundcharakteristika aufweist, die schon in Vicia faba beschrieben wurden: eine starke Spannungsab¬hängigkeit, sowie schnelle Aktivierungs- und Deaktivierungskinetiken. Im Gegensatz zu Vicia faba wurde die Spannungsabhängigkeit dieses Kanaltyps in A. thaliana nicht durch externes Malat beeinflusst. Jedoch war unter externen Malatbedingungen die Stromantwort einer almt12-Verlustmutante im Vergleich zu Wildtyp-Schließzellen erheblich reduziert, während unter externen Sulfatbe¬dingungen keine Unterschiede zwischen Wildtyp und almt12-Verlustmutante auszu¬machen waren. ALMT12 scheint demnach für den Malat-aktivierten Teil des R-Typ-Anionenkanals verantwortlich zu sein.
Pflanzen müssen sich während der Samenkeimung und Keimlingsentwicklung über eingelagerte Speicherstoffe heterotroph versorgen, bis sie, nach Etablierung ihres Photosyntheseapparats, einen autotrophen Lebensstil führen können.
Diese Arbeit geht von der Hypothese aus, dass der evolutionär konservierten zentral-metabolischen Kinase Snf1-RELATED PROTEIN KINASE 1 (SnRK1) eine besondere Rolle bei der Mobilisierung von Speicherstoffen während der Keimlingsentwicklung zukommt. Während die Bedeutung von SnRK1 als zentraler Regulator katabolischer Prozesse unter Energiemangel- und Stresssituationen bereits gezeigt wurde, war die Funktion von SnRK1 im Zusammenhang mit der Samenkeimung weitgehend ungeklärt. In dieser Arbeit konnte erstmals gezeigt werden, dass SnRK1 in Arabidopsis die Mobilisierung und Degradation von Speicherstoffen, insbesondere von Triacylglyceride (TAGs), Samenspeicherproteinen und Aminosäuren, steuert. Sowohl Studien zur Lokalisation von SnRK1:GFP-Fusionsproteinen als auch Kinaseaktivitätsassays unterstützen eine mögliche Funktion von SnRK1 während der Keimlingsentwicklung. Eine induzierbare snrk1-knockdown Mutante zeigt neben einem eingeschränkten Wurzel- und Hypokotylwachstum auch keine Ausbildung eines Photosyntheseapparats, was die zentrale Rolle der SnRK1 in diesem frühen Entwicklungsstadium untermauert. Durch Fütterungsexperimente mit Glukose konnte der Phänotyp einer snrk1 -Mutante in Keimlingen gerettet werden. Dies zeigt, dass der metabolische Block durch externe Gabe von Kohlenhydraten umgangen werden kann. Die zentrale Funktion von SnRK1 ist folgich der Abbau von Speicherstoffen und keine allgemeine Deregulation des pflanzlichen Stoffwechsels. Durch massenspektrometrische Untersuchungen von Keimlingen des Wildtyps und der snrk1-Mutante konnte gezeigt werden, dass TAGs in der Mutante in der spä- ten Keimlingsentwicklung ab Tag 4 langsamer abgebaut werden als im Wildtyp. Ebenso werden Samenspeicherproteine in der Mutante langsamer degradiert, wodurch die Verfügbarkeit von freien Aminosäuren in geringer ist. Entgegen der allgemeinen Annahme konnte gezeigt werden, dass während der Keimlingsentwicklung zumindest in Arabidopsis, einer ölhaltigen Pflanze, zunächst Kohlenhydrate in Form von Saccharose abgebaut werden, bevor die Degradation von TAGs und Aminosäuren beginnt. Diese Abbauprodukte können dann der Glukoneogenese zugeführt werden um daraus Glukose herzustellen. Mittels Transkriptom-Analysen konnten zentrale SnRK1-abhängige Gene in der Speicherstoffmobilisierung von TAG, beispielsweise PEROXISOMAL NAD-MALATE DEHYDROGENASE 2 (PMDH2) und ACYL-CoA-OXIDASE 4 (ACX4), und Aminosäuren identifiziert werden. Somit wurde ein Mechanismus der SnRK1-abhängigen Genregulation während der Samenkeimung in Arabidopsis gefunden. Bei der Degradation von Aminosäuren wird die cytosolische PYRUVATE ORTHOPHOSPHATE DIKINASE (cyPPDK), ein Schlüsselenzym beim Abbau bestimmter Aminosäuren und bei der Glukoneogenese, SnRK1-abhängig transkriptionell reguliert. Durch Koregulation konnte der Transkriptionsfaktor bZIP63 (BASIC LEUCINE ZIPPER 63) gefunden werden, dessen Transkription ebenfalls SnRK1-abhängig reguliert wird. Außerdem konnte die Transkription von cyPPDK in bzip63-Mutanten nur noch sehr schwach induziert werden. In Protoplasten konnte der cyPPDK-Promotor durch Aktivierungsexperimente mit bZIP63 und SnRK1α1 induziert werden. Durch Mutationskartierung und Chromatin-Immunopräzipitation (ChIP)PCR konnte mehrfach eine direkte Bindung von bZIP63 an den cyPPDK-Promotor nachgewiesen werden. Zusammenfassend ergibt sich ein mechanistisches Arbeitsmodell, in dem bZIP63 durch SnRK1 phosphoryliert wird und durch Bindung an regulatorische G-Box cis-Elemente im cyPPDK- Promotor dessen Transkription anschaltet. Infolgedessen werden Aminosäuren abgebaut und wird über die Glukoneogenese Glukose aufgebaut. Dieser Mechanismus ist essentiell für die Übergangsphase zwischen heterotropher und autotropher Lebensweise, und trägt dazu bei, die im Samen vorhandenen Ressourcen dem Keimling zum idealen Zeitpunkt zugänglich zu machen. Darüber hinaus werden Gene im Abbau von verzweigtkettigen Aminosäuren ebenfalls durch bZIP63 reguliert. Dabei wird dem Keimling Energie in Form von Adenosin-Triphosphat (ATP) zur Verfügung gestellt.
Zusammengefasst zeigen die Ergebnisse dieser Arbeit, dass die Mobilisierung von Speicherstoffen auch während der Keimlingsentwicklung direkt von SnRK1 abhängig ist. Die umfangreichen Datensätze der RNA-Seq-Analysen bieten zudem die Möglichkeit, weitere SnRK1-abhängige Gene der Speichermobilisierung zu identifizieren und somit einem besseren Verständnis der Keimlingsentwicklung beizutragen. Aufgrund der zentralen Bedeutung der SnRK1-Kinase in diesem entscheidenden Entwicklungsschritt ist davon auszugehen, dass diese Erkenntnisse mittelfristig auch für bessere Keimungsraten und somit bessere Erträge in der Landwirtschaft genutzt werden können.
Die Biosynthese von fragmentierten Fettsäuren (kurzkettige Dicarbonsäuren und deren Oxocarbonsäure-Vorstufen) ist in den meisten Pflanzen noch unklar. Wichtige, bekannte Dicarbonsäuren sind Pimelinsäure (PIM) und Azelainsäure (AZA) mit den putativen Vorstufen 7-Oxo¬heptanonsäure (OHA) und 9-Oxononanonsäure (ONA). Es besteht großes Interesse die Biosynthese¬mechanismen und die Regulation der Synthese dieser Substanzen aufzuklären, da Fettsäure¬fragmente an wichtigen biologischen Prozessen beteiligt sind. PIM ist eine essentielle Vorstufe von Biotin in Mikroben, Pilzen und Pflanzen. Bisher konnte die Biosynthese von PIM nur in Bakterien (E. coli und B. subtilis) aufgeklärt werden. Es gibt keine Hinweise auf einen analogen Mechanismus in Pflanzen. Eine biologische Aktivität von AZA bei Pflanzen konnte erst vor kurzem beschrieben werden. Eine Forschergruppe identifizierte AZA als Metabolit, der nach Infektion mit dem Pathogen Pseudomonas syringae vermehrt im Phloemsaft von Arabidopsis vorhanden ist und der in Pflanzen eine lokale und systemische Resistenz gegenüber dem Pathogen induziert. In Tieren sind Fettsäurefragmente ebenfalls Gegenstand aktueller Forschung. Es ist bekannt, dass eine nichtenzymatische oxidative Fragmentierung von Fettsäurehydroperoxiden in komplexen Membranlipiden als Folge von oxidativem Stress abläuft. Phospholipide mit veresterter ONA / AZA spielen aufgrund ihrer Struktur eine Rolle als endogene Liganden bei Reaktionen des angeborenen Immunsystems. Ziel dieser Arbeit war es, die Mechanismen der Oxidation von Fettsäuren und deren Fragmentierung in Pflanzen aufzuklären. Weiterhin sollte die Rolle der oxidierten Fragmente in der Immunantwort der Modellpflanze Arabidopsis thaliana untersucht werden. In Pflanzen wurden fragmentierte Fettsäuren im Rahmen dieser Arbeit erstmals in komplexen Lipiden identifiziert und verschiedene Hypothesen zur Bildung von Fettsäurefragmenten experimentell überprüft. Es konnte gezeigt werden, dass die Biosynthese der Fettsäurefragmente in A. thaliana ausgehend von zwei- oder dreifach ungesättigten Fettsäuren stattfindet. 9- und 13-Lipoxygenasen (LOX1, LOX5 und LOX2) spielen dabei keine essentielle Rolle. Die Fettsäurefragmente konnten in Arabidopsis in freier Form und in komplexen Lipiden verestert (ausschließlich in Galactolipiden) detektiert werden. Applikationsexperimente zeigten, dass die Biosynthese der Fettsäurefragmente in den komplexen Lipiden auf nichtenzymatischem Wege in situ stattfindet. Dabei wird in Übereinstimmung mit den experimentellen in vitro und in vivo Daten als Reaktionsmechanismus die Dimer-Hypothese der Arbeitsgruppe um Alan Brash vorgeschlagen. In grünen Pflanzenteilen verläuft die Biosynthese demzufolge in drei Schritten ab: Im ersten Schritt entsteht ein „Pool“ von oxidierten Galactolipiden mit Hydroperoxid-Acylketten (mit konjugierten Dienen). Diese Hydroperoxide entstehen fortlaufend durch Oxidation der Fettsäureacyle mittels Singulett Sauerstoff in Plastiden. Nach Infektion mit dem Pathogen P. syringae (avirulenter Stamm) wird der „Pool“ von Galactolipidperoxiden durch die katalytische Einwirkung von freien Radikalen und der LOX2 erhöht. Im zweiten Schritt findet eine Radikal-katalysierte Addition von Peroxylradikalen an Fettsäurehydroperoxide statt, wobei Lipid-Peroxid-Dimere gebildet werden. Diese instabilen Zwischenprodukte zerfallen spontan in vier Produkte, darunter zwei Aldehyd-Fragmente, ein Alkoxyradikal und ein Hydroxylradikal. Bemerkenswert ist, dass durch die Fragmentierung des Dimers weitere Radikale de novo entstehen. Im dritten Schritt können die in Galactolipiden veresterten Oxocarbonsäuren zu Dicarbonsäuren oxidiert werden. Hydroperoxide, die Vorläufer der Fettsäurefragmente, wurden in freier Form und in komplexen Lipiden verestert analysiert. Unter basalen Bedingungen liegt sowohl bei den freien, als auch bei den veresterten Hydroxyfettsäuren ein fast komplett Singulett Sauerstoff abhängiger Oxidationsmechanismus vor. Drei Galactolipid Hauptspezies (Monogalactosyldiacylglycerol (MGDG)-18:3-16:3, Digalactosyldiacylglycerol (DGDG)-18:3-18:3 und DGDG-18:3-16:3) sind hoch oxidiert (5 bis 9 Mol-%, relativ zur jeweiligen Vorstufe). MGDG-18:3-18:3, ebenso wie Phosphatidylglycerol-, Phosphatidylinositol- und Triacylglycerol-Hydroxyfettsäurespezies liegen basal nur schwach oxidiert vor (< 2 Mol-%). Nach Infektion mit dem Pathogen P. syringae kommt es zu einer massiven Lipid Biosynthese und Oxidation durch die 13-Lipoxygenase LOX2, Singulett Sauerstoff und freie Radikale. Der Oxidationsgrad der Hydroxyfettsäuren in den Galactolipiden ändert sich kaum. Innerhalb der Triacylglycerole kommt es zu einem großen Anstieg der oxidierten Spezies (auf 12 bis 38 Mol-%). Die Oxidation und Fragmentierung der Fettsäuren in den Galactolipiden unter basalen Bedingungen und induziert durch die Pathogenbehandlung, stellen einen wichtigen biochemischen Prozess dar, auf dem PIM und AZA entstehen.
Mechanismus des pre-tRNA-Spleißens : Struktur und Funktion pflanzlicher und animaler RNA-Ligasen
(2005)
Transfer Ribonukleinsäuren werden von der RNA Polymerase III als Vorläufer tRNA transkribiert und durchlaufen eine Vielzahl von Reifungsschritten hin zur maturen tRNA. Neben der Hydrolyse der 5´- und 3´-Flanke durch die RNase P und die tRNase Z, sowie einer Vielzahl von Basenmodifizierungen, wird bei einigen pre-tRNAs das Intron herausgespleißt. Die ersten intronhaltigen tRNA Gene wurden in der Hefe Saccharomyces cerevisiae nachgewiesen und folglich wurde der Spleißmechanismus in diesem Organismus als erstes untersucht. Eine tetramere tRNA Spleißendonuklease spaltet das Intron an den Exongrenzen heraus und eine tRNA Ligase ligiert die entstandenen tRNA Hälften zur gespleißten tRNA. Einzig in der Hefe und anderen Pilzen konnten bisher die Gene für die tRNA Ligase identifiziert werden. Weder molekularbiologische Ansätze – wie z.B. DNA Hybridisierung, Expressions-“Screening“ und funktionelle Komplementationsstudien mit einem tRNA Ligase-defizienten Hefestamm – noch Datenbanksuchen mit der bekannten Hefe tRNA Ligasesequenz haben in den vergangenen Jahren zur Identifizierung eines pflanzlichen oder animalen tRNA Ligase Gens geführt. In dieser Arbeit ist es erstmals gelungen, das tRNA Ligase Protein aus Weizenkeimen bis zur Homogenität zu isolieren und mit Hilfe erhaltener Peptidsequenzen die entsprechenden Kern-codierten Gene in höheren und niederer Pflanzen zu identifizieren. Die Ligaseaktivität wurde für das klonierte, rekombinant überexprimierte tRNA Ligaseprotein bestätigt. Weiterhin wurde zum ersten Mal das Ligaseprotein aus Schweineleber aufgereinigt und das zugehörige Gen im humanen Genom identifiziert.
Molekulare Mechanismen einer wechselseitigen Kontrolle der Arabidopsis-Agrobacterium-Interaktion
(2008)
Phytohormone sind wichtige Signalmoleküle bei der durch Agrobacterium tumefaciens vermittelten Tumorgenese. Zum einen sind sie direkt am onkogenen Prozess beteiligt, indem sie die Proliferation von transformierten Zellen fördern und physiologische Anpassungen im entstehenden Tumor steuern. Auf der anderen Seite vermitteln Phytohormone aber auch Abwehrreaktionen der Pflanze als Folge eines Befalls mit onkogenen Pathogenen. Um diese verschiedenen Wirkungen der Phytohormone während der Tumorgenese besser zu verstehen, wurde die Genexpression durch Microarrays zu unterschiedlichen Zeitpunken dieses Prozesses an der Modellpflanze Arabidopsis thaliana charakterisiert und die Rolle ausgewählter Phytohormone, wie Abscisinsäure, Salizylsäure, Jasmonsäure, Ethylen und H2O2 durch Mutanten in entsprechenden Signalwegen funktionell untersucht. Die Ergebnisse dieser Arbeit deuten darauf hin, dass die bekannten Pathogenabwehrwege bei Befall durch onkogene Agrobacterien mit einer zeitlichen Verzögerung aktiviert werden. Diese Verzögerung wird wahrscheinlich durch das vom Bakterium abgegebene Auxin reguliert, und somit könnte dieses Auxin die Integration der T-DNA indirekt fördern. Sind die pflanzlichen Abwehrmechanismen jedoch vor dem Transformationsprozess aktiviert, wie z.B. in cpr5–Mutanten, kann die T-DNA nicht integrieren und es entsteht kein Tumor. Beim Wildtyp akkumulieren in Folge der T-DNA Integration mit Pathogenabwehr assoziierte Signalmoleküle, wie H2O2, Ethylen und Salizylsäure, nicht aber Jasmonsäure. Die Analyse des Tumorwachstums an Mutanten mit unterschiedlichen Defekten in diesen Signalwegen zeigte jedoch, daß Ethylen und Salizylsäure keinen Einfluß auf das Tumorwachstum haben. Vielmehr regulieren Ethylen und H2O2 morphologische Anpassungen und Adaptationen an Trockenstress in Tumoren. Die von Agrobacterium tumefaciens induzierten Tumore beziehen außer Nährstoffe, vor allem Wasser von der Wirtspflanze. Das Fehlen einer intakten Epidermis oder Kutikula führt allerdings zu unkontrolliertem Wasserverlust. Da aber weder der Tumor noch die Pflanze welken, muss eine Trockenstressadaptation stattzufinden. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Phytohormone Abscisinsäure (ABA) und Ethylen an diesem Prozess beteiligt sind. Zum einen regulieren sie die Akkumulation von Osmoregulatoren, sowie Suberineinlagerungen in den äußeren Zellschichten des Tumors, wodurch eine dem Periderm ähnliche Schutzschicht entsteht. Diese Suberinisierung wird im Tumor wahrschein-lich von ABA induziert, wie Experimente an Arabidopsis Wurzeln belegten. Die Microarray-Analysen ergaben, dass im Tumor ein spezielles Muster an ABA- und Trockenstress-induzierten Markergene exprimiert wird, sowie einigen Aquaporinen, die den erhöhten Wasserbedarf des Tumors regulieren könnten. Das verminderte Tumorwachstum an abi- and aba-Mutanten belegt die Bedeutung von ABA-Signalen für die Homeostase des Wasser-haushalts im Tumor.
In vorausgegangenen Experimenten unseres Labors war bereits gezeigt worden, dass die Applikation von Glutamat zur transienten Erhöhung der cytosolischen Calciumkonzentration sowie zu einer Depolarisation der Plasmamembran von Mesophyllzellen führt. Pharmakologische Studien weisen auf mögliche Orthologe tierischer ionotroper Glutamatrezeptoren (iGLuRs) hin. Ziel dieser Arbeit war eine vertiefte molekulare und funktionelle Analyse der Glutamatrezeptoren (GLRs) aus Arabidopsis thaliana. Dabei konnten folgende Erkenntnisse gewonnen werden: i. Zugabe von extrazellulärem Glutamat in Kombination mit Glycin führt in Abhängigkeit der extrazellulären ATP-Konzentration (eATP) zu einer transienten Erhöhung der Calciumkonzentration in Mesophyllzellen. ii. Die Reaktion von Mesophyllprotoplasten auf die Applikation von Glutamat und Glycin ist im Vergleich zum intakten Blatt stark reduziert, kann jedoch in Gegenwart von eATP oder Glucose signifikant gesteigert werden. iii. Diese Responsibilität von Mesophyllprotoplasten ist zum Zeitpunkt des Einsetzens der Zellwandsynthese (48h) am höchsten. iv. In Patch-Clamp Experimenten führt die photolytische Freisetzung von extrazellulärem caged-Glutamat bei 34 % der gemessenen A. thaliana Mesophyllprotoplasten zu einem verstärkten Kationentransport über die Plasmamembran. Dieser Kationenstrom kann durch gleichzeitige Anwesenheit von extrazellulärem ATP noch verstärkt werden und ist durch einen Desensitivierungsprozess gekennzeichnet. Die Empfindlichkeit dieser Ströme gegenüber Antagonisten tierischer iGluRs stellt eine Verbindung zu der Genfamilie der AtGLRs dar. v. Coexpressionexperimente ausgewählter AtGLRs geben erste Hinweise auf eine Homo- bzw. eine Heteromerbildung von AtGLR1.1 und AtGLR1.4. Aufgrund fehlender Kanalaktivität konnten einzelne, in Oozyten exprimierte AtGLRs bislang nicht funktionell charakterisiert werden. vi. Studien zur transienten und stabilen Überexpression im homologen Expressionssystem zeigen einen cytotoxischen Effekt bei funktioneller Überexpression ausgewählter AtGLRs. vii. Die Analyse der Stellung des Glutamatrezeptors 3.4 in kälteregulierten Signalnetzwerken via Microarrays weist auf ein überlappendes Aufgabenspektrum der Familie der AtGLRs hin. viii. Im Rahmen von Microarray Transkriptionsanalysen an der glr3.4-1 Mutante konnte ein bisher nicht charakterisiertes, co-reguliertes Protein identifiziert werden. Dieses Protein ist durch den Besitz einer transmembranen Region sowie einer ATP-Bindedomäne charakterisiert und könnte einen möglichen Regulator des AtGLR3.4-Kanals darstellen. ix. Die Überprüfung einer möglichen Beteiligung der pflanzlichen Glutamatrezeptoren an der Generierung der glutamatabhängigen Ca2+-Signale sowie die Suche nach Regulatoren bzw. fehlenden Untereinheiten erfolgte mithilfe Mutanten-„Sreenings“. Die Analyse der bis dato identifizierten, Glutamat-insensitiven Mutanten konnte im Rahmen dieser Arbeit nicht abgeschlossen werden.
Sphingolipide – Analytik, Biosynthese und Funktion in der Arabidopsis thaliana Pathogenantwort
(2010)
Sphingolipide (SPL) sind wichtige und ubiquitar verbreitete Bestandteile von Biomembranen. Aufgrund der enormen Vielfalt, der komplexen Struktur und diverser physiko-chemischer Eigenschaften der Sphingolipide gestaltet sich die qualitative und quantitative Untersuchung der Sphingolipide allerdings schwierig. In dieser Arbeit konnten, basierend auf publizierten Methoden, analytische Verfahren entwickelt werden, mit deren Hilfe sich die Gehalte spezifischer Sphingolipide in A. thaliana quantitativ nachweisen lassen. Unter Einsatz eines targeted metabolite profiling-Ansatzes wurde die Rolle spezifischer Sphingolipide in der Pflanzen-Pathogen Interaktion charakterisiert. Infiltration von avirulenten P. syringae pv. tomato (Pst) in Blätter von A. thaliana führte zu schnell und transient erhöhten Gehalten der freien Sphingobase Phytosphingosin (t18:0). Im Gegensatz zu avirulenten Pst kam es nach Infiltration von virulenten Pst zu einer schnellen Rückkehr auf Basalniveau und nicht zu einer hypersensitiven Antwort (HR), was auf eine positiv regulatorische Rolle von t18:0 in Abwehrreaktionen von Pflanzen hinwies, z.B. bei der HR. Damit konnte in der vorliegenden Arbeit zum ersten Mal gezeigt werden, dass die Spiegel freier Sphingobasen der Pflanze, insbesondere von t18:0, in Antwort auf bakterielle Pathogene reguliert werden. Diese spezifische Regulation korreliert, in Abhängigkeit von der Pathogeninfektion, mit dem Verlauf der HR. Im Unterschied zu avirulenten Stämmen sind virulente Pst in der Lage, Abwehrreaktionen des Wirtsorganismus zu unterdrücken. Daher tritt keine HR auf, welche die Ausbreitung des Pathogens stoppen könnte. Die unterschiedliche Beeinflussung der t18:0 Gehalte virulenter und avirulenter Stämme zeigte sich auch in Experimenten mit einem anderen P. syringae Stamm. Freie Sphingobasen zeigten in dieser Arbeit typische Merkmale von Signalmolekulen: geringe basale Spiegel, schnelle und transiente Gehaltsanderungen, präzise Regulation sowie spezifische Wirkeffekte. Sphingolipide stellen somit, neben den etwa durch PAMPs ausgelösten und durch Phytohormone vermittelten, weitere Signalwege in der Pflanzen Pathogen Interaktion dar. Die Infiltration von Pst in Blätter der A. thaliana Mutante sbh1-1 führte zu transient erhöhten d18:0 Spiegeln. In dieser Mutante ist die Funktion von einer der zwei Sphingobasen-Hydroxylasen gestört. Wie sich nach Totalhydrolyse zeigte, sind die Gesamtgehalte von t18:0 in der Mutante allerdings nicht reduziert. Dies spricht dafür, dass der pathogenabhängige transiente Anstieg von t18:0 durch de novo Synthese aus d18:0 entsteht und nicht durch Freisetzung aus komplexen Sphingolipiden mittels spezifischer Lipasen. Somit ist die Hydroxylase SBH1 für den schnellen signalvermittelten Anstieg von t18:0 verantwortlich. Neben t18:0 lösen auch strukturell ähnliche freie Sphingobasen, z.B. d18:1 und d18:0, Abwehrreaktionen und Zelltod aus, während andere Sphingobasen (d20:0 und d20:1) sowie Ceramide keine Reaktionen auslösten. Dies weist auch direkt auf die Spezifität der beteiligten Mechanismen hin.
1. OH-FS wurden in vitro hergestellt, um als Standardsubstanzen zur gaschromato-graphischen Identifizierung von OH-FS in Pflanzenmaterial eingesetzt zu werden. 2. Für die Untersuchung der Oxylipin-Gehalte in A. thaliana wurden der virulente Pst-Stamm DC3000 sowie der avirulente Stamm avrRPM1 verwendet, um die kompatible Interaktion mit der inkompatiblen Interaktion vergleichen zu können. Die Konzentrationen der Oxylipine sowie SA wurden innerhalb einer Versuchsdauer von 60 h verfolgt. Dabei wurden PPF1 sowie 12- und 16-OH-FS, als Vertreter der nicht-enzymatisch entstandenen Oxylipine, 9- und 13-OH-FS, sowohl als enzymatisch als auch nicht-enzymatisch entstandene Oxylipine, sowie JA und deren Vorstufe OPDA als enzymatisch gebildete Phytohormone untersucht. Es wurden monophasische Konzentrationsanstiege, bei allen untersuchten Substanzen, in der kompatiblen Interaktion ermittelt, wohingegen die Konzentrationsanstiege in der inkompatiblen Interaktion biphasisch waren. In beiden Interaktionen wurden nach 48 bis 60 h Konzentrationsmaxima der freien sowie der veresterten OH-FS und PPF1 nachgewiesen, ein früher Konzentrationsanstieg nach 5 bis 10 h konnte ausschließlich in der inkompatiblen Interaktion ermittelt werden. Die gleichzeitige Akkumulation von 9-, 10-, 12-, 13, 15- und 16-OH-FS und PPF1 deutet auf eine parallel ablaufende Oxylipin-Synthese durch enzymatische, Photo-oxidative und über freie Radikale vermittelte Prozesse hin. Die Akkumulation veresterter OH-FS und PPF1 erfolgte in beiden Interaktionen 5 bis 12 h früher als die Konzentrationsanstiege der freien OH-FS und PPF1. Die Ergebnisse bestätigen die Hypothese, dass nicht-enzymatische Oxylipine in Membranen gebildet werden können und anschließend vermutlich durch eine Lipase frei gesetzt werden. In der inkompatiblen Interaktion konnte ein erstes frühes Konzentrationsmaximum von JA und OPDA nach 5 h beobachtet werden, während späte Maxima in beiden Interaktionen nach 24 bis 36 h erfolgten. Somit akkumulierten die OH-FS und PPF1 in der inkompatiblen Interaktion zeitgleich mit den Jasmonaten nach 5 h. 3. Bei einer Kälteexposition von A. thaliana bei 4°C über 2 h wurde jeweils ein 3,3-facher Konzentrationsanstieg der freien und der veresterten enzymatisch gebildeten 13-OH-FS nachgewiesen. Darüberhinaus wurde ein 4,6-facher Anstieg der enzymatisch entstandenen 9-OH-FS ermittelt. Die nicht-enzymatisch gebildeten 12- und 16-OH-FS zeigten dagegen keine signifikanten Konzentrationsanstiege über die basalen Konzentrationen hinaus. Die angewendeten Stressbedingungen bewirken demnach ausschließlich eine enzymatische Bildung von OH-FS in A. thaliana. 4. Zur Untersuchung der OH-FS-Synthese in der inkompatiblen Interaktion in Abhängigkeit von der bei der Pflanzenanzucht eingesetzten Lichtstärke wurden A. thaliana bei Licht und in Dunkelheit mit Pst avrRPM1 infiziert. Nach 10 h wurde eine 1,1- bis 3,7-fach stärkere Bildung der freien sowie eine 2,0- bis 3,4-fach stärkere Akkumulation der veresterten 9-, 10-, 12-, 13, 15- und 16-OH-FS bei den Pflanzen ermittelt, die bei Licht angezogen wurden. Die Lichtintensität, der Pflanzen während der Infektion mit Pst ausgesetzt sind, hat demnach große Bedeutung für die Entstehung enzymatisch und nicht-enzymatisch gebildeter OH-FS. Ein 4,9-facher Anstieg veresterter 15-OH-FS, ein Marker für eine photooxidative OH-FS-Entstehung, auch bei Dunkelheit widersprach der Hypothese, dass 15-OH-FS ohne Lichteinwirkung nicht gebildet werden können und deutet auf eine bisher unbekannte Licht-unabhängige Entstehung von 1O2 bzw. von 15-OH-FS hin. 5. Die Bestimmung von OH-FS in Blättern und Wurzeln von unbehandelten A. thaliana-Pflanzen ergab eine 13- bis 31-fach höhere Konzentration veresterter 9-, 10-, 12-, 13- und 16-OH-FS in den Blättern. Darüberhinaus wurde eine 111-fach höhere Konzentration von veresterten 15-OH-FS in Blättern im Vergleich zu Wurzeln nachgewiesen. 15-OH-FS wurden als selektiver Marker für eine Photo-oxidative OH-FS-Bildung durch 1O2 verwendet. Mit 0,57 µg/g TG kommt 15-OH-FS allerdings auch im Wurzelgewebe vor, was einen Hinweis darauf darstellt, dass neben einem Licht-abhängigen Hauptweg auch ein Licht-unabhängiger Entstehungsmechanismus von 15-OH-FS bzw. 1O2 existiert. Alternativ wäre es denkbar, dass ein Transport von 15-OH-FS von den Blättern in die Wurzeln stattfindet. 6. Eine Untersuchung der Gehalte an OH-FS und PPF1 in NahG-, lsd1-, atrbohD- und atrbohF-Mutanten ergab 48 h nach Infiltration von Pst avrRPM1 keine signifikanten Unterschiede im Vergleich zu den Pflanzen des jeweiligen Wildtyps Col-0 und WS. Unter den gewählten Versuchsbedingungen bewirken die genetischen Defekte der untersuchten Mutanten keine veränderte Akkumulation enzymatisch sowie nicht-enzymatisch gebildeter Oxylipine.