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Mutationen in Genen, die für Kernhüllproteine codieren sind mit einer stetig zunehmenden Anzahl menschlicher Erkrankungen verbunden, die als Envelopathien bezeichnet werden. Erstaunlicherweise betrifft die Pathologie dieser Krankheiten spezifische Gewebe und Organe, obwohl entsprechende Proteine meist ubiquitär exprimiert werden. So führen beispielsweise Defekte in Emerin, einem Protein der inneren Kernhülle, zur X-chromosomalen Emery-
Dreifuss Muskeldystrophie (EDMD). Diese Krankheit ist durch Muskelschwäche oder –
schwund gekennzeichnet. Defekte im Kernhüllprotein MAN1 sind dagegen mit Krankheiten verbunden, die Knochen- und Hautgewebe betreffen. Interessanterweise besitzen beide
Proteine eine evolutionär hoch konservierte Domäne, die sog. LEM-Domäne. LEM-Domänen Proteine können mit der Kernlamina interagieren, ebenso mit dem sog. Barrier-to-
Autointegration Factor (BAF) sowie mit zahlreichen Transkriptionsfaktoren. Dennoch ist die
funktionelle Rolle der LEM-Domänen Proteine bis dato nicht vollständig aufgeklärt. In der vorliegenden Studie sollten daher die Funktionen von MAN1 und Emerin während der Frühentwicklung von Xenopus laevis untersucht werden.
Vorangehende Untersuchungen zeigten, dass Mikroinjektionen von XMAN1-
Antikörpern in Zwei-Zell-Stadien befruchteter Eizellen zu einem Arrest der Zellteilung in der injizierten Blastomere führten. Da dabei eine Störung der Kernhüllbildung spekuliert wurde, sollte durch Antikörper-vermittelter Inhibition von XMAN1 die Bildung von in vitro Kernen im Xenopus Eiextrakt untersucht werden. Dabei wurden Kerne beobachtet, die dekondensiertes
Chromatin zeigten, bei denen jedoch eine Fusion von Membranvesikeln zu einer durchgehenden Kernhülle nicht stattgefunden hatte. Frühere Charakterisierungen von MAN1 und Emerin zeigten unterschiedliche Expressionsmuster während der Entwicklung von X. laevis. Da XMAN1 ubiquitär exprimiert und Xemerin jedoch erstmals ab Stadium 41 nachweisbar ist, war es mittels Mikroinjektion von
Xemerin möglich zu zeigen, dass es in der Lage ist den Arrest der Zellteilung zu verhindern. Es wurde daher die These aufgestellt, dass MAN1 und Emerin während der Frühentwicklung von Xenopus überlappende Funktionen besitzen. Um diese These zu prüfen, wurde zunächst
unter Verwendung des Proximity Ligation Assays untersucht, ob beide Proteine miteinander interagieren können. Mit Hilfe dieser Methode konnte gezeigt werden, dass Interaktionen beider Proteine innerhalb der Kernhülle lokalisieren. Die Interaktionen blieben während der Mitose bestehen und waren erst wieder zum Ende der Mitose in der Kernhülle nachweisbar. Diese Resultate deuten daher darauf hin, dass XMAN1/Xemerin-Interaktionen während der ...
Mutationen im humanen Emerin-Gen verursachen beim Menschen eine angeborene Muskelschwäche, die X-gebundene Emery-Dreifuss. Der Phänotyp dieser Störung manifestiert sich in der zweiten und dritten Lebensdekade durch Verkürzungen der Nacken , Ellenbogen- und Achillessehnen, progressiven Muskelschwund am Oberkörper sowie Störung der Reizweiterleitung und eine Kardiomyopathie. Zwar wurden die Funktionen dieses ubiquitären Kernmembranproteins bislang intensiv erforscht, allerdings blieben die krankheitsverursachenden Mechanismen, die für den späten Ausbruch der gewebespezifischen Erkrankung verantwortlich sind, noch weitestgehend unverstanden. Um Erkenntnisse über die pathologische(n) Funktion(en) des integralen Membranproteins Emerin zu gewinnen, wurde dessen spatio-temporäre Transkriptions- und Expressionsmuster während der frühen Embryonalentwicklung im Modellsystem Xenopus laevis charakterisiert. Durch EST-Datenbankanalysen konnten in der pseudotetraploiden Spezies zwei Emerin-Gene (Xemerin1 und -2) identifiziert werden. Im Unterschied zu dem längeren Säuger-Emerin (254 Reste bei Homo sapiens ) konnte allerdings kein Kernlokalisationssignal und auch kein serinreicher Sequenzbereich festgestellt werden. Durch Herstellung monoklonaler Antikörper wurde die subzelluläre und gewebespezifische Lokalisation der Xemerin-Proteine untersucht. Interessanterweise war Xemerin weder in der Immunfluoreszenz noch im Immunblot in Oozyten nachweisbar. Mit dem zweidimensionalen Gelektrophorese-Verfahren NEPHGE konnte gezeigt werden, dass der von uns hergestellte monoklonale Antikörper 59/7 beide Xemerin-Formen erkannte und die Proteine durch unterschiedliche molekulare Massen und isoelektrische Punkte voneinander zu trennen waren. Durch Immunoblotting embryonaler Proteine aus unterschiedlichen Entwicklungsstadien konnte gezeigt werden, dass Xemerin1 und -2 im Laufe der Embryogenese von Xenopus laevis erstmals im Entwicklungsstadium 43 exprimiert werden. Unerwarteterweise konnte durch RT-PCR-Analysen eine Aktivität der Xemerin-Gene während der gesamten Embryogenese belegt werden. Northernblot- und Sequenzanalysen der Xemerin-mRNA zeigten außerordentlich große untranslatierte Bereiche mit snRNP-Bindungsmotiven. Durch zwei voneinander unabhängige Analyseverfahren wurde festgestellt, dass die Xemerin-Genaktivität ab dem Stadium 30 deutlich zunahm. Äußerst interessant war in diesem Zusammenhang die Beobachtung, dass exakt zu diesem Zeitpunkt die Aktivität des XMAN1-Gens, einem weiteren Protein der inneren Kernmembran, signifikant herunterreguliert wurde. Whole-mount in situ Hybridisierungsversuche zeigten einen Xemerin-Expressionsschwerpunkt in neuro-ektodermalen Geweben von Tadpole-Embryonen, wie dies auch von XMAN1 (auch SANE genannt) berichtet wurde. Aufgrund dieser Erkenntnisse wurde angenommen, dass Xemerin und XMAN1 überlappende Funktionen aufweisen. Durch die Herstellung rekombinanter Fusionproteine konnte gezeigt werden, dass XMAN1 eine identische subzelluläre Verteilung wie Xemerin aufwies. In vitro Bindungsassays wiesen eine direkte Wechselwirkung von XMAN1 mit beiden Xemerin-Formen sowie mit Xenopus Lamin A nach. Diese Arbeit konnte durch die Charakterisierung von Xenopus Emerin die Grundlagen für weitere intensive Forschungen legen und zeigt eindeutig, dass das Modellsystem Xenopus laevis mit dem Säugermodell Maus konkurrenzfähig ist, um die krankheitsverursachende Mechanismen der Emery-Dreifuss Muskeldystrophie aufzuklären.