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Aufklärung der Struktur und Charakterisierung des ternären Komplexes aus BMP-2, BMPR-IA und ActR-IIB
(2006)
„Bone Morphogenetic Proteins“ (BMPs) kontrollieren eine Vielzahl unterschiedlichster Prozesse bei der Embryonalentwicklung und der postnatalen Gewebehomöostase. Wie TGF-betas, Activine und andere Mitglieder der TGF-beta Superfamilie vermitteln BMPs ihr Signal durch die Bildung eines aus dem Liganden und zwei Rezeptorsubtypen bestehenden Signalkomplexes. Für die Rezeptoraktivierung ist ein Zwei-Schritt Mechanismus allgemein akzeptiert. Bisher wurde nur der erste Schritt, die Bindung des Liganden an seinen hochaffinen Rezeptor, strukturell untersucht. Der molekulare Mechanismus der anschließenden Rekrutierung des niederaffinen Rezeptortyps war bisher nicht bekannt. Die vorliegende Arbeit beschreibt die Präparation, Kristallisation und Strukturaufklärung des ternären Komplexes aus BMP-2 und den extrazellulären Domänen von BMPR-IA und ActR-IIB. Mit der Kristallstruktur dieses ternären Komplexes kann erstmals der Mechanismus der BMP Rezeptoraktivierung von der Bindung des Liganden bis hin zur Transaktivierung untersucht werden. Der Ligand BMP-2 präsentiert sich hier, im Gegensatz zu anderen Mitgliedern der TGF-beta Superfamilie, als nahezu starre Komponente, um welche die beiden Rezeptortypen symmetrisch angelagert werden. Zwischen den extrazellulären Domänen der Rezeptoren können keine direkten Kontakte beobachtet werden. Die in Zellen beobachtete Kooperativität bei der Rekrutierung des niederaffinen Rezeptors im BMP-2 System ist folglich weder durch allosterische Effekte, noch durch direkte Rezeptor-Rezeptor-Kontakte erklärbar. Vielmehr repräsentiert die Bindung des niederaffinen Rezeptors von BMP-2 einen Minimalmechanismus, bei dem Kooperativität über die Verringerung der Freiheitsgrade durch Lokalisation des Liganden in der Zellmembran erzeugt wird. Die durchgeführten Mutations-/Interaktionsanalysen erlauben vertiefende Einblicke wie Affinität und Spezifität im BMP/Activin-System generiert werden. Es zeigt sich, dass sowohl bei der niederaffinen Interaktion von ActR-IIBecd mit BMP-2 bzw. BMP-7 als auch bei der hochaffinen Bindung von ActA mit ActR-IIBecd ein Großteil der freien Bindungsenergie von denselben hydrophoben Interaktionen getragen wird. Während polare Interaktionen bei der niederaffinen Bindung der BMPs an ActR-IIBecd kaum eine Rolle spielen, stellt die zentrale Wasserstoffbrücke zwischen ActA Ser90(OG) und ActR-IIB Leu61(N) bei der Bildung des Komplexes ActA/ActR-IIBecd eine entscheidende Determinante der hochaffinen Bindung dar. BMP-2 bindet an die Typ II Rezeptoren BMPR-II, ActR-II und ActR-IIB mit nahezu identischer Affinität, daher wird eine promiske Verwendung dieser Rezeptoren angenommen. In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die spezifische Erkennung und Bindung der Typ II Rezeptoren durch den Austausch einzelner Aminosäuren modulierbar ist. Mit den hier gewonnenen Kenntnissen über den molekularen Mechanismus der Typ II Rezeptorerkennung ist nun eine Generierung von BMPs mit definierter Typ II Rezeptorspezifität möglich. Diese BMP-2 Varianten können als Werkzeuge zur Aufklärung von Typ II Rezeptor-spezifischen Signalwegen verwendet werden. Ebenso wäre es denkbar, BMP-2 Varianten mit ausgeprägter Typ II Rezeptor Spezifität in vivo zur Modulation TypII Rezeptor spezifischer Signalwege zu benutzen. Beispielsweise könnte ein auf BMP-2 basierendes ActR-IIB-spezifisches Protein als Myostatin-Antagonist zur Behandlung von Muskeldystrophie eingesetzt werden.
Sugar reward learning in Drosophila : neuronal circuits in Drosophila associative olfactory learning
(2006)
Genetic intervention in the fly Drosophila melanogaster has provided strong evidence that the mushroom bodies of the insect brain act as the seat of memory traces for aversive and appetitive olfactory learning (reviewed in Heisenberg, 2003). In flies, electroshock is mainly used as negative reinforcer. Unfortunately this fact complicates a comparative consideration with other inscets as most studies use sugar as positive reinforcer. For example, several lines of evidence from honeybee and moth have suggested another site, the antennal lobe, to house neuronal plasticity underlying appetitive olfactory memory (reviewed in Menzel, 2001; Daly et al., 2004). Because of this I focused my work mainly on appetitive olfactory learning. In the first part of my thesis, I used a novel genetic tool, the TARGET system (McGuire et al., 2003), which allows the temporally controlled expression of a given effector gene in a defined set of cells. Comparing effector genes which either block neurotransmission or ablate cells showed important differences, revealing that selection of the appropriate effector gene is critical for evaluating the function of neural circuits. In the second part, a new engram of olfactory memory in the Drosophila projection neurons is described by restoring Rutabaga adenlylate cyclase (rut-AC) activity specifically in these cells. Expression of wild-type rutabaga in the projection neurons fully rescued the defect in sugar reward memory, but not in aversive electric shock memory. No difference was found in the stability of the appetitive memories rescued either in projection neurons or Kenyon cells. In the third part of the thesis I tried to understand how the reinforcing signals for sugar reward are internally represented. In the bee Hammer (1993) described a single octopaminergic neuron – called VUMmx1 – that mediates the sugar stimulus in associative olfactory reward learning. Analysis of single VUM neurons in the fly (Selcho, 2006) identified a neuron with a similar morphology as the VUMmx1 neuron. As there is a mutant in Drosophila lacking the last enzymatic step in octopamine synthesis (Monastirioti et al., 1996), Tyramine beta Hydroxylase, I was able to show that local Tyramine beta Hydroxylase expression successfully rescued sugar reward learning. This allows to conclude that about 250 cells including the VUM cluster are sufficient for mediating the sugar reinforcement signal in the fly. The description of a VUMmx1 similar neuron and the involvement of the VUM cluster in mediating the octopaminergic sugar stimulus are the first steps in establishing a neuronal map for US processing in Drosophila. Based on this work several experiments are contrivable to reach this ultimate goal in the fly. Taken together, the described similiarities between Drosophila and honeybee regarding the memory organisation in MBs and PNs and the proposed internal representation of the sugar reward suggest an evolutionarily conserved mechanism for appetitive olfactory learning in insects.
In this century new experimental and computational techniques are adding an enormous amount of information, revealing many biological mysteries. The complexities of biological systems still broach new questions. Till now the main approach to understand a system has been to divide it in components that can be studied. The upcoming new paradigm is to combine the pieces of information in order to understand it at a global level. In the present thesis we have tried to study infectious diseases with such a global ‘Systems Biology’ approach. In the first part the apoptosis pathway is analyzed. Apoptosis (Programmed cell death) is used as a counter measure in different infections, for example viral infections. The interactions between death domain containing proteins are studied to address the following questions: i) How specificity is maintained - showing that it is induced through adaptors, ii) how proliferation/ survival signals are induced during activation of apoptosis – suggesting the pivotal role of RIP. The model also allowed us to detect new possible interacting surfaces. The pathway is then studied at a global level in a time step simulation to understand the evolution of the topology of activators and inhibitors of the pathway. Signal processing is further modeled in detail for the apoptosis pathway in M. musculus to predict the concentration time course of effector caspases. Further, experimental measurements of caspase-3 and viability of cells validate the model. The second part focuses on the phagosome, an organelle which plays an essential role in removal of pathogens as exemplified by M. tuberculosis. Again the problem is addressed in two main sections: i) To understanding the processes that are inhibited by M. tuberculosis; we focused on the phospholipid network applying a time step simulation in section one, which plays an important role in inhibition or activation of actin polymerization on the phagosome membrane. ii) Furthermore, actin polymers are suggested to play a role in the fusion of the phagosome with lysosome. To check this hypothesis an in silico model was developed; we find that the search time is reduced by 5 fold in the presence of actin polymers. Further the effect of length of actin polymers, dimensions of lysosome, phagosome and other model parameter is analyzed. After studying a pathway and then an organelle, the next step was to move to the system. This was exemplified by the host pathogen interactions between Bordetella pertussis and Bordetella bronchiseptica. The limited availability of quantitative information was the crucial factor behind the choice of the model type. A Boolean model was developed which was used for a dynamic simulation. The results predict important factors playing a role in Bordetella pathology especially the importance of Th1 related responses and not Th2 related responses in the clearance of the pathogen. Some of the quantitative predictions have been counterchecked by experimental results such as the time course of infection in different mutants and wild type mice. All these computational models have been developed in presence of limited kinetic data. The success of these models has been validated by comparison with experimental observations. Comparative models studied in chapters 6 and 9 can be used to explore new host pathogen interactions. For example in chapter 6, the analysis of inhibitors and inhibitory paths in three organism leads to the identification of regulatory hotspots in complex organisms and in chapter 9 the identification of three phases in B. bronchiseptica and inhibition of IFN-γ by TTSS lead us to explore similar phases and inhibition of IFN-γ in B. pertussis. Further an important significance of these models is to identify new components playing an essential role in host-pathogen interactions. In silico deletions can point out such components which can be further analyzed by experimental mutations.
Study of Omp85 Family Proteins YaeT and YtfM and Multidrug Export Machineries in Escherichia coli
(2006)
In this study the Omp85 family proteins YaeT and YtfM of Escherichia coli were investigated by using biochemical and electrophysiological methods as well as bioinformatical and structural analysis. In addition, knock-out strains were constructed to further study the relevance of these proteins in vivo. The prediction that Omp85 proteins are composed of two domains, a periplasmic amino-terminal POTRA (polypeptide translocation associated) domain and a carboxy-terminal domain anchoring these proteins in the outer membrane, was confirmed by the construction of mutants. It could be shown that the carboxy-terminal part of the proteins is able to insert into the outer bacterial membrane, even if the POTRA domain is removed. Furthermore, pore-forming activity in the black-lipid bilayer was observed for both full-length proteins as well as their carboxy-terminal membrane located parts. The channels formed by both proteins in the black lipid bilayer showed variable single channel conductance states rather than a defined value for conductance. In 1M KCl, e.g. YaeT forms pores with a channel conductance of 100 to 600 pS containing a most abundant value at 400 pS. This variability is at least reasonable for YaeT due to a prerequisite flexibility of its channel for OMP insertion. YaeT was identified to form a cation selective, YtfM an anion selective channel, which is less pH dependent than YaeT. Another feature of the YaeT channel is that its selectivity and conductance is influenced by charged detergent molecules indicating an accumulation of these molecules in hydrophobic pockets inside the compact channel. YaeT revealed heat-modifiable mobility in SDS-PAGE which is characteristic for β-barrel OMPs, whereas YtfM did not show this behaviour. This result could be explained by sequence alignment and structural comparison of YaeT and YtfM via CD and FTIR spectra displaying much higher β-strand content for the carboxy-terminal part of YaeT compared to YtfM. Since the carboxy-terminal parts were shown to have pore forming ability and are inserted in the OM in vivo, the substitution of the essential protein YaeT by its carboxy-terminal mutant was attempted in a yaeT knock-out strain. The carboxy-terminal half of YaeT was not sufficient to compensate depletion of the full-length protein indicating an important role of the amino-terminus for cell viability. In contrary, YtfM is shown to be a non-essential protein and lack of YtfM had no effects on the composition and integrity of the OM. However, chromosomal deletion of ytfM remarkably reduced the growth rate of cells. This study provides the first detailed investigation of the structure of YaeT and describes its electrophysiological behaviour, which could be a basis for further studies of YaeT and its substrate proteins. Furthermore, YtfM was characterised and its in vivo function was investigated revealing YtfM as the second Omp85 family protein of importance in E. coli. In a second part of this study assembly and function of multidrug efflux pumps were investigated. Drug efflux pumps are tripartite export machineries in the cell envelope of Gram-negative bacteria conferring multidrug resistance and therefore causing severe problems for medical treatment of diseases. Protein structures of all three efflux pump components are solved, but the exact interaction sites are still unknown. Assembly of a hybrid exporter system composed of the Pseudomonas aeruginosa channel tunnel OprM, the E. coli adaptor protein AcrA and its associated transporter AcrB could be shown by chemical cross-linking, even though this efflux pump is not functional. Exchange of the hairpin domain of AcrA by the corresponding hairpin from the adaptor protein MexA of P. aeruginosa restored functionality tested by antibiotic sensitivity assays. This shows the importance of the MexA hairpin domain for functional interaction with the OprM channel tunnel. Interestingly, the hybrid protein was also able to assemble with TolC as outer membrane component to form a functional efflux pump indicating a higher flexibility of TolC compared to OprM concerning interaction partners. Based on these results, an interaction model of the hairpin domain and the channel tunnel on molecular level for AcrA and TolC as well as MexA and OprM, respectively, is presented. This model provides a basis for directed mutagenesis to reveal the exact contact sites of the hairpin of the adapter protein and the outer membrane component
Kathepsin B und L sind lysosomale Cysteinproteasen, die mit einer Reihe von pathologischen Prozessen, wie z. B. Cancerogenese, Tumorangiogenese und Neurodegeneration in Verbindung gebracht werden. Dennoch sind bis jetzt nur wenige Proteinsubstrate beschrieben. Ausserdem sind die Mechanismen der Regulation von Zellproliferation, -invasion und -apoptose durch Kathepsin B und L weitgehend unverstanden. Ein kombinierter Mangel beider Kathepsine führt zu einer frühzeitigen Neurodegeneration in Mäusen, die an neuronale Lipofuszinosen beim Menschen erinnert. In der vorliegenden Studie wurden Unterschiede in der Proteinzusammensetzung von wildtypischen und doppelt-defizienten Gehirnlysosomen quantifiziert. Eine Kombination von subzellulärer Fraktionierung und LC-MS/MS unter Verwendung einer isobarischen Markierung (iTraqTM) erlaubte uns die gleichzeitige Untersuchung von zerebralen Lysosomen aus Wildtyp und Kathepsin B-/-L-/- Mäusen. Ingesamt waren 19 Proteine signifikant erhöht in Kathepsin B-/-L-/- Lysosomen. Die meisten erhöhten Proteine wurden der neuronalen Biosynthese, regenerierenden bzw. endozytotischen oder lysosomalen Kompartimenten zugeordnet. Der Anstieg von Calcyon, dem Delta/Notch- verwandten epidermalen Wachstumsfaktor-Rezeptor (DNER), Neurochondrin, Phospholipase D3, Rab14, Cathepsin D und Apolipoprotein E lässt eine potentielle Rolle von Kathepsin B und L im Axonwachstum und der Synapsenbildung während der postnatalen Entwicklung des Zentralnervensystems vermuten.
Die Lamine gehören zu einer Familie von Proteinen, die als strukturelle Hauptelemente die Kernlamina ausbilden, einen wesentlichen Bestandteil der Kernhülle eukaryontischer Zellen. In Säugern exprimieren differenzierte somatische Zellen die Lamine A, C, B1 und B2. Die Kernhülle in Keimzellen unterscheidet sich in Bezug auf Struktur und Proteinzusammensetzung deutlich von der einer somatischen Zelle. So exprimieren Keimzellen Lamin B1 als einziges der somatischen Lamine und zwei kurze keimbahnspezifische Spleißvarianten, die Lamine C2 und B3. Die vorliegende Arbeit enthält eine detaillierte Analyse des Expressionsmusters und der zellulären Verteilung von Lamin B3 im Verlauf der Spermatogenese der Maus. Die Daten aus RT-PCR, Western Blot und Immunfluoreszenz belegen eindeutig, dass Lamin B3 ausschließlich in postmeiotischen Stadien während der Spermiogenese exprimiert wird. In runden Spermatiden konnte das Protein an der Kernhülle und überraschenderweise auch im Nukleoplasma nachgewiesen werden. Im weiteren Verlauf der Spermiogenese kommt es zu einer Umverteilung des Proteins, es konzentriert sich zunehmend am posterioren Pol des Spermatidenkerns. Damit ist die Lamina während der Säuger-Spermiogenese nur aus B-Typ-Laminen aufgebaut und Lamin B3 ist in Säugern das erste Beispiel für ein Lamin, das selektiv nur in postmeiotischen Stadien der Spermatogenese exprimiert wird. Die ektopische Expression von Lamin B3 in Kulturzellen führt zu einer Deformation der Zellkerne, die eine hakenförmige Gestalt annehmen. Mit Hilfe von Transfektionsexperimenten in COS-7-Zellen konnte eindeutig gezeigt werden, dass die auftretenden morphologischen Veränderungen der Kerne transfizierter Zellen auf die trunkierte zentrale Stäbchendomäne in Lamin B3 zurückzuführen ist. Darüber hinaus zeigte das Protein eine stark erhöhte Löslichkeit im Vergleich zu Lamin B2 und die Analyse transfizierter Kulturzellen mit „fluorescence recovery after photobleaching“ (FRAP) und „fluorescence loss in photobleaching“ (FLIP) ergab, dass ein erheblicher Anteil der Lamin-B3-Moleküle eine hohe Mobilität aufweist, die ebenfalls ausschließlich durch die kurze Stäbchendomäne begründet ist. Die Ergebnisse führen zu dem Schluss, dass Lamin B3 die Kernhülle in Keimzellen flexibler macht, was eine Voraussetzung für einige Vorgänge in der Spermiogenese sein könnte. Mit einem Fusionsprotein aus GST und dem 84 Aminosäuren umfassenden N-Terminus von Lamin B3 wurde über einen „Pull-Down-Assay“ nach möglichen Interaktionspartnern in Keimzellen gesucht. Mit MSY2, MSY2a und MSY4 wurden drei hoch interessante Kandidaten identifiziert. Sie gehören zu den Y-Box-Proteinen, DNA- und RNA-bindende Proteine, die bei der Speicherung und späteren Translation von mRNAs beteiligt sind, u.a. die mRNA von Protamin 1 (diese Form der Regulation von Genexpression hat in der Spermatogenese große Bedeutung). Die Interaktion von Lamin B3 mit diesen Proteinen muss noch überprüft werden, würde aber einen weiteren Bezug zwischen Kernhülle und Chromatinreorganisation in der Spermiogenese herstellen, wie es für die Kernhüllenproteine GCL und LBR bereits gezeigt werden konnte. Außerdem wäre es ein erster Hinweis auf eine funktionelle Bedeutung der N-terminalen Domäne von Lamin B3.
Bakterien müssen ständig in der Lage sein auf Veränderungen in ihrer Umwelt reagieren zu können. Zur Wahrnehmung dieser Veränderungen haben sich unterschiedliche Signaltransduktionssysteme entwickelt. Ein weit verbreiteter und gut charakterisierter Mechanismus zur Signaltransduktion sind die so genannten Zwei-Komponentensysteme. Im Genom von H. pylori konnten nur wenige Bestandteile von Zwei-Komponentensystemen identifiziert werden. Dazu zählen neben dem Chemotaxis-System lediglich drei Histidin-Kinasen, ArsS, CrdS und FlgS, und fünf Response-Regulatoren HP1021, HP1043, ArsR, CrdR und FlgR, die vermutlich Transkriptions-regulatorische Funktionen haben. Zwei der Response-Regulatoren, HP1043 und ArsR als essentiell für das Überleben von H. pylori, während HP1021 einen deutlichen Einfluss auf das Zellwachstum hat, da ein Wachstums-Defekt zu erkennen ist, wenn das entsprechende Gen hp1021 deletiert wird. Eine Deletion von arsS, dem Gen der zugehörigen Histidin-Kinase von ArsR, hat unter Standard-Wachstumsbedingungen keine Auswirkung auf das Zellwachstum von H. pylori. Diese Beobachtung spricht für die Hypothese, dass der Response-Regulator ArsR die Transkription zweier unterschiedlicher Sets von Zielgenen kontrolliert. Demzufolge reguliert der Response-Regulator ArsR nach Säure-induzierter Phosphorylierung durch ArsS die Transkription von Genen, die zur Säureresistenz beitragen, während ArsR im nicht-phosphorylierten Zustand die Transkription von weiteren Zielgenen kontrolliert, von denen mindestens eines für das Zellwachstum essentiell sein sollte. Das durch ArsR~P kontrollierte Regulon konnte bereits weitgehend charakterisiert werden allerdings sind die Zielgene des unphosphorylierten Regulators bislang unbekannt. In der vorliegenden Arbeit konnte die zuvor beschriebene Hypothese bestätigt werden, da gezeigt wurde, dass ein Derivat von ArsR, mit einer Mutation der Phosphorylierungsstelle D52 zu N52, das wildtypische Protein bezüglich des Zellwachstums unter Standardbedingungen funktionell ersetzen kann. Für die Response-Regulatoren HP1021 und HP1043 konnte bislang keine zugehörige Histidin-Kinase identifiziert werden und interessanterweise findet man in der Receiver-Domäne dieser Response-Regulatoren atypische Abweichungen von der Konsensus-Sequenz. Um die Bedeutung dieser atypischen Primärsequenzen für die Funktion dieser Response-Regulatoren zu untersuchen wurden mutierte H. pylori-Stämme konstruiert, die ausschließlich Derivate von HP1021 bzw. HP1043 exprimieren, die in ihrer Receiver-Sequenz der Konsensus-Sequenz entsprachen. Da diese Mutanten sich bezüglich ihres Zellwachstums nicht vom Wildtyp unterscheiden, konnte nachgewiesen werden, dass die atypischen Receiver-Sequenzen der beiden Response-Regulatoren nicht entscheidend für die Funktionen der Response-Regulatoren sind. Weiterhin konnten Indizien dafür gesammelt werden, dass HP1021 und HP1043 hinsichtlich ihrer Aktivierung vermutlich vom üblichen Zwei-Komponentenparadigma abweichen. Derivate von HP1021 und HP1043 mit Mutationen ihrer putativen atypischen Phosphorylierungsstelle sind in der Lage ihre wildtypischen Pendants hinsichtlich der bekannten Phänotypen funktionell zu ersetzen. Somit ist eine Phosphorylierung der Receiver-Domäne dieser Response-Regulatoren keine Voraussetzung für ein normales Zellwachstum von H. pylori. Diese Hypothese wird gestützt durch die Beobachtung, dass ein Ortholog von HP1043 aus C. jejuni CJ0355, das natürlicherweise an der potentiellen Phosphorylierungsstelle einen nicht phosphorylierbaren Aminosäurerest trägt, HP1043 in seiner Funktion ersetzen kann. Es konnte gezeigt werden, dass in vitro keine Phosphorylierung durch radioaktiv markiertes Acetylphosphat stattfindet und dass ein H. pylori-Stamm mit einer Deletion der Gene pta und ackA, welche Proteine kodieren, die bei der Synthese von zellulärem Acetylphosphat benötigt werden, einen normalen Wachstums-Phänotyp zeigt. Zusätzlich konnten in einer massenspektrometrischen Analyse des Proteins HP1021, welches nach Zweidimensionaler Gelelektrophorese von Gesamtzellproteinlysaten aus H. pylori isoliert wurde, keine Hinweise auf eine Serinphosphorylierung entdeckt werden. Es ist daher fraglich ob in vivo eine funktionell relevante Phosphorylierung stattfindet. Die Mechanismen zur Modulation der Regulator-Aktivität von HP1043 und HP1021 bleiben unklar. In der vorliegenden Arbeit konnte demonstriert werden, dass eine strikte Transkriptionskontrolle nicht für die Zellwachstums-assoziierten Funktionen von HP1021 von Bedeutung ist. Dagegen wurden Hinweise darauf erzielt, dass die Expression von HP1043 auf einem posttranskriptionellen und/oder auf einem posttranslationellen Level reguliert wird. Es waren bislang keine Zielgene von HP1021 bekannt. Durch vergleichende Zweidimensionale Gelelektrophorese der H. pylori Stämme 26695 und 26695 1021Δ konnten einige potentielle Zielgene des Response-Regulators HP1021 identifiziert werden.
Mitochondrien verändern dynamisch durch ein balanciertes Verhältnis von Teilung und Fusion die Gestalt ihrer Netzwerke und reagieren so auf interne und externe Signale. Ein Schlülsselprotein der mitochondrialen Teilung ist die Dynamin-verwandte GTPase Dnm1p, die in dieser Arbeit charakterisiert wurde. Da Mitochondrien aufgrund ihres endosymbiontischen Ursprungs zwei Membranen besitzen, erfordert deren Teilung eine besondere Koordination. Unter Verwendung von photokonvertierbarem GFP wird in dieser Arbeit gezeigt, dass in S. cerevisiae die Teilung der inneren und äußeren Membran zeitlich eng gekoppelt verläuft. Dieser Prozess wird durch die GTPase Dnm1p, aber auch durch die Adaptor-Proteine Mdv1p und Caf4p sowie dem integralen Membrananker Fis1p v ermittelt. Dnm1p lagert sich zu Spiralen um den tubulären Strang an und trennt GTP-abhängig die Mitochondrien voneinander. Eine Voraussetzung für die Anlagerung dieser Spiralen stellen Matrix-Konstriktionen dar. In dieser Arbeit wird gezeigt, dass Dnm1p und auch Fis1p für die Ausbildung dieser mitochondrialen Einschnürungen nicht essentiell sind. Die Untersuchung der Verteilung, Orientierung und Größe der Epitop-markierten Dnm1p-Cluster bildet den Schwerpunkt der Arbeit. Weiterhin wird der Einfluss der Teilungsproteine Fis1p, Mdv1p und Caf4p auf diese Dnm1p-Charakteristika ermittelt. Die Analyse basiert auf quantitativen Konfokalmikroskopie-Aufnahmen, zusätzlich werden auch neue hochauflösende Lichtmikroskope (4Pi und STED) zur genauen Lokalisation und Größenbestimmung eingesetzt. Die Ergebnisse zeigen, dass im Wildtyp und in Mdv1p-Deletionsstämmen die Mehrheit der Cluster mit den Mitochondrien assoziiert ist, während in Fis1p- und Caf4p-Deletionszellen die Rekrutierung der Cluster zu den Mitochondrien gestört erscheint. Nur wenige Cluster bilden Spiralen um Matrix-Konstriktionen aus, die überwiegende Mehrheit der nicht an aktuellen Teilungsprozessen beteiligten Dnm1p-Aggregate weist dagegen im Wildtyp und in Mdv1p-Deletionszellen eine polare Orientierung Richtung Zellcortex auf. Die in dieser Arbeit zum ersten Mal beschriebene Polarität ist in Fis1p- und Caf4p-Deletionsstämmen aufgehoben, bleibt jedoch auch nach der Zerstörung des Aktin-Gerüstes aufrechterhalten. Die Ergebnisse der Arbeit deuten darauf hin, dass Dnm1p in einem Komplex mit Fis1p und Caf4p zusätzlich zu seiner Funktion als Teilungsprotein an der Anheftung der Mitochondrien an den Zellcortex beteiligt ist. Zudem scheinen die Adaptorproteine Mdv1p und Caf4p trotz molekularer Ähnlichkeit unterschiedliche Aufgaben in der Zelle zu erfüllen.
Die Technik des optischen Imaging unter Verwendung DNA-codierter Sensoren ermöglicht es, Messungen neuraler Aktivitäten in genetisch definierten Populationen von Neuronen durchzuführen. In der Vielzahl der verschiedenen entwickelten Sensoren konnten die Calciumsensoren bisher das beste Verhältnis zwischen Signal und Rauschen und die beste zeitliche Auflösung aufzeigen. Hierbei handelt es sich in erster Linie um zwei Typen von Sensoren, zum einen ratiometrische Sensoren, deren Signal auf einem Fluoreszenz Resonanz Energie Transfer (FRET) basiert, und zum anderen um zirkulär permutierte Sensoren, die auf einem modifizierten GFP-Molekül basieren, wobei das Signal auf einer veränderten Protonierung des Chromophors beruht. Beide Arten dieser Sensoren wurden schon erfolgreich zum Messen neuraler Aktivitäten in Nervensystemen verschiedener Tierarten verwendet. Ein Teil dieser Arbeit bestand darin, zu untersuchen, welche Sensoren sich für die Messung an einem lebenden Organismus am besten eignen. Hierfür wurden die Eigenschaften von vier verschiedenen FRET basierten Sensoren und zwei der zyklisch permutierten Sensoren nach Expression im zentralen Nervensystem von Drosophila charakterisiert. Die Sensoren wurden in Neuronen zweiter und dritter Ordnung des olfaktorischen Signalwegs exprimiert und ihre Antworten auf physiologische Duftstimulation oder artifiziell induzierte Depolarisation des Gehirns untersucht. Während die calciumabhängigen Signale der zyklisch permutierten Sensoren in der Regel größer waren als die der FRET basierten Sensoren, zeichneten sich letztere durch ein besseres Signal zu Rausch-Verhältnis aus, wenn Bewegungen der fluoreszierenden Strukturen nicht zu vermeiden waren. Dies war auch der ausschlaggebende Grund für die Verwendung eines FRET basierten Sensors im anschließenden Teil der Arbeit. Im zweiten Teil der Arbeit wurde der Effekt untersucht, den die Paarung eines neutralen Stimulus mit einem bestrafenden Stimulus auf dopaminerge Neurone hat. Eine solche Paarung kann zu einer klassischen Konditionierung führen, einer einfachen Form des Lernens, in welcher das Tier einem ursprünglich neutralen Stimulus einen Wert zuordnet, und dadurch sein Verhalten dem Stimulus gegenüber ändert. Die olfaktorische klassische Konditionierung in Drosophila wird seit vielen Jahren intensiv untersucht, um die molekularen und neuronalen Grundlagen von Lernen und Gedächtnis zu charakterisieren. Dabei hat sich gezeigt, dass besonders die Pilzkörper von essentieller Bedeutung für die Ausbildung eines olfaktorischen Gedächtnisses sind. Während das olfactorische System bei Insekten bereits detailiert analysiert wurde, ist über die Neurone, die den bestrafenden Stimulus vermitteln, nur sehr wenig bekannt. Unter Anwendung des funktionellen optischen Calcium Imaging konnte im Rahmen der Arbeit gezeigt werden, dass die Projektionen von dopaminergen Neuronen im Bereich der Loben der Pilzkörper schwach auf die Präsentation eines Duftes, jedoch sehr stark auf eine Stimulation durch einen Elektroschock antworten. Nach mehrmaliger Paarung eines Duftes mit einem Elektroschock während eines Trainings, verlängert sich die Aktivität dieser dopaminergen Neurone auf den bestraften Duft hin im Test ohne Elektroschock drastisch, während die Antwort auf den Kontrollduft keine signifikanten Veränderungen aufweist. Während bei Säugetieren belohnende Reize bei appetitiven Lernvorgängen über dopaminerge Neurone vermittelt werden, spielen bei Drosophila diese Neurone offensichtlich eine Rolle bei der aversiven Konditionierung. Jedoch blieb, auch wenn sich die Rolle des Dopamins im Laufe der Evolution geändert zu haben scheint, die Fähigkeit dieses Neuronentyps, nicht nur auf einen eintreffenden verstärkenden Stimulus zu reagieren, sondern diesen auch vorhersagen zu können, zwischen Säugern und Drosophila erhalten.
Neurotrophe Faktoren haben ein breites Aufgabenfeld und spielen eine wichtige Rolle als Überlebensfaktoren embryonaler Neurone, bei Proliferation und Differenzierung im Nervensystem sowie als Modulatoren synaptischer Plastizität. Im ersten Themenkomplex der vorliegenden Arbeit wurden neurotrophe Faktoren als Modulatoren synaptischer Plastizität und ihr Einfluß auf die BDNF-Regulation im Hippocampus untersucht. Dabei wurde zunächst das selbsthergestellte polyclonale BDNF-Immunserum für die Anwendung in der Immunhistochemie und im Western Blot optimiert, doch es konnten bezüglich BDNF keine Veränderungen in Hippocampi CNTF-defizienter Mäuse gegenüber Wildtyp-Tieren festgestellt werden. Die Ergebnisse der Voruntersuchungen, die im Hippocampus CNTF-defizienter Tiere verminderte BDNF-Level gezeigt hatten, konnten somit nicht verifiziert werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde an CNTF-defizienten Mäusen eine eingeschränkte LTP und LTD nachgewiesen. Zum besseren Verständnis der – laut LTP-Untersuchungen – veränderten Situation an der hippocampalen CA1-Synapse bei CNTF-defizienten Tieren wurden elektronenmikroskopische Bilder dieser Region angefertigt, deren Auswertung keine augenscheinlichen Unterschiede ergab. Im Stratum radiatum der CA1-Region war zudem keine spezifische CNTF-Färbung nachweisbar. Zur Klärung der Frage, ob es IGF-vermittelt nach Training zu hippocampaler BDNF-Hochregulation kommt, wurden Laufradexperimente mit wildtypischen und konditionalen IGF1-Rezeptor-knockout Mäusen durchgeführt und die jeweiligen BDNF-Level untersucht. Dabei wurde BDNF durch Laufradtraining in beiden Genotypen in ähnlichem Maße hochreguliert, was für alternative Wege der BDNF-Hochregulation spricht. Der zweite Themenkomplex befasste sich mit dem Einfluß neurotropher Faktoren auf die Proliferation und Differenzierung in Hippocampus und Cortex. BrdU-Inkorporationsexperimenten zeigten in der Körnerzellschicht des Gyrus dentatus gesteigerte Proliferationsraten bei CNTF-defizienten und CNTF&LIF-defizienten Mäusen, wobei LIF-defiziente Tiere keine veränderten Proliferationsraten zeigten. Untersuchungen an Kulturen cortikaler Vorläuferzellen bestätigten die Hypothese, wonach cortikale Vorläuferzellen zunächst Neurone bilden, die einen Faktor sezernieren, der auf die cortikalen Vorläuferzellen wirkt und sie zur Bildung von Astrozyten veranlasst. Es konnte gezeigt werden, dass CT-1 der Hypothese folgend in vitro und in vivo für die Einleitung der Astrozytogenese im Cortex verantwortlich ist.
This work deals with channel-tunnel dependent multidrug efflux pumps and type I secretion systems, more concrete with the improved classification of the adaptor protein family, the characterization of the TolC-homologue protein HI1462 of Haemophilus influenzae, and the molecular characterization of the interaction between TolC and AcrA of Escherichia coli.
Oviposition site selection in insects is essential in terms of low egg mortality, high offspring survival and therefore a high reproductive output. Although oviposition height could be a crucial factor for the fitness of overwintering eggs, it has rarely been investigated. In this study the oviposition height of a polyphagous leaf beetle, Galeruca tanaceti Linnaeus in different habitats and at different times of the season was examined and its effect on egg clutch mortality was recorded. The leaf beetle occurs as an occasional pest on several agricultural plants. It deposits its eggs within herbaceous vegetation in autumn. Eggs are exposed to numerous biotic and abiotic mortality factors summarized as egg parasitism and winter mortality. Oviposition height of the leaf beetle was not uniform, but changed significantly with the structure of the habitat and during the season. Mean oviposition height per site (70.2±4.9 cm) was significantly higher than mean vegetation height (28.4±2.4 cm). Height of plants with egg clutches attached and oviposition height were significantly positively correlated. The results suggest that females try to oviposit as high as possible in the vegetation and on the plants selected. In accordance with this, the probability of egg parasitism and of winter egg clutch mortality significantly declined with increasing oviposition height. A preference of G. tanaceti for oviposition sites high up in the vegetation might therefore have evolved due to selection pressures by parasitoids and winter mortality.
Abstract: Background Social insects show considerable variability not only in social organisation but also in the temporal pattern of nest cycles. In annual eusocial sweat bees, nest cycles typically consist of a sequence of distinct phases of activity (queen or workers collect food, construct, and provision brood cells) and inactivity (nest is closed). Since the flight season is limited to the time of the year with sufficiently high temperatures and resource availability, every break reduces the potential for foraging and, thus, the productivity of a colony. This apparent waste of time has not gained much attention. Results We present a model that explains the evolution of activity breaks by assuming differential mortality during active and inactive phases and a limited rate of development of larvae, both reasonable assumptions. The model predicts a systematic temporal structure of breaks at certain times in the season which increase the fitness of a colony. The predicted pattern of these breaks is in excellent accordance with field data on the nest cycle of the halictid Lasioglossum malachurum. Conclusion Activity breaks are a counter-intuitive outcome of varying mortality rates that maximise the reproductive output of primitively eusocial nests.
This thesis extends the classical theoretical work of Macevicz and Oster (1976, expanded by Oster and Wilson, 1978) on adaptive life history strategies in social insects. It focuses on the evolution of dynamic behavioural patterns (reproduction and activity) as a consequence of optimal allocation of energy and time resources. Mathematical modelling is based on detailed empirical observations in the model species Lasioglossum malachurum (Halictidae; Hymenoptera). The main topics are field observations, optimisation models for eusocial life histories, temporal variation in life history decisions, and annual colony cycles of eusocial insects.
Best disease, also termed vitelliform macular dystrophy type 2, VMD2, (OMIM #153700), is an autosomal dominant, early onset macular dystrophy associated with a remarkable accumulation of lipofuscin-like material within and beneath the retinal pigment epithelium (RPE). The VMD2 gene mutated in Best disease encodes a 585 amino acid putative transmembrane protein named bestrophin, and is preferentially expressed in the RPE. The protein has a complex membrane topology with 4-6 putative transmembrane domains (TMDs) and is presumably involved in Ca2+-dependent transport of chloride ions across the membrane. The vast majority of known disease-associated alterations are missense mutations nonrandomly distributed across the highly conserved N-terminal half of the protein with clusters near the predicted TMDs. The mechanism connecting Best disease pathology with the identified mutations or the Cl- channel function is not yet clear. To further elucidate the biological function of the bestrophin protein and to identify the molecular mechanisms underlying the disease, a search for interacting partners of bestrophin was performed using the GAL4-based yeast two hybrid system (Y2H). Screening of a bovine RPE cDNA library with various truncated bestrophin baits resulted in the identification of 53 putative interacting partners of bestrophin. However, verification of the interaction has excluded all candidate clones. Our comprehensive Y2H analyses suggest that bestrophin may not be suitable for traditional yeast two hybrid screens likely due to the fact that the protein is integral to the membrane and even fragments thereof may not be transported to the nucleus which is, however a prerequisite for protein interaction in the yeast system. Bestrophin belongs to a large family of integral membrane proteins with more than 100 members identified to date originating from evolutionarily diverse organisms such as mammals, insects and worms. The most distinctive feature of the bestrophin family, besides the invariant RFP (arginine-phenylalanine-proline) domain, is an evolutionarily highly conserved N-terminal region. To clarify the phylogenetic relationship among bestrophin homologues and to identify structural and functional motifs conserved across family members, a bioinformatics/phylogenetic study of the conserved N-terminal region was conducted. Phylogenetic analysis of the bestrophin homologues reveals existence of four evolutionary conserved family members in mammals, with high homology to the human VMD2, VMD2-L1 to L3 proteins. The significant level of protein sequence similarity between divergent species suggests that each of the bestrophin family members has a unique, Chapter One: Summary 2 evolutionarily conserved function and that the divergence of bestrophin into several family members occurred before the divergence of individual mammalian species.
Die Gattung Listeria umfasst sechs bekannte Arten ubiquitär vorkommender Gram-positiver, nicht sporulierender Stäbchenbakterien. Von diesen Spezies sind Listeria monocytogenes und L. ivanovii in der Lage bei Mensch und Tier das Krankheitsbild der Listeriose zu verursachen (Rocourt & Seeliger, 1985; Vázquez-Boland et al., 2001b; Weis & Seeliger, 1975), wobei L. ivanovii vorwiegend bei Tieren als Krankheitserreger vorkommt (Cummins et al., 1994; Hof & Hefner, 1988). L. monocytogenes gilt als wichtiges Modell für ein intrazelluläres Pathogen, das mit Hilfe seiner Internaline auch in nicht-professionelle Phagozyten invadieren (Gaillard et al., 1991; Lingnau et al., 1995) und sich dank einer Reihe weiterer Virulenzfaktoren im Zytoplasma vermehren, fortbewegen und Nachbarzellen infizieren kann (Tilney & Portnoy, 1989). Die beiden pathogenen Arten und das apathogene L. seeligeri besitzen eine als LIPI-1 bezeichnete Pathogenitätsinsel (Gouin et al., 1994; Kreft et al., 2002). Internalingene sind bei L. monocytogenes teilweise geclustert und bei L. ivanovii zu einem großen Teil in einer LIPI-2 genannten Pathogenitätsinsel organisiert (Domínguez-Bernal et al., 2006; Dramsi et al., 1997; Gaillard et al., 1991; Raffelsbauer et al., 1998). Die Expression vieler dieser Virulenzgene wird durch das zentrale Regulatorprotein PrfA gesteuert, dessen Gen prfA selbst Teil der LIPI-1 ist (Domínguez-Bernal et al., 2006; Leimeister-Wächter et al., 1990; Lingnau et al., 1995; Mengaud et al., 1991a). Im Rahmen dieser Arbeit sollten die Internaline InlC, InlE, InlG und InlH von L. monocytogenes näher untersucht werden. Dazu wurden rekombinante His6-markierte Internaline aufgereinigt und polyklonale Antiseren gegen die Internaline A, B, E, G und H hergestellt. Darüber hinaus gelang die Herstellung zweier monoklonaler Antikörper gegen InlG. Obwohl die Antikörper gegen InlG und InlE ihre rekombinanten Antigene gut dekorieren, konnten mit ihnen keine Proteine in Zellwand- oder Überstandspräparaten von L. monocytogenes EGD und EGDe detektiert werden. Das Antiserum gegen InlH kreuzreagierte mit InlA und auch schwach mit anderen Internalinen. In Zellwandpräparaten von L. monocytogenes dekorierte es ein ~50 kDa schweres Protein, welches mit InlH identisch sein könnte. Es fehlt in inlG/H/E Deletionsmutanten und wird in einer inlA/B Deletionsmutante stärker exprimiert. Im Kulturüberstand ist es etwas schwerer, wie man es von einem Protein mit LPXTG Motiv erwartet, das nicht von Sortase (Bierne et al., 2002; Garandeau et al., 2002) prozessiert wurde. In L. monocytogenes EGDe wird dieses ~50 kDa Protein um ein bis zwei dekadische Größenordungen stärker exprimiert als in L. monocytogenes EGD. Die Expression des Proteins war bei 30 und 37 °C gleich stark und wurde nicht durch PrfA reguliert. In Zellwandpräparaten von L. ivanovii ATCC 19119 dekorierten die Seren gegen InlA und InlH ein Protein das in seiner Größe dem InlA von L. monocytogenes entspricht. Mit Hexosaminidase Assays zur Untersuchung von Zelladhärenz (nach Landegren, 1984) an rekombinante His6-markierte Internaline konnte keine Interaktion der Internaline InlE, InlG oder InlH mit Oberflächenfaktoren von Caco-2, HeLa oder HepG2 Zellen nachgewiesen werden, während Positivkontrollen mit InlA und InlB weitestgehend erwartungsgemäß ausfielen. InlC besitzt jedoch offenbar einen bisher noch nicht genauer identifizierten Rezeptor auf der Zelloberfläche. An InlC und EGF adhärierten Caco-2 Zellen stark wachstumsphasenabhängig und etwa tausendfach schwächer als an InlA. Die beste Bindung erfolgte bei semikonfluent gewachsenen Zellen, die am Vortag ausgesät wurden. Unter diesen Bedingungen war auch die von Bergmann et al. beobachtete unterstützende Wirkung von InlC auf die InlA-abhängige Invasion am größten (Bergmann et al., 2002). In dieser Arbeit wurden außerdem die Promotoren von Internalingenen aus L. ivanovii, sowie weitere Virulenzgene (plcA, hly, actA) der Spezies L. monocytogenes, L. ivanovii und L. seeligeri mit Hilfe eines zellfreien in vitro Transkriptionssystems (Lalic-Mülthaler et al., 2001) untersucht, um deren PrfA-Abhängigkeit und Aktivität unabhängig von physiologischen Faktoren analysieren zu können, da die PrfA-Aktivität in vivo pleiotrop reguliert wird (Dickneite et al., 1998; Ermolaeva et al., 2004; Milenbachs et al., 1997; Milenbachs Lukowiak et al., 2004; Renzoni et al., 1997; Ripio et al., 1996). Dafür wurde in dieser Arbeit RNA-Polymerase aus L. monocytogenes ΔprfA ΔsigB (Stritzker et al., 2005) isoliert. Gleichzeitig wurde die Aktivität von rekombinanten His6-markierten PrfA Proteinen untersucht. Dazu wurden die PrfA Proteine von L. monocytogenes (m-PrfA und hyperaktives m-PrfA* (Ripio et al., 1997b)), L. ivanovii (i-PrfA) und L. seeligeri (s-PrfA), so wie ein Hybridprotein (sm-PrfA) aufgereinigt. Das Hybridprotein sm-PrfA entspricht s-PrfA bis auf die letzten 38 Aminosäurereste, die durch jene von m-PrfA ersetzt wurden. ...
Clonality analysis in B-Cell Chronic Lymphocytic Leukemia (B-CLL) associated with Richter's syndrome
(2006)
B-cell chronic lymphocytic leukemia (B-CLL) comprises 90% of chronic lymphoid leukemias in Western countries and patients with B-CLL have a heterogeneous clinical course. Approximately 3-5% of B-CLL patients encounter transformation to an aggressive lymphoma, mainly diffuse large B-cell lymphoma (DLBCL) or Hodgkin’s lymphoma (HL) which has been defined as Richter’s syndrome and is associated with a poor clinical outcome. The mutational status of the immunoglobulin heavy chain variable region (IgVH) gene not only implies the developmental stage at which the neoplastic transformation occurs in a given B-cell lymphoma, but also constitutes an important prognostic factor in B-CLL, since B-CLL patients with unmutated IgVH genes usually have a poor clinical outcome. Sparse molecular analyses performed in Richter’s syndrome so far suggest that it can occur in B-CLL patients carrying mutated or unmutated IgVH genes, and tumor cells in DLBCL or HL can be clonally identical to the B-CLL clone or arise as an independent, secondary lymphoma. To determine the clonal relationship between DLBCL or Hodgkin/Reed-Sternberg (HRS) cells and pre-existing B-CLL cells in a larger series, to identify the IgVH gene usage and the mutational status and to explore possible prognostic factors in B-CLL undergoing Richter’s transformation, we utilized a PCR-based GeneScan approach with subsequent sequencing of the IgVH genes. In cases with HRS/HRS-like cells laser capture microdissection (LCM) was employed to isolate these cells. In addition, a thorough morphological and immunohistochemical analysis was performed. In total, specimens from 48 patients were investigated including 40 cases of Richter’s syndrome and additional 8 cases of B-CLL cases with the presence of CD30-positive HRS-like cells. Among 40 cases of Richter’s syndrome, 34 B-CLL cases showed transformation to DLBCL and 6 cases transformed from B-CLL to HL. Sequencing was performed in 23 paired B-CLL and DLBCL cases. In 18 cases, B-CLL and DLBCL were clonally identical, whereas DLBCL developed as a clonally independent neoplasm in 5 patients. Among the clonally related pairs, 11 out of 15 cases carried unmutated IgVH genes in both the B-CLL and DLBCL component, whereas 5 of 6 B-CLL cases that showed transformation to HL carried mutated IgVH genes. HRS cells in two samples and HRS-like cells in one sample were clonally distinct from the B-CLL clone and infected by EBV, whereas one sample of HRS-like cells was related to the clone from the surrounding B-CLL cells and did not express latent membrane protein-1 (LMP1). The VH genes VH3-23, VH3-74, VH1-2 and VH3-9 were overused in B-CLL cases that transformed to DLBCL, whereas VH4-34 and VH3-48 were used in over half of the B-CLL cases with transformation to HL. Immunohistochemical staining of ZAP70 was significantly associated with unmutated IgVH genes in B-CLL cases undergoing Richter’s transformation. Clinical follow-up data could be obtained from 24 patients. The median survival times of B-CLL patients with transformation to DLBCL or HL were 7 and 21 months, respectively. No significantly different survival times were found between clonally related or unrelated cases, or between IgVH-mutated or -unmutated cases. We conclude that in Richter’s transformation, DLBCL can evolve by clonal transformation of the pre-existing B-CLL clone or occur as an independent, clonally unrelated neoplasm. In the majority of cases (78% in our series), B-CLL and DLBCL are clonally identical. In a subset of patients, however, DLBCL develops as an independent secondary neoplasm that is not clonally related to the B-CLL. Clonal transformation into DLBCL predominantly occurs in B-CLL patients with unmutated IgVH genes, whereas most B-CLL patients that show transformation to HL or CD30-positive HRS-like cells carry mutated IgVH genes. The tendency that IgVH-unmutated B-CLL transforms to DLBCL and IgVH-mutated B-CLL transforms to HL implies different transformation pathways in the two subtypes of Richter’s syndrome. In addition, important pathogenetic differences are likely to exist between DLBCL cases derived from a pre-existing B-CLL as compared to de novo DLBCL cases, since de novo DLBCL is usually characterized by mutated IgVH genes. The biased usage of IgVH genes in the two subtypes of Richter’s syndrome suggests a possible role for antigen involvement in tumorigenesis also in B-CLL cases that undergo Richter’s transformation. Finally, EBV-association in the HL variant of Richter’s syndrome occurs more frequently in clonally unrelated secondary malignancies.
Untersuchungen virulenzattenuierter Listeria monocytogenes Stämme als Impfstoffträger im Mausmodell
(2006)
Virulenzattenuierte Stämme des Gram-positiven Pathogens Listeria monocytogenes (Lm) stellen optimale Kandidaten als Träger für heterologe Proteinantigene in die Maus dar. Lm repliziert nach Befreiung aus dem primären phagosomalen Kompartiment sehr effizient und schnell im Zytosol sehr vieler nicht-phagozytischer Wirtszellen als auch in professionellen antigenpräsentierenden Zellen (APC). Diese Fähigkeit in relevante immunologische APCs einzudringen und zu replizieren, erlaubt die zielgerichtete Übertragung heterologer Antigene in die MHC-Klasse-I- und MHC-Klasse-II-Präsentationswege, um so eine effektive zelluläre Immunität zu etablieren. In der vorliegenden Arbeit wurden die in vivo Effizienzen der Aktivierung von antigen-spezifischen CD8+ and CD4+ T-Zellen miteinander verglichen, sobald das plasmidkodierte Proteinantigen Ovalbumin (OVA) in Form von bakteriell exprimierten und exportierten Proteinen, von cDNA oder mRNA durch die jeweiligen virulenzattenuierten Lm trpS Stämme in das Zytosol von antigenpräsentierenden Zellen freigesetzt wurde. Die Freisetzung wurde durch ein Listeria-spezifisches Phagenlysin, welches von den Bakterien vorwiegend im Zytosol der Wirtszelle exprimiert wird, unterstützt. Die Übertragung dieser unterschiedlichen biologisch-aktiven Moleküle durch die autolysierenden Listerien führte im Falle des Proteins und der mRNA erfolgreich zu einer MHC-Klasse-I-Präsentation eines Ovalbumin-Peptides (SIINFEKL), welche letztendlich eine adaptive zelluläre Immunität unter Beteiligung von T-Gedächtniszellen induzierte. Dabei stellte sich die Übertragung des Proteins durch Lm als die effizienteste Strategie im Induzieren einer zellulären adaptiven Immunantwort mit gegen Ovalbumin gerichteten CD8 und CD4 T-Gedächtniszellen heraus. Autolysierende Listerien, welche die plasmidkodierende OVA-DNA übertrugen, lösten dagegen keine OVA-spezifische T-Zellantwort aus. Da sich der Trägerstamm Lm trpS aufgrund der Autolysiskassette zwar als virulenzattenuiert herausgestellt hatte, jedoch bei höher Applikationsdosis dieses Stammes es nur zu einer unvollständigen Lysis kam, wurden die jeweiligen Effizienzen weiterer noch stärker attenuierter autolysierender Lm Stämme als Überträger des Ovalbumins (Lm Mutanten trpS hlyW491A und (trpS aroA aroB)) bestimmt. Beide ermöglichten die OVA-Präsentation über MHC-Klasse-I-Moleküle mit nachfolgender klonaler Expansion spezifischer CD8+ T-Zellen in vergleichbaren signifikanten Werten zum WT Stamm trpS. Ferner wurde zum ersten Mal eine signifikante Präsentation des OVAs über MHC-Klasse-I-Moleküle durch die autolysierende Mutante trpS hlyW491A, welche die plasmidkodierende DNA freisetzte, nachgewiesen. Die autolysierende Lm (trpS aroA aroB) Mutante in hoher CFU (5107) stellte sich dabei als ein sehr vielversprechender Träger des heterologen Proteinantigens heraus, da sie im Gegensatz zum autolysierenden Stamm Lm trpS eine sehr geringe Leberschädigung hervorrief. In diesem Zusammenhang wurde festgestellt, das durch Freisetzung von OVA Antigenen in das Zytosol oder ins Phagosom von APCs, welche von den jeweiligen Lm (trpS aroA aroB) Stämmen als exportiertes, zellwandverankertes oder intrazellulär verbleibendes Protein exprimiert wurden, vergleichbare Häufigkeiten an proliferierten OVA-spezifischen CD8+ T-Zellen induzierten werden konnten. Es zeigten sich jedoch deutliche Unterschiede in der Aktivierung antigen-spezifischer CD4+ T-Zellen durch diese Lm (trpS aroA aroB) OVA-Trägerstämme. Die Strategie der Übertragung exportierter Proteine ins Phagosom oder ins Zytosol antigenpräsentierender Zellen war die wirkungsvollste, um gleichzeitig effiziente MHC-Klasse-I- und MHC-Klasse-II-restringierte Antigenpräsentationen in vivo zu induzieren. Es wurden alternative plasmidkodierende Lysiskassetten für die Freisetzung von DNA-Vakzinen (Baktofektion) aus den Bakterien konstruiert, die alle aus Lyseproteinen eines Listeria-spezifischen Phagens und einem vorangestellten zytosolischen listeriellen Promotor bestehen. Diese wurden in ihrer Effizienz mit der ursprünglich eingesetzten Lysiskassette PactA-ply118 verglichen. Dabei wurde beobachtet, dass zwei von den vier neukonstruierten Lysiskassetten in einige Zellinien vergleichbare Baktofektionsraten erzielten. Jedoch ist die ursprüngliche Phagenlysin-Kassette PactA-ply118 für die Übertragung von Plasmid-DNA in das Zytosol von Wirtszellen die wirksamste, da diese in vivo zu einer besonders hohen Attenuation der Bakterien führte.
Obwohl Protein-Mikroarrays ursprünglich aus dem gut entwickelten und fest etablierten DNA-Pendant entstanden sind, repräsentierte jedoch die Umstellung der Mikroarray-Technik von der DNA- auf die Proteinanalyse aufgrund der enormen physikalisch-chemischen Variabilität der Proteine, deren relativ niedrigen Stabilität und der komplexen Mikrospot-Kinetik eine große technologische Herausforderung. Deshalb setzt das Vorhaben, die Technik der Antikörper–Mikroarrays von ihrem konzeptuellen Zustand ausgehend zu einem robusten, real funktionierenden Werkzeug zu etablieren, nicht nur eine Vielzahl an technologischen Lösungen, sondern auch eine systematische und physikalisch begründete Herangehensweise in dieser technologischen Entwicklung voraus. Das waren im Wesentlichen die zwei wichtigsten, der eigentlichen Entwicklung der Antikörper-Mikroarrays untergeordneten Ziele der Arbeit. Mit dem Ziel, Antikörper-Mikroarrays prinzipiell zu etablieren und eine optimale Immobilisierungschemie für deren Herstellung zu finden, wurden im ersten Teil dieser Arbeit mehrere chemische Beschichtungen von Glasslides optimiert, unterschiedliche Spotting-Bedingungen von Antikörpern für verschiedene Oberflächen getestet und verschiedene Blockierungsverfahren und Strategien zur Aufbewahrung von Slides analysiert. Anschließend wurde eine Reihe von kommerziellen und selbst hergestellten chemisch beschichteten Slides unter den optimierten Bedingungen miteinander verglichen. Als Hauptergebnis dieser Untersuchung wurde die Herstellung der Antikörper-Microarrays etabliert. Unter anderem konnte im Zuge dieser systematischen Analyse gezeigt werden, dass Epoxysilan-modifizierte Oberflächen am besten geeignet sind. Diese Oberfläche ist heutzutage auf dem Gebiet der Protein-Microarrays am weitesten verbreitet und wurde für alle weiteren Studien innerhalb dieser Dissertation verwendet. Die Entwicklung der Antikörper-Mikroarrays in den letzten Jahren demonstrierte erhebliche Schwierigkeiten im Erreichen der nötigen Sensitivität und Reproduzierbarkeit. Um dieser Problematik auf den Grund zu gehen, und die Mikrospot-Kinetik experimentell untersuchen zu können, wurde im Rahmen dieser Arbeit eine modifizierte und für den Fall der Mikrorrays angepasste Variante des Two-Compartment Modells (TCM) entwickelt. TCM ermöglicht auf eine phänomenologische Weise, d.h., dass Diffusionskoeffizienten, Mischintensität oder Dichte der Bindungsstellen nicht bekannt sein müssen, eine quantitative experimentelle Analyse der Mikrospot-Kinetik unter Berücksichtigung von Effekten des Massentransports. Um die phänomenologischen TCM-Werte interpretieren zu können und um den Mechanismus der Mikrospot-Reaktion zu untersuchen, wurden auch andere, für die Mikrospot-Kinetik relevante, klassische Theorien an die Bedingungen der Mikrospot-Reaktion angepasst und mit dem modifizierten TCM mathematisch verbunden. Als das erste in der Mikroarray-Technologie mathematisch-physikalische Werkzeug dieser Art hat die hier entwickelte Theorie ein großes Potential, auch in den anderen verwandten Techniken wie DNA- oder Peptid-Mikroarrays Verwendung zu finden. Außerdem wurde innerhalb dieser Arbeit ein anderes einheitliches theoretisches Modell entwickelt, das eine kinetische Simulation von verschiedenen Reaktionsphasen sowohl für konventionelle als auch für Mikrospot-Immunoassays ermöglicht. Im Rahmen dieser Arbeit konnte für einen typischen Standard-Antikörper-Mikroarray theoretisch und experimentell eine lang andauernde, stark massentransportabhängige Mikrospot-Kinetik beschrieben werden. Es konnte gezeigt werden, dass das Erreichen eines thermodynamischen Gleichgewichts in Mikroarrays wegen eines relativ langsamen Ligandentransports zum Spot eine lange Zeit dauert, je nach Bindungskonstante, Diffusionsgeschwindigkeit und Ligandenkonzentration mehrere Stunden bis hin zu Wochen. In dieser Arbeit wurde ein neues physikalisches Konzept, das dem heutzutage dominierenden Blickwinkel, der sogenannten ambient analyte Theorie, opponierend gegenübersteht, formuliert. Auch konnten viele Konsequenzen fürs Design und die zukünftige Entwicklung dieser relativ neuen Technologie gezogen werden. Als eine logische Folge der massentransportlimitierten Reaktionen ist das Design eines Antikörper-Mikroarray ein kritischer Punkt für die Leistung des Verfahrens. Im Laufe der experimentellen und/oder theoretischen Betrachtungen konnte gezeigt werden, dass eine Reihe allgemeiner Parameter wie Größe eines Spots, Spotting-Muster, Inkubationsgeometrie, Volumen und Konzentration einer Probe, Viskosität des Inkubationspuffers und Mischintensität die Reaktionsraten auf den Spots insgesamt um mehrere Größenordnungen beeinflusst. Ist die maximale Rate des Massentransports in einem Mikroarray-Verfahren gewährleistet, kann dann auch die maximale Bindungsleistung der Spots, die durch die Dichte der Bindungsstellen, Bindungsaffinität, Inkubationszeit und andere relevante Parameter eingestellt wird, erreicht werden. Aber nicht nur in der Inkubationsphase, sondern auch bei den Wasch- und Detektionsschritten sollte die gleiche Liste der Parameter berücksichtigt werden. Durch die Optimierung all dieser Parametern konnte eine deutliche Verbesserung der Sensitivität von Antikörper-Mikroarrays in der Protein-Expressionsanalyse von klinischen Blutproben erzielt werden In einer weiteren Studie zur Analyse von unterschiedlichen Detektionsverfahren konnte die Sensitivität und Reproduzierbarkeit der etablierten Antikörper-Mikroarrays weiter verbessert werden. Eine Reihe unterschiedlicher Markierungssubstanzen mit NHS (N-hydroxysuccinimide) und ULS (universal linkage system) reaktiven Gruppen wurden innerhalb drei Detektionsverfahren untersucht: 1) eine direkte Probenmarkierung mit Fluoreszenzfarbstoffen, 2) Markierung der Probe mit Biotin-Substanzen und nachfolgender Detektion mittels fluoreszenzmarkierten Extravidin und 3) Markierung der Probe mit Fluorescein-Substanzen mit Anti-Fluorescein-Detektion. Aus den Erfahrungen der vorherigen kinetischen Untersuchungen wurde hier vorerst das kinetische Verhalten des Testsystems analysiert und optimale Inkubationsbedingungen festgelegt. Anschließend wurden optimale Konzentrationen all dieser Substanzen für die Markierung von Blutplasma bestimmt. Im Vergleich zur direkten Fluoreszenzmarkierung resultierten sich die indirekten Detektionsverfahren mit Biotin- und Fluorescein-Substanzen in wesentlich besseren Signal-zu-Hintergrund-Verhältnissen. In einer anschließenden Vergleichsanalyse zeigten sich einige Substanzen wie Biotin-ULS oder Fluoresceine-NHS als am besten geeignet für eine Protein-Expressionsanalyse von Blutplasma. Sensitivitäten im femtomolaren Bereich konnten mittels der etablierten Antikörper-Mikroarrays sowohl für eine markierte Antigenmischung als auch für komplexe klinische Proben innerhalb dieser Dissertation erzielt werden. Viele niedrig konzentrierte Proteine wie beispielsweise Zytokine, die normalerweise in einer piko-oder femtomolaren Konzentration im Blut vorliegen, wurden in dieser Arbeit mit sehr hohen Signal-zu-Hintergrund-Verhältnissen detektiert. Das hier beschriebene Verfahren öffnet zusätzliche Möglichkeiten für schnelle, kostengünstige und unbeschränkt erweiterungsfähige Mikrospot-Immunoassays.