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Der neurotrophe Wachstumsfaktor BDNF gehört neben NGF, NT-3 und NT-4/5 zur Familie der Neurotrophine. Er spielt eine wichtige Rolle für Überleben und Differenzierung von Nervenzellen und ist insbesondere auch verantwortlich für die Regulation synaptischer Plastizität. Besonders im Hippocampus, dem Ort der höchsten Expression von BDNF im adulten Gehirn, wirkt BDNF bei den Vorgängen von Lernen und Gedächtnis mit, welches als Phänomen der LTP untersucht werden kann. Bisher ist eine Lokalisation von BDNF-Protein mittels Immunfluoreszenz-Techniken im Gehirn der Maus oder Ratte nur sehr schwer gelungen. In den meisten Arbeiten gelang die Lokalisation von BDNF über den Nachweis von mRNA oder im Western Blot, die Gruppe von Conner et al. konnte einen qualitativen Nachweis von BDNF-Protein mittels eines eigens hergestellten Antiserums erbringen (Conner et al. 1997). Das Ziel dieser Arbeit war die Entwicklung eines Antiserums gegen BDNF zur subzellulären Lokalisation mittels Immunhistochemie. Durch die Verwendung von Immunfluoreszenz-gekoppelten Sekundärantikörpern sollte zum einen eine quantitative Bestimmung von BDNF möglich sein, zum anderen sollte durch die Möglichkeit einer nahezu dreidimensionalen Darstellung des Gewebes mittels Vibratomschnitten auch eine Aussage über eine genauere Lokalisation von BDNF gemacht werden können. Um den immunhistochemischen Nachweis von BDNF-Protein im Hippocampus der Maus mittels Immunfluoreszenz führen zu können, wurde zunächst ein geeignetes Anti-serum benötigt. Zwei zu Vergleichszwecken ausgetestete kommerzielle Antikörper zeigten keine Färbung. Nach dem Vorbild zweier Arbeitsgruppen (Yan et al. 1997b und Conner et al. 1996, 1997) wurde ein Antiserum gegen humanes rekombinantes BDNF in Kaninchen hergestellt. Das Antiserum erhielt den Namen „BDNF RabbitB“. Die Spezifität des Antiserums wurde mittels Western Blot und in der Zellkultur anhand von Hühnchen-DRGs überprüft. Im Western Blot zeigte das Antiserum eine spezifische Anfärbung von rekombinantem BDNF sowie im Hippocampus-Proteinextrakt. In der Kontrolle mit Präimmunserum zeigte sich keine Anfärbung. In der Zellkultur mit Hühnchen-DRGs konnte eine blockierende Wirkung des Antiserums in Gegenwart von BDNF als neurotrophem Wachstumsfaktor im Zellkulturmedium nachgewiesen werden, es zeigte sich eine signifikante Reduktion des Überlebens von Zellen bei einer Verdünnung des Antiserums von 1:1.000. Das Präimmunserum zeigte keine Wirkung. Eine Kreuzreaktivität mit NGF als strukturähnlichem Protein konnte ausgeschlossen werden, da das Antiserum in Gegenwart von NGF im Kulturmedium keine Wirkung zeigte. Anschließend galt es, die Methoden für die Immunhistochemie mit diesem Antiserum zu optimieren, da es Hinweise gab, daß gerade die Immunhistochemie neurotropher Faktoren sehr sensibel auf verschiedene Methoden reagiert. Daher wurden sowohl die Fixierungsmethode, unterschiedliche Gewebeschnitte, verschiedene Puffersysteme und immunhistochemische Färbemethoden untersucht und verglichen. Die Standard-Fixierungsmethode mit Phosphat-Puffer, modifiziert nach der Methode nach Yan et al. 1997b mit maximal 2 h Nachfixierung stellte sich als beste Methode heraus. Eine Kombination zweier verschiedener Puffer (TBS und PB) innerhalb der Fixierung ist ungünstig. Daher sollte innerhalb einer Methode immer bei einem Puffersystem geblieben werden, wobei hier insgesamt bei dem Vergleich von PBS, TBS und TRIS-Puffer sowohl in der Fixierung als auch in der Färbemethode dem Phosphat-Puffer der Vorzug gegeben wird, welches auch das Standard-System darstellt. Bei den Gewebeschnitten sind, wie ursprünglich geplant Vibratomschnitte zu bevorzugen. Insgesamt konnten jedoch mögliche Ursachen für die Anfälligkeit der BDNF-Immunreaktivität bei Fixierungs- und Färbemethoden hier nicht abschließend erklärt werden. Problematisch war die ausgeprägte Hintergrundfärbung des Antiserums v.a. in der Immunhistochemie, die nicht ausreichend behoben werden konnte. Insofern sollte das Antiserum für die Verwendung bei immunhistochemischen Färbungen noch weiter optimiert werden. Für die Verwendung in der Zellkultur ist das Antiserum auf Grund seiner BDNF-blockierenden Eigenschaften gut einsetzbar. Im Western Blot sollte „BDNF RabbitB“ in einer Verdünnung von 1:5.000, in Zellkultur mit 1:1.000 und in der Immunhistochemie mit Vibratomschnitten mit 1:2.000 eingesetzt werden.
In der Embryonalentwicklung von Insekten, Nematoden und Vertebraten reguliert der delta-notch-Signalweg vielfältige Zelldifferenzierungsvorgänge wie die laterale Inhibierung, Zelllinien-Entscheidungen und die Bildung von Grenzen. In Vertebraten aktivieren die transmembranen Liganden delta-like 1, 3 oder 4, bzw. jagged 1 oder 2 einen notch-Rezeptor (notch1, 2, 3 oder 4). Dessen intrazelluläre Domäne bildet im Zellkern mit rbp-j und weiteren Proteinen einen Aktivator-Komplex, der an den Promotor der notch-Zielgene bindet. Neben drei hes-Genen zählen dazu die Gene hey1, hey2 und heyL, die alle eng verwandt sind mit hairy und den Genen des Enhancer of Split-Komplexes (E(spl)) bei Drosophila melanogaster. Die hey-Gene sind in der Maus unter anderem während der Entwicklung von Niere, Arterien, Herz, Nervensystem, Thymus und Somiten spezifisch exprimiert. Um die Bedeutung des heyL-Gens für die Bildung dieser Organe zu untersuchen, wurden heyL-Knockoutmäuse generiert, bei denen jedoch keine morphologischen Veränderungen oder Erkrankungen erkennbar waren. Die durch entsprechende Verpaarung erhaltenen heyL/1-Doppelknockoutmäuse wiesen in der F9-Rückkreuzungsgeneration einen Ventrikel-Septum-Defekt (VSD) auf und verstarben größtenteils ein bis zwei Tage nach der Geburt. Ähnliche Krankheitssymptome zeigen die mit anderen Komponenten des delta-notch-Signalweges in Verbindung gebrachten Erbkrankheiten „Fallot´sche Tetralogie“ (ToF) und das Alagille Syndrom (AGS). Vergleichbare VSDs treten auch bei hey2-Knockoutmäusen auf. Es stellte sich daher die Frage, welche Zielgene des hey2-Transkriptionsfaktors an der Herzbildung beteiligt sind. Literaturbekannte HEY2-Zielgen-Kandidaten sind beim Menschen Follistatin (FST), Keratin 2-7 (KRT2-7) und das epitheliale V-ähnliche Antigen (EVA1). Durch antisense RNA in situ Hybridisierung von wildtypischen und hey2-Knockoutmausschnitten konnten jedoch keine unterschiedlichen Expressionsmuster entdeckt werden. Eigene Microarray-Analysen mit RNA aus hey2-überexprimierenden, humanen 293-Zelllinien identifizierten das Neurofilamentgen NEFL als HEY2-Zielgenkandidat. Bei der in situ Hybridisierung von wildtypischen und hey2-Knockoutmäusen mit einer Probe für das nefl-Gen konnten jedoch keine unterschiedlichen Expressionsmuster erkannt werden, so dass nefl in vivo vermutlich komplexer reguliert wird. Neben den Ventrikel-Septum-Defekten zeigen die heyL/1-Doppelknockoutmäuse einen zweiten abnormalen Phänotyp. Die embryonalen Thymi dieser Tiere sind kleiner als die der wildtypischen Mäuse. Die detaillierte Analyse der Thymozyten-Subpopulationen erbrachte, dass die niedrigere Zellzahl vor allem zu Lasten der doppelt positiven Thymozyten geht. Grund hierfür könnte eine teilweise Blockierung der Entwicklung zwischen der zweiten und dritten Phase des zuvor durchlaufenen doppelt negativen Stadiums sein, denn die absolute Zahl der DN3-Thymozyten ist um über 90 Prozent verringert. Die Blockierung des delta-notch-Signalweges durch Zugabe eines -Sekretase-Inhibitors führte ebenfalls zu einer Verringerung der DN3-Zellen in der gleichen Größenordnung, jedoch im Gegensatz zu den heyL/hey1-Doppelknockout-Thymi gleichzeitig zur Verdreifachung der absoluten Zahl der DN2-Zellen. Diese Unterschiede unterstreichen die Bedeutung weiterer notch-Zielgene wie beispielsweise hes1. Ob die beobachteten Veränderungen in der Entwicklung der Thymozyten Folgen für die Immunabwehr haben, wurde im Rahmen von Immunisierungen mit Trinitrophenyl (TNP)-Ovalbumin untersucht. Hierbei zeigte sich eine Erhöhung der IgG2a und IgG2b Werte und eine Reduktion der IgG1 Produktion bei den heyL/hey1-Doppelknockoutmäusen, während die IgM-Werte zwischen den verschiedenen Mausgenotypen keine signifikanten Unterschiede aufwiesen. Die IgG-Veränderungen deuten darauf hin, dass die T-Zellen vermehrt in die TH1-Zelldifferenzierungsrichtung getrieben werden und die TH2-Cytokinproduktion verringert ist. Bei den hey-Knockoutmäusen waren aufgrund des Expressionsprofils der hey-Gene nicht nur Veränderungen in der Herzentwicklung und im Thymus erwartet worden, sondern auch in der Somitogenese. Dies gilt im Besonderen für die bereits zuvor generierten hey2-Knockoutmäuse, denn hey2 ist im präsomitischen Mesoderm zyklisch exprimiert. Im Gegensatz zu den Knockoutmäusen des verwandten und ebenfalls zyklisch exprimierten hes1-Gens, litten jedoch weder die heyL/hey1-Doppelknockoutmäuse, noch die hey2-Knockoutmäuse an Defekten in der Somitogenese. Während die Bedeutung der Genexpression der hey-Gene in der Somitogenese weiterhin unklar sind, konnten Erkenntnisse über die Funktionen von heyL und hey1 in der Herzentwicklung und bei der Ausreifung der Thymozyten gewonnen werden. Die Identifizierung von hey-Zielgenen in diesen Entwicklungsprozessen kann das Verständnis des delta-notch-Signalweges erweitern, die Ursachen von Erbkrankheiten aufklären helfen und möglicherweise Therapiestrategien aufzeigen.
Untersuchungen virulenzattenuierter Listeria monocytogenes Stämme als Impfstoffträger im Mausmodell
(2006)
Virulenzattenuierte Stämme des Gram-positiven Pathogens Listeria monocytogenes (Lm) stellen optimale Kandidaten als Träger für heterologe Proteinantigene in die Maus dar. Lm repliziert nach Befreiung aus dem primären phagosomalen Kompartiment sehr effizient und schnell im Zytosol sehr vieler nicht-phagozytischer Wirtszellen als auch in professionellen antigenpräsentierenden Zellen (APC). Diese Fähigkeit in relevante immunologische APCs einzudringen und zu replizieren, erlaubt die zielgerichtete Übertragung heterologer Antigene in die MHC-Klasse-I- und MHC-Klasse-II-Präsentationswege, um so eine effektive zelluläre Immunität zu etablieren. In der vorliegenden Arbeit wurden die in vivo Effizienzen der Aktivierung von antigen-spezifischen CD8+ and CD4+ T-Zellen miteinander verglichen, sobald das plasmidkodierte Proteinantigen Ovalbumin (OVA) in Form von bakteriell exprimierten und exportierten Proteinen, von cDNA oder mRNA durch die jeweiligen virulenzattenuierten Lm trpS Stämme in das Zytosol von antigenpräsentierenden Zellen freigesetzt wurde. Die Freisetzung wurde durch ein Listeria-spezifisches Phagenlysin, welches von den Bakterien vorwiegend im Zytosol der Wirtszelle exprimiert wird, unterstützt. Die Übertragung dieser unterschiedlichen biologisch-aktiven Moleküle durch die autolysierenden Listerien führte im Falle des Proteins und der mRNA erfolgreich zu einer MHC-Klasse-I-Präsentation eines Ovalbumin-Peptides (SIINFEKL), welche letztendlich eine adaptive zelluläre Immunität unter Beteiligung von T-Gedächtniszellen induzierte. Dabei stellte sich die Übertragung des Proteins durch Lm als die effizienteste Strategie im Induzieren einer zellulären adaptiven Immunantwort mit gegen Ovalbumin gerichteten CD8 und CD4 T-Gedächtniszellen heraus. Autolysierende Listerien, welche die plasmidkodierende OVA-DNA übertrugen, lösten dagegen keine OVA-spezifische T-Zellantwort aus. Da sich der Trägerstamm Lm trpS aufgrund der Autolysiskassette zwar als virulenzattenuiert herausgestellt hatte, jedoch bei höher Applikationsdosis dieses Stammes es nur zu einer unvollständigen Lysis kam, wurden die jeweiligen Effizienzen weiterer noch stärker attenuierter autolysierender Lm Stämme als Überträger des Ovalbumins (Lm Mutanten trpS hlyW491A und (trpS aroA aroB)) bestimmt. Beide ermöglichten die OVA-Präsentation über MHC-Klasse-I-Moleküle mit nachfolgender klonaler Expansion spezifischer CD8+ T-Zellen in vergleichbaren signifikanten Werten zum WT Stamm trpS. Ferner wurde zum ersten Mal eine signifikante Präsentation des OVAs über MHC-Klasse-I-Moleküle durch die autolysierende Mutante trpS hlyW491A, welche die plasmidkodierende DNA freisetzte, nachgewiesen. Die autolysierende Lm (trpS aroA aroB) Mutante in hoher CFU (5107) stellte sich dabei als ein sehr vielversprechender Träger des heterologen Proteinantigens heraus, da sie im Gegensatz zum autolysierenden Stamm Lm trpS eine sehr geringe Leberschädigung hervorrief. In diesem Zusammenhang wurde festgestellt, das durch Freisetzung von OVA Antigenen in das Zytosol oder ins Phagosom von APCs, welche von den jeweiligen Lm (trpS aroA aroB) Stämmen als exportiertes, zellwandverankertes oder intrazellulär verbleibendes Protein exprimiert wurden, vergleichbare Häufigkeiten an proliferierten OVA-spezifischen CD8+ T-Zellen induzierten werden konnten. Es zeigten sich jedoch deutliche Unterschiede in der Aktivierung antigen-spezifischer CD4+ T-Zellen durch diese Lm (trpS aroA aroB) OVA-Trägerstämme. Die Strategie der Übertragung exportierter Proteine ins Phagosom oder ins Zytosol antigenpräsentierender Zellen war die wirkungsvollste, um gleichzeitig effiziente MHC-Klasse-I- und MHC-Klasse-II-restringierte Antigenpräsentationen in vivo zu induzieren. Es wurden alternative plasmidkodierende Lysiskassetten für die Freisetzung von DNA-Vakzinen (Baktofektion) aus den Bakterien konstruiert, die alle aus Lyseproteinen eines Listeria-spezifischen Phagens und einem vorangestellten zytosolischen listeriellen Promotor bestehen. Diese wurden in ihrer Effizienz mit der ursprünglich eingesetzten Lysiskassette PactA-ply118 verglichen. Dabei wurde beobachtet, dass zwei von den vier neukonstruierten Lysiskassetten in einige Zellinien vergleichbare Baktofektionsraten erzielten. Jedoch ist die ursprüngliche Phagenlysin-Kassette PactA-ply118 für die Übertragung von Plasmid-DNA in das Zytosol von Wirtszellen die wirksamste, da diese in vivo zu einer besonders hohen Attenuation der Bakterien führte.
Die Lamine gehören zu einer Familie von Proteinen, die als strukturelle Hauptelemente die Kernlamina ausbilden, einen wesentlichen Bestandteil der Kernhülle eukaryontischer Zellen. In Säugern exprimieren differenzierte somatische Zellen die Lamine A, C, B1 und B2. Die Kernhülle in Keimzellen unterscheidet sich in Bezug auf Struktur und Proteinzusammensetzung deutlich von der einer somatischen Zelle. So exprimieren Keimzellen Lamin B1 als einziges der somatischen Lamine und zwei kurze keimbahnspezifische Spleißvarianten, die Lamine C2 und B3. Die vorliegende Arbeit enthält eine detaillierte Analyse des Expressionsmusters und der zellulären Verteilung von Lamin B3 im Verlauf der Spermatogenese der Maus. Die Daten aus RT-PCR, Western Blot und Immunfluoreszenz belegen eindeutig, dass Lamin B3 ausschließlich in postmeiotischen Stadien während der Spermiogenese exprimiert wird. In runden Spermatiden konnte das Protein an der Kernhülle und überraschenderweise auch im Nukleoplasma nachgewiesen werden. Im weiteren Verlauf der Spermiogenese kommt es zu einer Umverteilung des Proteins, es konzentriert sich zunehmend am posterioren Pol des Spermatidenkerns. Damit ist die Lamina während der Säuger-Spermiogenese nur aus B-Typ-Laminen aufgebaut und Lamin B3 ist in Säugern das erste Beispiel für ein Lamin, das selektiv nur in postmeiotischen Stadien der Spermatogenese exprimiert wird. Die ektopische Expression von Lamin B3 in Kulturzellen führt zu einer Deformation der Zellkerne, die eine hakenförmige Gestalt annehmen. Mit Hilfe von Transfektionsexperimenten in COS-7-Zellen konnte eindeutig gezeigt werden, dass die auftretenden morphologischen Veränderungen der Kerne transfizierter Zellen auf die trunkierte zentrale Stäbchendomäne in Lamin B3 zurückzuführen ist. Darüber hinaus zeigte das Protein eine stark erhöhte Löslichkeit im Vergleich zu Lamin B2 und die Analyse transfizierter Kulturzellen mit „fluorescence recovery after photobleaching“ (FRAP) und „fluorescence loss in photobleaching“ (FLIP) ergab, dass ein erheblicher Anteil der Lamin-B3-Moleküle eine hohe Mobilität aufweist, die ebenfalls ausschließlich durch die kurze Stäbchendomäne begründet ist. Die Ergebnisse führen zu dem Schluss, dass Lamin B3 die Kernhülle in Keimzellen flexibler macht, was eine Voraussetzung für einige Vorgänge in der Spermiogenese sein könnte. Mit einem Fusionsprotein aus GST und dem 84 Aminosäuren umfassenden N-Terminus von Lamin B3 wurde über einen „Pull-Down-Assay“ nach möglichen Interaktionspartnern in Keimzellen gesucht. Mit MSY2, MSY2a und MSY4 wurden drei hoch interessante Kandidaten identifiziert. Sie gehören zu den Y-Box-Proteinen, DNA- und RNA-bindende Proteine, die bei der Speicherung und späteren Translation von mRNAs beteiligt sind, u.a. die mRNA von Protamin 1 (diese Form der Regulation von Genexpression hat in der Spermatogenese große Bedeutung). Die Interaktion von Lamin B3 mit diesen Proteinen muss noch überprüft werden, würde aber einen weiteren Bezug zwischen Kernhülle und Chromatinreorganisation in der Spermiogenese herstellen, wie es für die Kernhüllenproteine GCL und LBR bereits gezeigt werden konnte. Außerdem wäre es ein erster Hinweis auf eine funktionelle Bedeutung der N-terminalen Domäne von Lamin B3.
Diese Arbeit zeigt den zeitlichen Verlauf der geometrischen und funktionellen kardialen Änderungen während chronischer Druckinduktion des Mäuseherzens nach kontrollierter Banding-Operation der Aorta thoracalis im Langzeitverlauf von insgesamt 26 Wochen. Als Kontrollgruppe dienten Tiere, die sich zum gleichen Zeitpunkt einer Pseudo-Operation (Sham-Operation) unterzogen. Zur Erfassung der kardialen Funktionsparameter sowie der Dynamik wurde schnelle hochauflösende MR-Kinobildgebung in einem 7 Tesla Magneten mit Hilfe eines Mikroskopie-Gradientensystems unter Isofluran-Narkose durchgeführt. Erfasst wurden hierbei die Parameter enddiastolisches Volumen (EDV), endsytolisches Volumen (ESV), Schlagvolumen (SV), Auswurffraktion (EF), Herzminutenvolumen (HMV), Herzindex (CI), linksventrikuläre (LV) Masse, LV-Massenindex, LV-Wanddicke endsytolisch und enddiastolisch sowie LV-Entleerungs- und Füllungsrate. Zusätzliche Zeit-Volumen-Kurven wurden berechnet. Zu jedem Untersuchungszeitpunkt wurde eine histologische Aufarbeitung des linken Ventrikels durchgeführt. Die Kardiomyozytengröße wurde nach einer Hämalaun-Eosin-(HE)-Färbung planimetrisch lichtmikroskopisch bestimmmt. Der Grad der einsetzenden Fibrose wurde mit einer Picro-Sirius-Rot(PSR)-Färbung und nachfolgender Mikroskopie mit zirkulär polarisiertem Licht bestimmt. Es zeigten sich die typischen linksventrikulären Veränderungen der druckinduzierten Hypertrophie, die sich in vier Stufen einteilen lässt: Akutphase bis sieben Tage nach Operation, Kompensationsphase bis zwei Wochen nach Operation, Umbauphase bis sieben Wochen nach Operation und die Dekompensationsphase ab sieben Wochen nach Operation. Die Kollagendichte hatte sich zum Beispiel 26 Wochen nach Operation verdoppelt im Vergleich zur Erstuntersuchung. Die zeitliche, funktionelle und histologische Erfassung der linksventrikulären Hypertrophie ist eine wichtige Grundlage für die Planung weiterer Studien, besonders in Hinblick auf den Einsatz von Modellen mit transgenen Tieren sowie Tieren mit Gen-Knockout. Vorteil der kardialen mikroskopischen Magnetresonanztomographie (MRT) ist der Einsatz als Kontrollmethode der Auswirkungen der genetischen Manipulation nahezu direkt nach der Geburt. Entscheidend ist die umfassende kardiovaskuläre Phänotyp-Charakterisierung der Maus als Schlüssel für die Anwendung der experimentell gewonnen Erkenntnisse zum weiteren Verständnis der Morphologie und funktionellen Abläufe des Herzen sowie der sich daraus ableitenden Therapiemöglichkeiten am menschlichen Herzen. Eine Anwendung dieser Bildgebungsmethode an der Maus ist in der Zukunft zum Beispiel auch denkbar für die Untersuchung von Remodeling-Prozessen nach Myokard-Infarkt, regionaler Herzmuskelfunktion unter Verwendung der Stress-Cinematographie, MR-Tagging- sowie Phasenkontrast-Bildgebung und der myokardialen First-Pass-Perfusionsbildgebung in Kombination mit dem späten Kontrastmittel-Enhancement nach Myokardinfarkt.
Neurotrophe Faktoren haben ein breites Aufgabenfeld und spielen eine wichtige Rolle als Überlebensfaktoren embryonaler Neurone, bei Proliferation und Differenzierung im Nervensystem sowie als Modulatoren synaptischer Plastizität. Im ersten Themenkomplex der vorliegenden Arbeit wurden neurotrophe Faktoren als Modulatoren synaptischer Plastizität und ihr Einfluß auf die BDNF-Regulation im Hippocampus untersucht. Dabei wurde zunächst das selbsthergestellte polyclonale BDNF-Immunserum für die Anwendung in der Immunhistochemie und im Western Blot optimiert, doch es konnten bezüglich BDNF keine Veränderungen in Hippocampi CNTF-defizienter Mäuse gegenüber Wildtyp-Tieren festgestellt werden. Die Ergebnisse der Voruntersuchungen, die im Hippocampus CNTF-defizienter Tiere verminderte BDNF-Level gezeigt hatten, konnten somit nicht verifiziert werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde an CNTF-defizienten Mäusen eine eingeschränkte LTP und LTD nachgewiesen. Zum besseren Verständnis der – laut LTP-Untersuchungen – veränderten Situation an der hippocampalen CA1-Synapse bei CNTF-defizienten Tieren wurden elektronenmikroskopische Bilder dieser Region angefertigt, deren Auswertung keine augenscheinlichen Unterschiede ergab. Im Stratum radiatum der CA1-Region war zudem keine spezifische CNTF-Färbung nachweisbar. Zur Klärung der Frage, ob es IGF-vermittelt nach Training zu hippocampaler BDNF-Hochregulation kommt, wurden Laufradexperimente mit wildtypischen und konditionalen IGF1-Rezeptor-knockout Mäusen durchgeführt und die jeweiligen BDNF-Level untersucht. Dabei wurde BDNF durch Laufradtraining in beiden Genotypen in ähnlichem Maße hochreguliert, was für alternative Wege der BDNF-Hochregulation spricht. Der zweite Themenkomplex befasste sich mit dem Einfluß neurotropher Faktoren auf die Proliferation und Differenzierung in Hippocampus und Cortex. BrdU-Inkorporationsexperimenten zeigten in der Körnerzellschicht des Gyrus dentatus gesteigerte Proliferationsraten bei CNTF-defizienten und CNTF&LIF-defizienten Mäusen, wobei LIF-defiziente Tiere keine veränderten Proliferationsraten zeigten. Untersuchungen an Kulturen cortikaler Vorläuferzellen bestätigten die Hypothese, wonach cortikale Vorläuferzellen zunächst Neurone bilden, die einen Faktor sezernieren, der auf die cortikalen Vorläuferzellen wirkt und sie zur Bildung von Astrozyten veranlasst. Es konnte gezeigt werden, dass CT-1 der Hypothese folgend in vitro und in vivo für die Einleitung der Astrozytogenese im Cortex verantwortlich ist.