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Diabetes mellitus is an incurable, metabolic disease, which is associated with severe long-term complications. The in vitro generation of pancreatic β-cells from human induced pluripotent stem cells (hiPSCs) represent a promising strategy for a curative therapy of diabetes mellitus. However, current differentiation strategies largely fail to produce functional β-cells in vitro and require an additional in vivo transplantation to achieve terminal maturation. Previous studies demonstrated a beneficial effect of the extracellular matrix (ECM) on the survival and sustained function of adult, isolated islets of Langerhans. This raises the question whether organ-specific cell-ECM interactions might represent the missing link driving the final stage of β-cell development. In order to address this issue, this study investigated the impact of the pancreas ECM on in vitro β-cell differentiation and its use for the establishment of a pancreatic endocrine organ model.
To this purpose, a pancreas-specific ECM scaffolds (PanMa) was derived from porcine pancreata using whole organ decellularization with Sodium Deoxycholate. In a first step, the generated PanMa was thoroughly characterized using (immuno-) histological stainings, scanning electron microscopy and DNA quantification as well as perfusion and recellularization experiments with endothelial cells. Based on these data, a scoring system (PancScore) for a standardized PanMa generation was developed. Next, the generated PanMa was tested for the presence of tissue-specific ECM features. Therefore, the biophysical and physico-structural characteristics, such as rigidity, porosity and hygroscopy were analyzed using rheological measurements, particle diffusion analyses as well as a water evaporation assay and compared to the properties of ECM scaffolds derived from porcine small intestine (SISser) and lung (LungMa) to examine organ-specific scaffold cues. Following the thorough scaffold characterization, the impact of the PanMa on pluripotency and early development of hiPSC was studied. To this purpose, gene and protein expression of hiPSCs during maintenance culture and spontaneous differentiation on the PanMa were assessed. In a next step, the impact of the PanMa on the pancreatic endocrine differentiation of hiPSCs was tested. Therefore, the PanMa was used as a liquid media supplement or as a solid scaffold during the directed differentiation of hiPSC towards either pancreatic hormone-expressing cells (Rezania et al. 2012; Rezania et al. 2014) or maturing β-cells (Rezania et al. 2014). The impact of the PanMa on the generated cells was examined by gene expression analysis, immunohistochemical staining of important stage markers, as well as glucose stimulated insulin secretion assays. In a last part of this study, the potential of the PanMa for the prolonged culture of hiPSC derived endocrine cells for the establishment of an in vitro organ model of the endocrine pancreas was examined. Therefore, a PanMa-derived hydrogel was generated and used for the encapsulation and culture of hiPSC-derived hormone-expressing cells (HECs). The influence of the PanMa-hydrogel culture was analyzed on gene, protein and functional level by gene expression analysis, immunohistochemical stainings and glucose stimulated insulin secretion.
Whole organ decellularization resulted in the generation of an acellular PanMa scaffold, with low amounts of residual DNA and a preserved ECM micro- and ultrastructure, including important ECM components, such as collagen I, III and IV. Furthermore, the PanMa maintained an intact vessel system and was verified as cytocompatible as demonstrated by the successful recellularization of the arterial system with human endothelial cells. In comparison to SISser and LungMa, the PanMa was characterized as a relative soft, hygroscopic scaffold with a collagen-fiber based structure. Furthermore, the findings indicate that the ECM-specific properties have a relevant effect on the stem cell character and early multi-lineage decisions of hiPSCs. In this regard, maintenance of hiPSCs on the PanMa resulted in a slightly changed expression of pluripotency genes (OCT4, SOX2 and NANOG) and a weak immunohistochemical signal for NANOG protein, indicating a PanMa-dependent impact on hiPSC pluripotency. Strikingly, this presumption was corroborated by the finding that culture on the PanMa promoted an endodermal development of hiPSCs during spontaneous differentiation. In line with that, pancreatic differentiation of hiPSC on both the PanMa and SISser resulted in a significant decrease of glucagon and somatostatin gene expression as well as an unaltered insulin expression, suggesting an ECM-driven suppression of the development of non β-cell endocrine cells. However, this change did not result in an improved glucose stimulated insulin secretion of the generated HECs. Moreover, use of the PanMa as a hydrogel allowed prolonged culture of these cells in a defined culture system. HECs were viable after 21 days of culture, however already showed an altered islet morphology as well as a slightly decreased glucose stimulated insulin secretion.
Altogether, this study demonstrates a relevant biological effect of tissue specific ECM cues on the in vitro differentiation of hiPSCs. More specifically, the data indicate an involvement of the ECM in the endocrine commitment of hiPSC-derived pancreatic cells during directed differentiation highlighting the ECM as an important regulator of pancreatic development. Collectively, these findings emphasize the relevance of the ECM for the fabrication of functional hiPSC-derived cell types and suggest a much stronger consideration of organ specific ECM cues for tissue engineering approaches as well as clinical translation in regenerative medicine.
Das zentrale Paradigma der Systembiologie zielt auf ein möglichst umfassendes Ver-ständnis der komplexen Zusammenhänge biologischer Systeme. Die in dieser Arbeit angewandten Methoden folgen diesem Grundsatz.
Am Beispiel von drei auf Basis von Datenbanken und aktueller Literatur rekonstruier-ten Netzwerkmodellen konnte in der hier vorliegenden Arbeit die Gültigkeit analyti-scher und prädiktiver Algorithmen nachgewiesen werden, die in Form der Analy-sesoftware Jimena angewandt wurden. Die daraus resultierenden Ergebnisse sowohl für die Berechnung von stabilen Systemzuständen, der dynamischen Simulation, als auch der Identifikation zentraler Kontrollknoten konnten experimentell validiert wer-den. Die Ergebnisse wurden in einem iterativen Prozess verwendet werden um das entsprechende Netzwerkmodell zu optimieren.
Beim Vergleich des Verhaltens des semiquantitativ ausgewerteten regulatorischen Netzwerks zur Kontrolle der Differenzierung humaner mesenchymaler Stammzellen in Chondrozyten (Knorpelbildung), Osteoblasten (Knochenbildung) und Adipozyten (Fett-zellbildung) konnten 12 wichtige Faktoren (darunter: RUNX2, OSX/SP7, SOX9, TP53) mit Hilfe der Berechnung der Bedeutung (Kontrollzentralität der Netzwerkknoten identifi-ziert werden). Der Abgleich des simulierten Verhaltens dieses Netzwerkes ergab eine Übereinstimmung mit experimentellen Daten von 47,2%, bei einem widersprüchlichen Verhalten von ca. 25%, dass unter anderem durch die temporäre Natur experimentel-ler Messungen im Vergleich zu den terminalen Bedingungen des Berechnung der stabilen Systemzustände erklärt werden kann.
Bei der Analyse des Netzwerkmodells der menschlichen Immunantwort auf eine Infek-tion durch A. fumigatus konnten vier Hauptregulatoren identifiziert werden (A. fumi-gatus, Blutplättchen, hier Platelets genannt, und TNF), die im Zusammenspiel mit wei-teren Faktoren mit hohen Zentralitätswerten (CCL5, IL1, IL6, Dectin-1, TLR2 und TLR4) fähig sind das gesamte Netzwerkverhalten zu beeinflussen. Es konnte gezeigt werden, dass sich das Aktivitätsverhalten von IL6 in Reaktion auf A. fumigatus und die regulato-rische Wirkung von Blutplättchen mit den entsprechenden experimentellen Resultaten deckt.
Die Simulation, sowie die Berechnung der stabilen Systemzustände der Immunantwort von A. thaliana auf eine Infektion durch Pseudomonas syringae konnte zeigen, dass die in silico Ergebnisse mit den experimentellen Ergebnissen übereinstimmen. Zusätzlich konnten mit Hilfe der Analyse der Zentralitätswerte des Netzwerkmodells fünf Master-regulatoren identifiziert werden: TGA Transkriptionsfaktor, Jasmonsäure, Ent-Kaurenoate-Oxidase, Ent-kaurene-Synthase und Aspartat-Semialdehyd-Dehydrogenase.
Während die ersteren beiden bereits lange als wichtige Regulatoren für die Gib-berellin-Synthese bekannt sind, ist die immunregulatorische Funktion von Aspartat-Semialdehyd-Dehydrogenase bisher weitgehend unbekannt.
In der vorliegenden Arbeit wurden die Einflüsse verschiedener genotoxischer Substanzen auf Säugertierzellen untersucht. Da ein Organismus der Ontogenese unterliegt und sich Zellen aus Stamm- und Vorläuferzellen entwickelt, gilt es diese ursprünglichen Zellen vor äußeren Einflüssen zu schützen. Da bisher kaum Untersuchungen von Zellen in verschiedenen Differenzierungsstadien durchgeführt wurden, wurden unter Verwendung vieler unterschiedlicher biologischer Endpunkte Effekte auf die Vitalität, Proliferation, Mitose und Apoptose dieser Zellen untersucht. Zudem erfolgte eine Interpretation der Ausbildung von Mikrokernen, Entstehung von DNS-Schäden und der zugrundeliegenden Reparaturmechanismen.
So konnte mit Hilfe der Untersuchungen der hämatopoetischen Stammzellen und der TK6-Zellen postuliert werden, dass hämatopoetische Stammzellen weitestgehend weniger empfindlich gegenüber Zytostatika (Doxorubicin, Vinblastin, Methylmethansulfonat und Mitomycin C) sind als die lymphoblastoide Zelllinie TK6, welche in der Entwicklungshierarchie den Stammzellen folgt. Die Befürchtung, dass der Mikrokerntest in immortalisierten TK6-Zellen als Grundlage für Genotoxizitätsuntersuchungen nicht genügen würden, konnte mit Hilfe der Versuchsergebnisse dieser Arbeit widerlegt werden. Die Ergebnisse belegen, dass der Mikrokerntest in TK6-Zellen relevant ist, da TK6-Zellen empfindlicher auf genotoxische Agentien im Vergleich zu hämatopoetischen Stammzellen reagieren.
Bei der Untersuchung der Leukämiezelllinie HL-60 wurden die Effekte klassischer (Vinblastin, Vincristin, Vinflunin und Vinorelbin) mit neu synthetisierten Vinca-Alkaloiden (4-Chlorochablastin, 4-Chlorochacristin, 16a, 17b und 18a) verglichen. Vinca-Alkaloide werden sehr häufig mit Nebenwirkungen, wie Neuropathien assoziiert, welche während einer Chemotherapie oftmals zu Therapieabbrüchen durch die Patienten führen. Aus diesem Grund war es erstrebenswert, neuartige Vinca-Alkaloide zu entwickeln, welche weniger Nebenwirkungen aber zugleich eine ähnliche Wirksamkeit aufweisen. Obwohl die Potenz der neuen Substanzen niedriger war als bei Vinblastin, Vincristin und Vinorelbin, zeigte ein Teil eine ähnliche Wirkung wie das Vinca-Alkaloid Vinflunin auf die Krebszelllinie HL-60 auf. Die Ergebnisse diese Arbeit können als erste Indikation in vitro genommen werden, dass sich diese Substanzen in der Krebstherapie als wirksam erweisen könnten und nach weiteren Ergebnissen in vivo als therapeutische Alternativen in Betracht gezogen werden.
Auch bei der vergleichenden Untersuchung von exponentiell wachsenden mit differenzierten Zelllinien konnten Unterschiede detektiert werden. Die Zelllinie HT-22, welche selbst keine Krebszelllinie ist, zeigte nach Differenzierung zu nicht exponentiell wachsenden Zellen eine erhöhte Empfindlichkeit gegenüber dem Alkylanz Methylmethansulfonat, was auf einer verminderten Basenexzisionsreparatur beruhen könnte. Auch die differenzierte Form der Adenokarzinom-Zelllinie CaCo2 zeigte eine gesteigerte Sensitivität gegenüber dem Topoisomerase II-Inhibitor Etoposid auf, wohingegen der unselektive Topoisomerase II-Hemmer Doxorubicin keinen Effekt aufwies. Um den Sachverhalt zu klären ob die festgestellten Unterschiede auf das Enzym Topoisomerase II zurückzuführen oder zellartspezifisch waren, wurden weitere Analysen der Zelllinien HL-60 und deren differenzierten Zellart durchgeführt. Auch hier konnten signifikante Unterschiede bei der Einzelzellgelelektrophorese nach Behandlung mit Doxorubicin und Etoposid festgestellt werden. Neben den in dieser Arbeit nachgewiesenen Unterschieden bei der Reparatur zwischen den Zelltypen, könnten aber auch weitere Faktoren zu Varianzen führen und die Mutagenitätsforschung beeinflussen. Folglich ist davon auszugehen, dass zukünftige Testungen bei der pharmakologischen Substanzentwicklung in verschiedenen Zellsystemen von Nöten sind, bevor neue Substanzen zugelassen werden.
Alles in allem konnte die Komplexität der Ergebnisse zwischen Zellen der verschiedenen Differenzierungsstadien in dieser Arbeit aufgezeigt werden. Deswegen sollte auch bei weiteren Forschungsvorhaben insbesondere ein Augenmerk auf den Differenzierungszustand der zu untersuchenden Zellpopulation geworfen werden.
Staphylococcus aureus is a versatile human pathogen that normally develops acute or chronic infections. The broad range of diseases caused by this bacterium facilitates the escape from the host's immune response as well as from target-specific antimicrobial therapies. Nevertheless, the underlying cellular and molecular mechanisms that enable S. aureus to cause these disparate types of infections are largely unknown. In this work, we depicted a novel genetic program involved in the development of cell-fate decision, which promotes the differentiation of the staphylococcal cells into two genetically identical but differently heritable cell lines capable of defining the course of an infection, by simultaneously progressing to (i) a biofilm-associated chronic infection or (ii) a disperse acute bacteremia. Here, S. aureus growing in architecturally complex multicellular communities harbored different cell types that followed an exclusive developmental plan, resulting in a clonal heterogeneous population. We found that these cell types are physiologically specialized and that, this specialization impacts the collective behavior within the multicellular aggregates. Whereas one cell line that we named BRcells, promotes biofilm formation that engenders chronic infections, the second cell line, which we termed DRcells is planktonic and synthetizes virulence factors, such as toxins that can drive acute bacteremia. We identified that the positive feedback loop present in Agr quorum sensing system of S. aureus acts a bimodal switch able to antagonistically control the divergence of these two physiologically distinct, heritable cell lines. Also, we found that this bimodal switch was triggered in response to environmental signals particularly extracellular Mg2+, affecting the size of the subpopulations in specific colonization environments. Specifically, Mg2+-enriched environments enhanced the binding of this cation to the staphylococcal teichoic acids, increasing the rigidity of the cell wall and triggering a genetic program involving the alternative sigma factor σB that downregulated the Agr bimodal switch, favoring the enrichment of the BRcells type. Therefore, colonization environments with different Mg2+ content favored different outcomes in the bimodal system, defining distinct ratio in the BRcells/DRcells subpopulations and the S. aureus outcome in our in vitro model of development of multicellular aggregates and, the infection outcome in an in vivo mice infection model. In this prime human pathogen cell-fate decision-making generates a conserved pattern of heritable, physiological heterogeneity that actively contributes to determine the course of an infection through the emergence and spatio-temporal dynamics of distinct and specialized cell types. In conclusion, this work demonstrates that cell differentiation in pathogenic bacteria is a fundamental phenomenon and its understanding, is central to understand nosocomial infections and to designing new anti-infective strategies
Die Blut-Hirn-Schranke (BHS) stellt eine der dichtesten und wichtigsten Barrieren zwischen Blutzirkulation und Zentralnervensystem (ZNS) dar. Sie besteht aus spezialisierten Endothelzellen, welche die zerebralen Kapillaren auskleiden und durch sehr dichte Tight Junctions (TJs) miteinander verbunden sind. Weitere Komponenten der dynamischen Blut-Hirn-Schrankenbarriere stellen Perizyten, Astrozyten, Neurone und Mikrogliazellen dar, welche zusammen mit der extrazellulären Matrix der Basalmembran der Gehirnkapillaren und den zuvor genannten Endothelzellen ein komplexes regulatorisches System, die so genannte neurovaskuläre Einheit bilden (Hawkins und Davis 2005).
Die Hauptfunktionen der BHS lassen sich in drei Untergruppen untergliedern, die physikalische, metabolische und Transport-Barriere (Neuhaus und Noe 2010). Hauptsächlich dient die BHS der Aufrechterhaltung der Homöostase des ZNS und dem Schutz vor neurotoxischen Substanzen sowie Pathogenen, wie Bakterien und Viren. Zudem ist sie auch für die Versorgung der Neuronen mit Nährstoffen und regulierenden Substanzen sowie den Efflux von Stoffwechselendprodukten des ZNS zurück ins Blut verantwortlich. Für die Entwicklung von Medikamenten zur Behandlung von neurodegenerativen Erkrankungen, wie Morbus Alzheimer, Morbus Parkinson und Multiple Sklerose oder Gehirntumoren, stellt die Dichtigkeit der BHS gegenüber Substanzen und die hohe metabolische Aktivität der Endothelzellen aber ein großes Problem dar. Viele Medikamente sind nicht in der Lage in ausreichender Konzentration die BHS zu überwinden, um an ihren Wirkort zu gelangen oder werden vor dem Transport metabolisiert und die Wirksamkeit dadurch eingeschränkt. Weiterhin spielen auch Defekte der BHS eine entscheidende Rolle in der Beeinflussung der Pathogenese vieler ZNS-Erkrankungen.
Aufgrund des hohen Bedarfs an geeigneten Testsystemen in der Grundlagen- sowie präklinischen Forschung für Medikamentenentwicklung und Infektionsstudien wurden eine Vielzahl unterschiedlicher BHS-Modelle entwickelt. Neben in silico-, azellulären in vitro- und in vivo-Modellen sind auch zahlreiche zellbasierte Modelle der BHS entwickelt worden. Standardisierte Modelle auf Basis immortalisierter
Zelllinien jedoch weisen nur eine inhomogene TJ-Expression auf und verfügen meist
über eine geringe Barriereintegrität, erfasst über transendotheliale elektrische Widerstände (TEER)
unter 150
· cm2 (Deli et al. 2005). Im Vergleich dazu wurden in Tierexperimenten TEER-Werte
von mehr als 1500
· cm2 an der BHS gemessen (Butt et al. 1990; Crone und Olesen 1982). Die
Verfügbarkeit humaner primärer BHS-Zellen ist sehr limitiert und ihr Einsatz nicht nur im Hinblick
auf ethische Aspekte bedenklich. Humane Gehirnzellen können z. B. aus Biopsie- oder Autopsiematerial
von Patienten mit Epilepsie oder Gehirntumoren isoliert werden. Allerdings besteht hier
das Risiko, dass die isolierten Zellen krankheitsbedingt verändert sind, was die Eigenschaften der
BHS-Modelle erheblich beeinflussen kann.
Eine Alternative, die diese Probleme umgeht, ist die Verwendung von humanen induziert pluripotenten
Stammzellen (hiPSCs), um standardisierte humane BHS-Modelle unter reproduzierbaren
Bedingungen bereitzustellen.
Im Rahmen dieser Arbeit ist es gelungen, hiPSCs in vitro nach etablierten und standardisierten Methoden
in Endothelzellen der BHS, neurale Stammzellen (hiPS-NSCs) sowie Astrozyten (hiPS-A)
zu differenzieren (Lippmann et al. 2012; Lippmann et al. 2014; Wilson et al. 2015; Yan et al. 2013;Reinhardt et al. 2013) und zum Aufbau der Modelle einzusetzen. Die Endothelzellen wurden mit
Hilfe protein- und genbasierter Nachweismethoden auf das Vorhandensein von endothelzellspezifischen
TJ-Markern sowie spezifischen Transportern untersucht und funktionell charakterisiert. Die
Kryokonservierung der hiPS-EC-Progenitoren, die im Rahmen der vorliegenden Arbeit entwickelt
wurde, ermöglicht eine größere räumliche und zeitliche Flexibilität beim Arbeiten mit den stammzellbasierten
Modellen sowie das Anlegen standardisierter Zellbanken. Weiterhin wurden multipotente
NSCs aus fetalen Gehirnbiopsien isoliert (fNSCs) und als Kontrollkulturen zu den hiPS-NSCs
für den Aufbau von BHS-Modellen eingesetzt.
Mit dem Ziel die in vivo-BHS bestmöglich zu imitieren und die Modelleigenschaften zu optimieren,
wurde ein Set aus zehn unterschiedlichen BHS-Modellen basierend auf primären Zellen, hiPSCs
und fNSCs analysiert. Der Aufbau der BHS-Modelle erfolgte unter Verwendung von Transwellsystemen.
Durch die systematische Untersuchung des Einflusses der unterschiedlichen Zelltypen der
neurovaskulären Einheit auf die Barriereintegrität und Genexpression des BHS-Endothels, konnten
die Quadrupel-Kulturen mit Perizyten, Astrozyten und hiPS-NSCs als die Kultur mit den physiologischsten
Eigenschaften identifiziert werden. Auf Grund der signifikant erhöhten TEER-Werte
von bis zu 2500
· cm2 und einer um mindestens 1,5-fachen Steigerung der Genexpression BHSrelevanter
Transporter und TJ-Moleküle gegenüber den Monokulturen, wurden diese Modelle für
weiterführende Studien ausgewählt.
Das Vorhandensein eines komplexen, in vivo-ähnlichen TJ-Netzwerkes, bestehend aus Occludin,
Claudin 1, 3, 4 und 5, konnte mittels quantitativer Realtime-PCR, Western Blot sowie ultrastruktureller
Analyse in der Gefrierbruch- und Raster-Elektronenmikroskopie nachgewiesen werden.
Neben der Begrenzung der parazellulären Permeabilität, welche über die geringe Permeation von
FITC-Dextran (4 kDa und 40 kDa), Fluoreszein und Lucifer Yellow nachgewiesen wurde, stellt die
BHS ebenfalls eine Barriere für den transzellulären Transport von Substanzen dar. Eine Beurteilung
der Modelle hinsichtlich der Qualifikation für die Nutzung im Wirkstoffscreening wurde mit
Hilfe von Transportversuchen unter dem Einsatz von BHS-relevanten Referenzsubstanzen durchgeführt.
Die Klassifikation der Testsubstanzen erfolgte analog ihrer Permeationsgeschwindigkeiten:
Diazepam und Koffein gelten als schnell transportierte Wirkstoffe, Ibuprofen, Celecoxib und Diclofenac
werden mit einer mittleren Geschwindigkeit über die BHS transportiert und Loratadin sowie
Rhodamin 123 sind langsam permeierende Substanzen. Innerhalb der Versuche mit den Quadrupelkulturen
wurde diese Reihenfolge bestätigt, lediglich für Koffein wurde ein signifikant niedrigerer
Permeationskoeffizient verglichen mit der Monokultur erzielt.
Der Einsatz der hiPSC-Technologie ermöglicht es zudem, aus einer Stammzelllinie große Mengen
an humanen somatischen Zelltypen zu generieren und für gezielte Anwendungen bereitzustellen.
Es konnte im Rahmen dieser Arbeit gezeigt werden, dass mit Hilfe eines eigens für diese Zwecke
konstruierten Rührreaktorsystems eine reproduzierbare Expansion der hiPSCs unter definierten Bedingungen
ermöglicht wurde. Basierend auf dieser Grundlage ist nun ein Hochdurchsatz-Screening
von Medikamenten denkbar.
Die in dieser Arbeit präsentierten Daten belegen die Etablierung eines stammzellbasierten in vitro-
Quadrupelmodels der humanen BHS, welches über in vivo-ähnliche Eigenschaften verfügt. Die
Anforderungen, die an humane BHS-Modelle gestellt werden, wie die Reproduzierbarkeit der Ergebnisse,
eine angemessene Charakterisierung, welche die Untersuchung der Permeabilität von Referenzsubstanzen
einschließt, die Analyse der Expression von BHS-relevanten Transportermolekülen sowie die solide und physiologische Morphologie der Zellen, wurden erfüllt.
Das etablierte BHS-Modell kann in der Pharmaindustrie für die Entwicklung von Medikamenten
eingesetzt werden. Ausreichend qualifizierte Modelle können hier in der präklinischen Forschung
genutzt werden, um Toxizitäts- und Transportstudien an neu entwickelten Substanzen durchzuführen
und eine bessere in vitro-in vivo-Korrelation der Ergebnisse zu ermöglichen oder Mechanismen
zu entwickeln, um die BHS-Barriere gezielt zu überwinden.
Bacteria organize many membrane-related signaling processes in functional microdomains that are structurally and functionally similar to the lipid rafts of eukaryotic cells. An important structural component of these microdomains is the protein flotillin, which seems to act as a chaperone in recruiting other proteins to lipid rafts to facilitate their interaction. In eukaryotic cells, the occurrence of severe diseases is often observed in combination with an overproduction of flotillin, but a functional link between these two phenomena is yet to be demonstrated. In this work, we used the bacterial model Bacillus subtilis as a tractable system to study the physiological alterations that occur in cells that overproduce flotillin. We discovered that an excess of flotillin altered specific signal transduction pathways that are associated with the membrane microdomains of bacteria. As a consequence of this, we detected significant defects in cell division and cell differentiation. These physiological alterations were in part caused by an unusual stabilization of the raft-associated protease FtsH. This report opens the possibility of using bacteria as a working model to better understand fundamental questions related to the functionality of lipid rafts.
IMPORTANCE The identification of signaling platforms in the membrane of bacteria that are functionally and structurally equivalent to eukaryotic lipid rafts reveals a level of sophistication in signal transduction and membrane organization unexpected in bacteria. It opens new and promising venues to address intricate questions related to the functionality of lipid rafts by using bacteria as a more tractable system. This is the first report that uses bacteria as a working model to investigate a fundamental question that was previously raised while studying the role of eukaryotic lipid rafts. It also provides evidence of the critical role of these signaling platforms in orchestrating diverse physiological processes in prokaryotic cells.
Imprinted genes play important roles in brain development. As the neural developmental capabilities of human parthenogenetic embryonic stem cells (hpESCs) with only a maternal genome were not assessed in great detail, hence here the potential of hpESCs to differentiate into various neural subtypes was determined. In addition DNA methylation and expression of imprinted genes upon neural differentiation was also investigated. The results demonstrated that hpESC-derived neural stem cells (hpNSCs) showed expression of NSC markers Sox1, Nestin, Pax6, and Musashi1 (MS1), the silencing of pluripotency genes (Oct4, Nanog) and the absence of activation of neural crest (Snai2, FoxD3) and mesodermal (Acta1) markers. Moreover, confocal images of hpNSC cultures exhibited ubiquitous expression of NSC markers Nestin, Sox1, Sox2 and Vimentin. Differentiating hpNSCs for 28 days generated neural subtypes with neural cell type-specific morphology and expression of neuronal and glial markers, including Tuj1, NeuN, Map2, GFAP, O4, Tau, Synapsin1 and GABA. hpNSCs also responded to region-specific differentiation signals and differentiated into regional phenotypes such as midbrain dopaminergic- and motoneuron-type cells. hpESC-derived neurons showed typical neuronal Na+/K+ currents in voltage clamp mode, elicited multiple action potentials with a maximum frequency of 30 Hz. Cell depicted a typical neuron-like current pattern that responded to selective pharmacological blockers of sodium (tetrodotoxin) and potassium (tetraethylammonium) channels. Furthermore, in hpESCs and hpNSCs the majority of CpGs of the differentially methylated regions (DMRs) KvDMR1 were methylated whereas DMR1 (H19/Igf2 locus) showed partial or complete absence of CpG methylation, which is consistent with a parthenogenetic (PG) origin. Upon differentiation parent-of-origin-specific gene expression was maintained in hpESCs and hpNSCs as demonstrated by imprinted gene expression analyses. Together this shows that despite the lack of a paternal genome, hpNSCs are proficient in differentiating into glial- and neuron-type cells, which exhibit electrical activity similar to newly formed neurons. Moreover, maternal-specific gene expression and imprinting-specific DNA-methylation are largely maintained upon neural differentiation. hpESCs are a means to generate histocompatible and disease allele-free ESCs. Additionally, hpESCs are a unique model to study the influence of imprinting on neurogenesis.
Human adult cartilage is an aneural and avascular type of connective tissue, which consequently reflects reduced growth and repair rates. The main cell type of cartilage are chondrocytes, previously derived from human mesenchymal stem cells (hMSCs). They are responsible for the production and maintainance of the cartilaginous extracellular matrix (ECM), which consists mainly of collagen and proteoglycans. Signal transmission to or from chondrocytes, generally occurs via interaction with signalling factors connected to the cartilaginous ECM. In this context, proteins of the CCN family were identified as important matricellular and multifunctional regulators with high significance during skeletal development and fracture repair. In this thesis, main focus lies on WISP1/CCN4, which is known as a general survival factor in a variety of cell types and seems to be crucial during lineage progression of hMSCs into chondrocytes. We intend to counter the lack of knowledge about the general importance of WISP1-signalling within the musculoskeletal system and especially regarding cell death and survival by a variety of molecular and cell biology methods. First, we established a successful down-regulation of endogenous WISP1 transcripts within different cell types of the human musculoskeletal system through gene-silencing. Interestingly, WISP1 seems to be crucial to the survival of all examined cell lines and primary hMSCs, since a loss of WISP1 resulted in cell death. Bioinformatical analyses of subsequent performed microarrays (WISP1 down-regulated vs. control samples) confirmed this observation in primary hMSCs and the chondrocyte cell line Tc28a2. Distinct clusters of regulated genes, closely related to apoptosis induction, could be identified. In this context, TRAIL induced apoptosis as well as p53 mediated cell death seem to play a crucial role during the absence of WISP1 in hMSCs. By contrast, microarray analysis of WISP1 down-regulated chondrocytes indicated rather apoptosis induction via MAPK-signalling. Despite apoptosis relevant gene regulations, microarray analyses also identified clusters of differentially expressed genes of other important cellular activities, e.g. a huge cluster of interferon-inducible genes in hMSCs or gene regulations affecting cartilage homeostasis in chondrocytes. Results of this thesis emphasize the importance of regulatory mechanisms that influence cell survival of primary hMSCs and chondrocytes in the enforced absence of WISP1. Moreover, findings intensified the assumed importance for WISP1-signalling in cartilage homeostasis. Thus, this thesis generated an essential fundament for further examinations to investigate the role of WISP1-signalling in cartilage homeostasis and cell death.
Pluripotency describes the ability of stem cells to form every cell type of the body.. Pluripotent stem cells are e.g. embryonic stem cells (ESCs), but also the so called induced pluripotent stem cells (IPS cells), that are generated by reprogramming differentiated somatic cells into a pluripotent state. Furthermore, it has been shown that spermatogonia (SG) derived from adult testes of mouse or human are pluripotent. Because of their ability to differentiate into every somatic cell type, pluripotent stem cells have a unique status in research and regenerative medicine. For the latter, they offer a valuable opportunity to replace destroyed tissues or organs. For basic research, stem cells represent a useful system to study differentiation or developmental processes that are difficult to access in the physiological situation e.g. during embryogenesis. Both applications, however, require methods that allow efficient and directed differentiation of stem cells into defined specialized cell types. This study first aims to investigate the differentiation potential of SG derived from the teleost fish medaka (Oryzias latipes). My results demonstrate that medaka SG are able to form different somatic cell types, namely adipocytes, melanocytes, osteoblasts, and neurons. This indicates that medake SG have retained a broad differentiation potential suggesting that pluripotency is not restricted to mouse and human SG but might be conserved among vertebrates. Next, I wanted to establish a differentiation method that is solely based on ectopic expression of genes known to be essential for the formation of certain somatic cell types – so called master regulators (MRs). My findings show that ectopic expression of the melanocyte-specific transcription factor mitf-m that has previously been shown to induce differentiation of medaka ESCs into pigment cells resulted in the formation of the same cell type in medaka SG. This approach could be used to generate other somatic cell types. Thus, ectopic expression of the MRs cbfa1 and mash1 in MF-SG was sufficient to induce differentiation into osteoblasts and neurons, respectively. Interestingly, these differentiation processes included the activation of genes that are expressed earlier during embryogenesis than the differentiation-inducing MR. Furthermore, my findings show that the approach of MR-induced differentiation can be transferred to mammalian stem cell systems. Ectopic expression of the neural transcription factor ngn2 was sufficient to induce efficient and rapid differentiation of neurons in mouse ESCs. This differentiation process also included the induction of genes that in vivo are activated at earlier stages that ngn2. By generating a transgenic cell line allowing induction of ectopic ngn2 expression, it was possible to obtain a relatively pure culture of functional neurons. Ngn2-induced differentiation did not require any additional signals and occurred even under pluripotency promoting conditions. Moreover, ectopic expression of ngn2 did also induce the formation of cells with neuronal morphology in IPS cells indicating that MR-induced differentiation is operative in different stem cell types. Furthermore, protein transduction of Ngn2 into mouse ESCs also resulted in a neuronal differentiation process up to the appearance of neural precursor cells. Last, my results show that MR-induced differentiation can also be used to generate other cell types than neurons from mouse ESCs. Myoblasts and macrophage-like cells were generated by ectopic expression of the MRs myoD and cebpa, respectively. Using transgenic cell lines enabling induction of MR expression it was possible to obtain mixed cultures with two different differentiation processes occurring in parallel. Altogether this study shows that ectopic expression of single genes is sufficient to induce directed differentiation of stem cells into defined cell types. The feasibility of this approach was demonstrated for different MRs and consequently different somatic cell types. Furthermore, MR induced differentiation was operative in different stem cell types from fish and mouse. Thus, one can conclude that certain genes are able to define cell fates in in vitro stem cell systems and that this cell fate defining potential appears to be a conserved feature in vertebrates. These findings therefore provide new insights in the role of MRs in cell commitment and differentiation processes. Furthermore, this study presents a new method to induce directed differentiation of stem cells that offers several advantages regarding efficiency, rapidness, and reproducibility. MR-induced differentiation therefore represents a promising tool for both stem cell research and regenerative medicine.
Formation oft the central nervous system (CNS) from multipotent neuronal stem cells (NSCs) requires a tightly controlled, step-wise activation of the neuronal gene expression program. Expression of neuronal genes at the transition from neural stem cell to mature neuron (i. e. neuronal cell differentiation) is controlled by the Repressor element 1 (RE1) silencing transcription factor (REST) complex. As a master transcriptional regulator, the REST-complex specifically inhibits expression of neuronal genes in non-neuronal tissues and neuronal progenitor cells. Differentiation of NSCs to mature neurons requires the activation of genes controlled by the REST-complex, but how abrogation of REST-complex mediated repression is achieved during neurogenesis is only poorly understood. MicroRNAs (miRNAs) are a class of small regulatory RNAs that posttranscriptionally control target gene expression. Binding of miRNAs to target sequences in the 3’UTR of mRNAs, leads either to degradation or translational inhibition of the mRNA. Distinct neuronal miRNAs (e.g. miR-124) were shown to modulate REST-complex activity by silencing expression of REST-complex components. Interestingly, these miRNAs are also under transcriptional control of the REST-complex and inactivation of the REST-complex precedes their expression. Hence, additional factors are required for derepression of neuronal genes at the onset of neurogenesis. In this study function of the miR-26 family during neurogenesis of the zebrafish (Danio rerio) was analyzed. Computational target prediction revealed a number of REST-complex components as putative miR-26 targets. One of these predicted target genes, the C-terminal domain small phosphatase 2 (Ctdsp2) was validated as an in vivo target for miR-26b. Ctdsps are important cofactors of REST and suppress neuronal gene expression by dephosphorylating the C-terminal domain (CTD) of RNA polymerase II (Pol II). Interestingly, miR-26b is encoded in an intron of the ctdsp2 primary transcript and is cotranscribed together with its host gene. Hence, miR-26b modulates expression of its host gene ctdsp2 in an intrinsic negative autoregulatory loop. This negative autoregulatory loop is inactive in NSCs because miR-26b biogenesis is inhibited at the precursor level. Generation of mature miR-26b is activated during neurogenesis, where it suppresses Ctdsp2 protein expression and is required for neuronal cell differentiation in vivo. Strikingly, miR-26b is expressed prior to miR-124 during neuronal cell differentiation. Thus, it is reasonable to speculate about a function of miR-26b in early events of neurogenesis. In line with this assumption, knockdown of miR-26b in zebrafish embryos results in downregulation of REST-complex controlled neuronal genes and a block in neuronal cell differentiation, most likely due to aberrant regulation of Ctdsp2 expression. This is evident by reduced numbers of secondary motor neurons compared to control siblings. In contrast, motor neuron progenitor cells and glia cells were not affected by depletion of miR-26b.This study identifies the ctdsp2/miR-26b autoregulatory loop as the first experimentally validated interaction between an intronic miRNA and its host gene transcript. Silencing of ctdsp2 by miR-26b in neurons is possible because biogenesis of the ctdsp2 mRNA and mature mir-26b is uncoupled at the posttranscriptional level. Furthermore the obtained data indicate a cell type specific role for miR-26b in vertebrate neurogenesis and CNS development.