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Durch Methoden des Tissue Engineerings hergestellte dreidimensionale Hautäquivalente bilden die native humane Haut hinsichtlich ihrer histologischen Architektur, zellulären Zusammensetzung und metabolischen Aktivität ab. Diese Gewebe eignen sich daher als zellbasierte Wundauflagen für großflächige Hautdefekte oder als In-vitro-Testsysteme für den Ersatz von Tierversuchen. Bei bisherigen Hautäquivalenten fehlt jedoch ein funktionelles Blutgefäßsystem. Wird solch ein Gewebe als Implantat eingesetzt, führt das Fehlen von Blutgefäßen zu einer unzureichenden Versorgung mit Nährstoffen und zur Nekrose. Neben dieser klinischen Limitation ist auch das Anwendungsspektrum als In-vitro-Testsystem begrenzt. Bei nicht vaskularisierten Hautmodellen kann eine transdermale Penetration von Substanzen nicht akkurat abgeschätzt werden, da die zusätzliche Barriere, welche die gefäßauskleidenden Endothelzellen bilden, nicht enthalten ist. In Studien zur Integration eines Gefäßsystems in Hautäquivalente konnte bislang lediglich gezeigt werden, dass sich Endothelzellen zu gefäßartigen Strukturen zusammenlagern. Die Bildung von funktionellen perfundierbaren Gefäßen in einem in vitro generierten Hautäquivalent ist bisher jedoch noch nicht belegt. Entsprechend ist eine direkte Anastomose mit dem Blutkreislauf eines Patienten bei einem klinischen Einsatz als Hautimplantat nicht möglich. Bei einer Anwendung in In-vitro-Studien ist zudem das Gefäßsystem experimentell nicht zugänglich.
In der vorliegenden Arbeit kann durch die Kombination einer biologischen, vaskularisierten Trägerstruktur (BioVaSc) mit einem neu entwickelten Bioreaktorsystems, ein Hautäquivalent mit einem perfundierbaren Gefäßsystem hergestellt werden. Die Generierung dieser sogenannten SkinVaSc erfolgt über die Besiedlung der BioVaSc mit humanen Keratinozyten (hEK) und Fibroblasten. Parallel dazu werden die eingebetteten Gefäßstrukturen der BioVaSc mit humanen mikrovaskulären Endothelzellen (hDMEC) rebesiedelt. Durch eine Anastomose zwischen den Gefäßen der BioVaSc und dem Bioreaktorsystem ist eine Perfusion mit physiologisch, gepulsten Drücken zwischen 80 und 120 mmHG möglich. Optimale Kulturbedingungen für die Haut- zellen können ferner durch zwei Kulturmodi generiert werden. Zur optimalen Versorgung der hEK innerhalb einer Proliferationsphase, die sich an die Zellaussaat anschließt, erfolgt eine kontinuierliche Versorgung der Oberfläche der SkinVaSc mit Medium. Der zweite Modus stimuliert die Differenzierung der hEK durch eine Kultivierung des Modells an der Grenzfläche zwischen Luft und Medium.
Nach einer vierzehntägigen Kultivierung der SkinVaSc an der Luft Medium Grenzfläche lässt sich die Bildung einer hautspezifischen histologischen Architektur durch Hämalaun/Eosin und immunhistologische Färbungen belegen. Eine natürlich differenzierte Epidermis wird durch eine Basalmembran, die Kollagen Typ IV und Laminin 5 enthält von einen dermalen Teil getrennt. Die Dermale-Epidermale-Verbindung erscheint durch die Mikrostrukturierung der BioVaSc wellenförmig. Damit bildet die SkinVaSc die papillare Struktur der nativen humanen Haut ab. Innerhalb des dermalen Anteils können zudem Gefäßstrukturen ausgemacht werden. Die Innenseite der Gefäße sind durch eine Schicht aus hDMEC ausgekleidet, die endothelzellspe-
zifische Oberflächenmarker wie "platelet endothelial cell adhesion molecule 1“ und "von Willebrand Faktor“ aufweisen.
Eine zerstörungsfreie Überwachung der SkinVaSc hinsichtlich der epidermalen Differenzierung ist durch eine integrierte Sensortechnologie auf Basis der Impedanz-spektroskopie möglich. Dabei erlaubt ein entwickeltes mathematisches Modell die Extraktion von biologisch relevanten Informationen aus Impedanzspektren in einem Frequenzbereich zwischen 1 Hz und 100 kHz. Innerhalb dieser Studien ließ sich zeigen, dass die epidermale Differenzierung zu einer signifikanten Steigerung des ohmschen Widerstandes von 245,3 Ohm*cm2 zu 1108,1 Ohm*cm2 führt. Gleichzeitig sinkt die zelluläre Kapazität von 131,5µF/cm2 auf 5,4µF/cm2 ab. Durch diese Parameter
ist es möglich die epidermale Barriere zerstörungsfrei über die Kultivierungszeit zu überwachen.
Das Gefäßsystem der SkinVaSc ermöglicht es mehr dermatologische Fragestellungen in vitro zu untersuchen und damit Tierversuche zu ersetzen. Zudem kann auf Basis der SkinVaSc ein vaskularisiertes Hautimplantat entwickelt werden, das es ermöglicht tiefe Hautverletzungen zu behandeln.
Tissue-engineered skin equivalents mimic key aspects of the human skin, and can thus be employed as wound coverage for large skin defects or as in vitro test systems as an alternative to animal models. However, current skin equivalents lack a functional vasculature limiting clinical and research applications. This study demonstrates the generation of a vascularized skin equivalent with a perfused vascular network by combining a biological vascularized scaffold (BioVaSc) based on a decellularized segment of a porcine jejunum and a tailored bioreactor system. Briefly, the BioVaSc was seeded with human fibroblasts, keratinocytes, and human microvascular endothelial cells. After 14 days at the air-liquid interface, hematoxylin & eosin and immunohistological staining revealed a specific histological architecture representative of the human dermis and epidermis including a papillary-like architecture at the dermal-epidermal-junction. The formation of the skin barrier was measured non-destructively using impedance spectroscopy. Additionally, endothelial cells lined the walls of the formed vessels that could be perfused with a physiological volume flow. Due to the presence of a complex in-vivo-like vasculature, the here shown skin equivalent has the potential for skin grafting and represents a sophisticated in vitro model for dermatological research.