Refine
Has Fulltext
- yes (1)
Is part of the Bibliography
- yes (1)
Year of publication
- 2009 (1) (remove)
Document Type
- Doctoral Thesis (1)
Language
- German (1)
Keywords
- inhibitors (1) (remove)
Institute
Der Erreger der Malaria tropica, Plasmodium falciparum, ist für eine jährliche Todesrate von über einer Million Menschen verantwortlich. Rasch zunehmende Erregerresistenzen gegen gängige Antimalariamedikamente und das Fehlen eines Impfstoffes machen die Suche nach neuen therapeutischen Ansätzen und Medikamenten unerlässlich. Sexualstadienspezifische Oberflächenproteine des Parasiten sind attraktive Zielstrukturen für die Entwicklung von TBV, welche eine Entwicklung von P. falciparum in der Mücke unterbrechen. Die Suche nach multiplen tier- oder bakterienähnlichen, extrazellulären Adhäsionsdomänen im Genom von P. falciparum führte zur Identifizierung einer Familie von sechs Proteinen mit hochkonservierten Adhäsionsmodulen, die vermutlich an Parasit-Parasit- oder Parasit-Wirtsinteraktionen beteiligt sind, was sie zu potentiellen Kandidaten für Komponenten von TBV macht. Aufgrund ihrer gemeinsamen LCCL-Domäne wurden diese Proteine PfCCp1 bis PfCCp5 sowie PfFNPA benannt. PfFNPA besitzt keine LCCL-Domäne, es ist jedoch ähnlich aufgebaut wie PfCCp5 und wurde daher mit in die PfCCp-Familie integriert. Die in der parasitophoren Vakuole reifer Gametozyten lokalisierenden PfCCp1- bis PfCCp3-Proteine werden während der Gametogenese teilweise freigesetzt und umgeben matrixähnlich entstehende Exflagellationszentren. In PfCCp2- und PfCCp3-defizienten Parasiten ist die Wanderung der Sporozoiten aus den Mitteldarmoozysten in die Speicheldrüsen der Mücke blockiert. Sexualstadien-spezifische Expression und eine wichtige Funktion bei der Entwicklung des Erregers in der Mücke sind die Hauptkriterien für potentielle TBV-Kandidaten. Diese viel versprechenden Daten waren Anlass, in der vorliegenden Arbeit, die bisher nur hypothetischen PfCCp5- und PfFNPA-Proteine genauer zu untersuchen. Expressionsstudien von PfCCp5 und PfFNPA mittels RT-PCR, Western-Blot-, Immunfluoreszenz- und Transmissionselektronenmikroskopischen-Analysen zeigten, dass sie sowohl plasmamembranassoziiert in der parasitophoren Vakuole als auch intrazellulär in reifen Gametozyten exprimiert werden. Beide Proteine sind in Gameto-zyten ab dem Stadium II detektierbar und weisen in unreifen Gametozyten ein punktiertes Expressionsmuster auf. In reifen Gametozyten konzentriert sich ihre Expression dagegen v. a. auf die Zellpole. Ferner werden PfCCp5 und PfFNPA auf der Oberfläche von Makrogameten, jedoch nicht in Mikrogameten und Ookineten exprimiert. Zusätzlich wird PfCCp5 in einem Teil reifer Schizonten eines gametozyten-bildenden Parasiten-Stammes exprimiert. Durch Integration eines Komplementations-Konstukts in die 3-untranslatierte Region von PfCCp5 bzw. PfFNPA konnte gezeigt werden, dass beide Gene genetisch manipulierbar sind. Mit PfCCp5- bzw. PfFNPA-KO-Konstrukten transfizierte WT-Parasiten wachsen nach erfolgter positiver Selektion jedoch nicht mehr. Diese Daten lassen vermuten, dass PfCCp5 und PfFNPA eine essentielle Funktion in den Blutstadien bzw. bei Gametozytenbildung haben. Zur weiteren Analyse von PfFNPA wurde ein verkürztes Protein durch Integration eines weiteren PfFNPA-KO-Konstrukts in den Locus von WT-Parasiten generiert. Erste Analysen des PfFNPA-KO-Phänotyps deuten darauf hin, dass durch die Ausschaltung der 3’-Region des Gens das Protein nicht mehr korrekt exprimiert wird, obwohl keine morphologischen Veränderungen der Blutstadien des Parasiten feststellbar sind. Außerdem werden PfCCp5 und PfFNPA ko-abhängig in PfCCp1-, PfCCp2- und PfCCp3-KO-Gametozyten exprimiert. Ko-Immunpräzipitationsstudien zeigten, dass beide Proteine mit den anderen PfCCp-Mitgliedern interagieren. Affinitätschromato-graphiestudien deckten dann direkte Interaktionen einzelner PfCCp-Domänen auf. Hierbei sind v. a. die LCCL-, die SR- und die NEC- Domäne an Proteininteraktionen beteiligt, was die Hypothese einer Komplexbildung der PfCCp-Familie während der Gametogenese des Erregers stützt. Transmissionsblockierungsstudien sollen nun die Eignung ausgewählter PfCCp-Proteine als TBV-Komponenten näher beleuchten. Zunehmende Resistenzen gegen gebräuchliche Malariamedikamente veranlassen zur Suche nach neuen Angriffspunkten zur Behandlung der Erkrankung. Die maßgeblich an der Hämoglobinhydrolyse beteiligten plasmodialen Cysteinproteasen Falcipain-2 und Falcipain-3 sind mögliche Ziele für die Entwicklung neuer Antimalariawirkstoffe. In der vorliegenden Arbeit wurden peptidomimetische 1,4-Benzodiazepin- und nicht-peptidische Etacrynsäurederivate in vitro auf ihre antiplasmodiale Wirkung an P. falciparum-Blutstadien getestet. Ein erstes Screening hatte gezeigt, dass die eine Vinylsulfonkopfgruppe tragenden 1,4 Benzodiazepinderivate rekombinant exprimiertes Falcipain-2 irreversibel hemmen. In vitro konnte dann auch eine antiplasmodiale Aktivität für diese Verbindungen festgestellt werden. Dockingstudien und HPLC-Assays mit den Etacrynsäurederivaten deckten eine Hemmung der Cysteinprotease Papain und der SARS-Mpro-Hauptprotease der Coronaviren auf. Weiterhin konnte in einem Screening an rekombinant exprimiertem Falcipain-2 und Falcipain-3 eine inhibitorische Wirkung für einen Teil dieser Etacrynsäurederivate festgestellt werden. Der In-vitro-Test an P. falciparum-Blutstadien deckte dann eine schwache antiplasmodiale Aktivität von fluorsubstituierten Etacrynsäurederivaten und von Derivaten mit einer modifizierten Etacrynsäurepartialstruktur auf. Der viel versprechendste Inhibitor dieser Studie wurde nun zur Identifizierung potentieller Bindungspartner mittels Affinitätsbindungsstudien biotyniliert. Zusammenfassend besitzen beide getesteten Wirkstoffklassen eine inhibierende Aktivität gegenüber Cysteinproteasen womit sie die Grundlage für die Entwicklung neuer, effektiverer plasmodialer Cysteinproteaseinhibitoren bieten.