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Background: Alveolar echinococcosis (AE) is caused by the metacestode stage of Echinococcus multilocularis. Differential diagnosis with cystic echinococcosis (CE) caused by E. granulosus and AE is challenging. We aimed at improving diagnosis of AE on paraffin sections of infected human tissue by immunohistochemical testing of a specific antibody.
Methodology/Principal Findings: We have analysed 96 paraffin archived specimens, including 6 cutting needle biopsies and 3 fine needle aspirates, from patients with suspected AE or CE with the monoclonal antibody (mAb) Em2G11 specific for the Em2 antigen of E. multilocularis metacestodes. In human tissue, staining with mAb Em2G11 is highly specific for E. multilocularis metacestodes while no staining is detected in CE lesions. In addition, the antibody detects small particles of E. multilocularis (spems) of less than 1 mm outside the main lesion in necrotic tissue, liver sinusoids and lymphatic tissue most probably caused by shedding of parasitic material. The conventional histological diagnosis based on haematoxylin and eosin and PAS stainings were in accordance with the immunohistological diagnosis using mAb Em2G11 in 90 of 96 samples. In 6 samples conventional subtype diagnosis of echinococcosis had to be adjusted when revised by immunohistology with mAb Em2G11.
Conclusions/Significance: Immunohistochemistry with the mAb Em2G11 is a new, highly specific and sensitive diagnostic tool for AE. The staining of small particles of E. multilocularis (spems) outside the main lesion including immunocompetent tissue, such as lymph nodes, suggests a systemic effect on the host.
In dieser Arbeit wurden neue Methoden zur Analyse des Proteoms von Listeria monocytogenes in infizierten Wirtszellen entwickelt und evaluiert. Proteomische Analysen können im Vergleich zu transkriptomischen Analysen durch Erfassung von Proteinmengen und eventuell auch posttranslationalen Modifikationen, sowie von Abbauprozessen ein genaueres Abbild des Funktionszustands einer Zelle unter unterschiedlichen Umweltbedingungen darstellen. Das Hauptproblem bei proteomischen Untersuchungen an in eukaryontischen Wirtszellen gewachsenen Bakterien, nämlich die Überlagerung des bakteriellen Proteinmusters durch die im Überschuss vorhandenen Wirtszellproteine, musste in dieser Arbeit überwunden werden. Es wurde eine Methode etabliert, intrazellulär gewachsene Bakterien über Bindung an paramagnetische Partikel („Beads“) und anschließende Magnetseparation selektiv von Wirtszellkomponenten abzutrennen. Dabei wurden drei Beads-Varianten mit unterschiedlicher Beschichtung gewählt: Dynabeads anti Listeria (Dynal, Oslo), Kieselgel  Magnetit Beads (MERCK in Entwicklung), Dynabeads M-270 Epoxy – CBD Beads (Beschichtung mit Phagenlysin Ply 118). Hierbei konnte nur für die Kieselgel + Magnetit Beads eine hinreichende Isolierungsrate für die Methode der 2-D-Gelelektrophorese von 6-7* 10**7 Listerien/ Zellkulturflasche erreicht werden. Im 2-D-Proteingel zeigte sich jedoch eine starke Streifenbildung, wodurch sich dieser Ansatz als nicht auswertbar erwies. In einem alternativen Ansatz gelang es, aus Infektionen an J774-Makrophagen, die Listerien mittels konsekutiver Waschschritte von Wirtszellproteinen aufzureinigen. Es konnten aus den Infektionen 30-50 µg listerielles Protein isoliert und zweidimensional aufgetrennt werden, wobei das Proteinpattern qualitativ eindeutig dem von in vitro gewachsenen Listeria monocytogenes entsprach. Auf diese Weise konnten 38 Proteine von Listeria monocytogenes, welche von Listerien während der Infektion in Makrophagen induziert oder reprimiert werden anhand der Deta-2-D Software identifiziert, quantifiziert und statistisch ausgewertet werden. Für einige der hier mittels der neu entwickelten Methode identifizierten Proteine konnte anhand der der vorliegenden Literatur (zu Transkriptom, Sekretom, Virulenz von Listeria) bereits eine Beteiligung am Virulenzgeschehen nachgewiesen werden. Zum jetzigen Zeitpunkt unterliegt die proteomische Analyse einigen Limitierungen, z.B. beim Nachweis von schwach exprimierten, stark alkalischen, stark hydrophoben, hochmolekularen und niedermolekularen Proteinen, so dass die derzeitige Methodik noch nicht das gesamte Proteom abdecken kann. Dass die „klassischen“ Virulenzfaktoren pathogener Listerien, Listeriolysin O (LLO), die Phospholipasen PlcA und PlcB, sowie ActA hier nicht erfasst wurden, ist darin begründet, dass es sich um sekretierte Proteine handelt. Besondere Bedeutung kommt der Beobachtung zu, dass nur in ganz wenigen Fällen (z.B. Pgm, ClpP, Pgi, TrxB, MurC) die nachgewiesenen intrazellulären Veränderungen der Proteinmenge mit den von anderen publizierten Transkriptionsdaten übereinstimmen. Diese Diskrepanzen stellen keine Artefakte dar, sondern sind durch intrazelluläre posttranskriptionelle Mechanismen begründet. Insgesamt zeigte auch diese Proteinanalyse , dass bei Replikation von Listeria monocytogenes im Cytosol eukaryontischer Wirtszellen zahlreiche komplexe Anpassungen von teils zentralen aber auch peripheren Stoffwechselwegen und Biosynthesen der Bakterien an dieses spezielle Milieu ablaufen.