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Coronaviren besitzen mit etwa 30 kb das größte Genom aller bisher bekannten RNA-Viren. Die Synthese der subgenomischen RNAs findet durch einen einzigartigen Mechanismus, die sog. diskontinuierliche Transkription, statt. Diese beiden Besonderheiten erfordern einen leistungsfähigen Replikationskomplex, der sich aus den Prozessierungsprodukten der Polyproteine 1a und 1ab und einigen zellulären Proteinen zusammensetzt. Die Aktivitäten und die Expression der beteiligten Proteine werden auf co- und posttranslationeller Ebene reguliert. Dazu gehört eine ribosomale Leserasterverschiebung, die das Verhältnis zwischen den ORF1aund ORF1b-kodierten Proteinen festlegt, sowie eine umfangreiche proteolytische Prozessierung durch virale Proteasen. Während die hochkonservierten ORF1b-kodierten Proteine vor allem RNA-synthetisierende und -prozessierende Funktionen besitzen, übernehmen die weniger konservierten ORF1a-kodierten Proteine vor allem organisierende oder regulierende Funktionen. So sind sie beispielsweise maßgeblich an der intrazellulären Lokalisation, strukturellen Organisation und proteolytischen Regulation des Replikationskomplexes beteiligt und haben darüber hinaus nichtessentielle Aufgaben, die möglicherweise bei spezifischen Interaktionen des Virus mit seinem Wirt von Bedeutung sind. Die meisten der bisher charakterisierten ORF1bkodierten Proteine besitzen essentielle Enzymfunktionen im viralen RNA-Metabolismus. Einige dieser Enzyme, wie die NendoU oder ExoN, sind spezifisch für die Nidovirales oder nur bestimmte Nidovirusfamilien. In der vorliegenden Arbeit wurde mittels eines revers-genetischen Ansatzes versucht, die Funktion und Bedeutung verschiedener viraler Proteine im Replikationszyklus von HCoV-229E zu untersuchen. Dazu wurden Transkripte von HCoV-229E-cDNAs genomischer Länge, in die entsprechende Substitutionen eingeführt worden waren, in Zellen transfiziert und anschließend analysiert, inwieweit eine virale RNA-Synthese stattfand. Sofern sich infektiöse Viren im Zellkulturüberstand befanden, wurde diese näher charakterisiert, insbesondere um mögliche Defekte in der Virusreplikation und Veränderungen in der Sequenz zu identifizieren. Es wurde gezeigt, dass die Nichtstrukturproteine 13, 14, 15 und 16 wichtige Funktionen innerhalb der viralen RNA-Synthese besitzen, wobei die Aktivitäten von nsp13 und nsp16 essentiell waren. Als besonders kritisch erwiesen sich auch die zinkbindenden Reste der Nterminalen Subdomäne (ZBD) des Nichtstrukturproteins 13. Das Nichtstrukturprotein 14 besitzt ebenfalls eine zentrale Rolle innerhalb der viralen RNA-Synthese und scheint darüber hinaus an der Synthese der subgenomischen RNAs beteiligt zu sein. Die Bedeutung von nsp15 für die Lebensfähigkeit von HCoV-229E konnte anhand entsprechender Mutanten zweifelsfrei nachgewiesen werden, wobei die maßgeblichen Defekte wohl nicht ausschießlich in der RNASynthese, sondern eher in einem späteren Schritt des Replikationszyklus zu suchen sind. Mittels verschiedener Mutanten, die Substitutionen an Spaltstellen der MPRO trugen, konnte die essentielle Bedeutung der posttranslationellen Regulation der Replikaseaktivität durch die Hauptprotease gezeigt werden. In den allermeisten Fällen führten Mutationen, die die Spaltungseffizienz reduzierten, zu einem Abfall in der RNA-Synthese und lebensfähige Viren konnten nicht isoliert werden. Im Rahmen dieser Arbeit wurde ein Replikon auf der Basis des HCoV-229E hergestellt, das über Monate in Zellkultur gehalten und dessen Reportergenexpression durch Fluoreszenz- Mikroskopie beobachtet werden konnte. Es zeigte sich, dass für eine dauerhafte Koexistenz von Wirtszelle und Replikon-RNA nur wenige Veränderungen im viralen Genom notwendig waren. Mit Hilfe eines mutierten Derivats dieses Replikons gelang es, den Defekt einer viralen nsp15- Mutante näher zu charakterisieren. Der Hauptteil der Arbeit widmete sich der Charakterisierung von chimären HCoV-229E-Klonen, deren Nichtstrukturproteine 7 und 8 bzw. 7 bis 9 gegen die entsprechenden Proteine des HCoVNL63 ausgetauscht wurden. Es konnte gezeigt werden, dass die Nichtstrukturproteine 7 und 8 von derselben Spezies stammen müssen, damit RNA-Synthese stattfindet, was auf eine essentielle Interaktion zwischen diesen beiden Proteinen schließen ließ. Die Identifizierung und Analyse adaptiver Mutationen in allen hier untersuchten chimären Klonen zeigte, dass offenbar neben der nsp7-nsp8-Interaktion noch weitere Interaktionen dieser Proteine mit anderen Proteinen, wie zum Beispiel nsp12 und nsp13, auf funktioneller und/oder struktureller Ebene von Bedeutung sind. Darüber hinaus ließen eine Reihe von Mutationen im Bereich des Leserasterverschiebungselements darauf schließen, dass sich bei diesen Viren die Leserasterverschiebungsrate geändert haben könnte. Diese Hypothese konnte durch In-vitro- Translationsexperimente bestätigt werden. Es zeigte sich, dass durch diese Mutationen die Leserasterverschiebungsrate von 50 % in der wildtypischen Situation auf 65 - 70 % angehoben wurde. Diese relative Überexpression von ORF1b-Proteinen scheint zur Kompensation funktioneller Defekte, die durch die Fremdproteine nsp7 und nsp8 verursacht wurden, beizutragen. Obwohl bei den meisten chimären Klonen eine RNA-Synthese auf nahezu wildtypischem Niveau beobachtet werden konnte, wiesen Reduktionen im Virustiter um 60 - 90 % auf verbliebene funktionelle Defekte im Replikationszyklus dieser Viren hin.