The gram-negative diplococcus Neisseria meningitidis (Nme) is a frequent human-specific, commensal bacterium of the upper respiratory tract. Under certain conditions especially in infants, meningococci can translocate into the bloodstream and cause invasive meningococcal disease (IMD) manifesting as meningitis or sepsis or a combination of both. IMD is feared for its rapid progression and high fatality rate if it remains untreated. IMD affects up to one million people annually causing substantial morbidity and mortality worldwide. It is well-established that the complement system is an important protective factor in meningococcal disease through opsonization of bacteria with C3b and the lytic activity of the membrane attack complex although the inflammatory C5a/C5aR1 axis can aggravate IMD. The role of neutrophil granulocytes in meningococcal infection is less clear despite their abundant recruitment throughout the course of disease. This study aimed to characterize neutrophil responses to Nme in vitro and the influence of complement on these responses. In infection assays with whole blood and isolated PMNs, effective binding, internalization and killing of Nme by neutrophils was demonstrated. A significant complement-dependence of neutrophil phagocytosis and oxidative burst was observed. The opsonizing and lytic pathway of the complement cascade were found to be most relevant for these responses since blockade of C3 using inhibitor Compstatin Cp20 reduced phagocytosis and oxidative burst significantly more than the blockade of the inflammatory branch with C5aR1-antagonist PMX53. Opsonization with specific antibodies could not replicate the effect of complement activation indicating that engagement of neutrophil complement receptors, particularly complement receptor 3, is involved. Other neutrophil effector functions such as degranulation and IL-8 release were activated in a complement-independent manner implying activation by other inflammatory signals. Considering existing evidence on the overall protective effect of PMNs, further studies investigating the contribution of each neutrophil effector function to infection survival in vivo are required. Ideally, this should be studied in a murine meningitis or sepsis model in the context of complement activation.

In der vorliegenden Arbeit sollten die unterschiedlichen Manifestationsformen der Borreliose anhand verschiedener Parameter verglichen und der Verlauf einer Borrelioseerkrankung analysiert werden. Dabei konnte gezeigt werden, dass es sich um eine ganzjährige Erkrankung handelt, die jedoch - je nach Manifestationsform - verschiedene jahreszeitliche Gipfel aufweist. So kommen die Neuroborreliose und die Frühborreliose gehäuft im Frühling und im Sommer vor, während die Lyme Arthritis durchweg ganzjährig auftritt. Da die Borrelien erst nach ca. 12 Stunden Latenz auf den Wirt übertragen werden, sind es vor allem die unbemerkten Zeckenstiche, die eine Infektion verursachen. Deshalb ist es nicht verwunderlich, dass sich nur rund 55 % der Patienten an einen zurück liegenden Zeckenstich erinnern konnten. Bei der Untersuchung der verschiedenen Laborparameter ergaben sich keine wesentlichen Unterschiede zwischen den Manifestationsformen bezüglich Hämoglobingehalt, Blutsenkungsgeschwindigkeit, Thrombozyten und Leukozyten im Serum. Desweiteren ergaben sich keine Hinweise auf eine Beteiligung des Rheumafaktors oder antinukleärer Antikörper an den immunologischen Prozessen während einer Lyme Arthritis Erkrankung. IL-17 konnte mittels ELISA weder in Serum/Plasma noch in Synovialflüssigkeit signifikant erhöht nachgewiesen werden. Es bleibt jedoch unklar, ob dies aufgrund einer langen Lagerung der Proben der Fall war oder ob IL-17 tatsächlich nicht signifikant erhöht vorlag. Aus der Literatur kann man entnehmen, dass IL-17 bei den Abläufen einer Infektion mit B. burgdorferi eine wichtige Rolle zu spielen scheint. Dies könnte einen Ansatz für neue Behandlungsmethoden der Lyme Arthritis darstellen, weshalb die Durchführung weitere Untersuchungen wichtig ist. Durch die Analyse der initialen Serologie konnte die Antikörperreaktion während einer Infektion mit B. burgdorferi veranschaulicht werden, die mit der Bildung von IgM- Antikörpern beginnt und dann einen Shift zu IgG-Antikörpern vollzieht. Die Antigene p19, p31/34, p39 und p65 scheinen hierbei vor allem bei der Lyme Arthritis im Vordergrund zu stehen. Weiterhin konnte bei dieser Analyse beobachtet werden, dass teilweise zahlreiche serologische Untersuchungen bei ein und demselbem Patienten statt fanden, was darauf schließen lässt, dass diese Untersuchung zur Verlaufskontrolle benutzt wurde. Grundsätzlich ist die Serologie hierzu jedoch nicht geeignet. Vielmehr sollte sie lediglich zur Diagnosestellung dienen. In dieser Funktion ist sie bei korrekter Interpretation ein hervorragendenes diagnostisches Mittel. Leider werden serologische Untersuchungen jedoch häufig falsch interpretiert und angewendet, was dazu führt, dass Patienten häufiger oder auch länger als nötig antibiotisch behandelt werden. So erhielten auch rund 8 % der Lyme Arthritis Patienten mehr als 2 Zyklen antibiotischer Therapie. Die Nebenwirkungen dieser langwierigen antibiotischen Behandlung sind nicht zu vernachlässigen. Die aktuellen Leitlinien sehen im Gegensatz dazu nämlich nach dem zweiten antibiotischen Zyklus den Beginn einer Therapie mit DMARD ́s vor, selten kommen auch intraartikuläre Steroide zum Einsatz. Diese beobachtete „Überdiagnostik und Übertherapie“ der Borrelioseerkrankung spiegelt vermutlich die Angst vor chronischen Verlaufsformen in der Bevölkerung und teilweise auch unter Ärzten wider. Bereits in anderen Studien konnte die Existenz einer therapieresistenten Verlaufsform der Borreliose - insbesondere der Lyme Arthritis – nachgewiesen werden. In der vorliegenden Arbeit litten 24 % der Lyme Arthritis Patienten nach einer adäquaten antibiotischen Behandlung laut eigenen Angaben zum Zeitpunkt der Umfrage noch unter Gelenkbeschwerden. Ob es sich hierbei nun um eine schwerwiegendere Verlaufsform in Europa handelt, bleibt zunächst offen. Zur Objektivierung der Beschwerden, zum Ausschluss einer Zweitinfektion oder aber auch einer Fibromyalgie als mögliche Differentialdiagnose sind prospektive Studien mit klinischer Untersuchung der Patienten im Verlauf nötig. Eindeutig ist jedoch, dass durch eine frühzeitige antibiotische Behandlung nach Infektion das Fortschreiten der Erkrankung effektiv verhindert werden kann. Chronische Beschwerden gaben hingegen auch die Patienten mit zurückliegender Neuroborreliose an. Rund 20% der Patienten litten nach eigener Angabe unter Allgemeinsymptomen, die ihre Lebensqualität subjektiv wesentlich einschränkten. Der spezifische Zusammenhang zwischen diesen Beschwerden und einer Neuroborreliose bzw. einer Borrelioseerkrankung im Allgemeinen ließ sich jedoch nicht endgültig klären. Es wäre hierfür der Vergleich mit einer gesunden Kohorte und die Anwendung spezieller neuropsychologischer Untersuchungen nötig.

Die saure Sphingomyelinase (Asm), ein Enzym des Sphingolipidmetabolismus, spaltet Sphingomyelin zu Ceramid und Phosopocholin. Aktiviert wird die Asm unter anderem durch Stimulation des CD28 Rezeptors. CD28 Signale werden auch für die Aktivierung von konventionellen T-Zellen (Tconv) und für die Kostimulation benötigt und sind essentiell für die Differenzierung von regulatorischen T-Zellen (Treg) im Thymus und deren Erhalt in der Peripherie. Wir konnten zeigen, dass sich Tconv und Treg Zellen hinsichtlich der Asm unterscheiden. Treg haben eine höhere "basale" Asm Aktivität, widergespiegelt im höheren Ceramidgehalt und haben eine niedrigere Lipidordnung als Tconv Zellen. Die Abwesenheit der Asm in defizienten Mäusen bewirkt einen relativen Anstieg der Treg-Frequenz innerhalb der CD4+ T-Zellen. Außerdem führt die Asm-Defizienz in Treg Zellen zu einer erhöhten Umsatzrate des immunsupprimierenden Moleküls CTLA-4 und zu einer verstärkten Suppressivität von Treg Zellen aus Asm-/- Mäusen gegenüber Wildtyp Zellen. Ein Anstieg in der Treg-Frequenz, äquivalent zur genetischen Defizienz, kann auch durch Inhibition der Asm, d. h. durch Wirkstoffe wie Amitriptylin und Desipramin erreicht werden. Es konnte gezeigt werden, dass die Inhibitorbehandlung die absolute Anzahl der Tconv Zellen selektiv verringert, da Treg Zellen gegenüber dem Asm Inhibitor-induzierten Zelltod resistenter sind. Mechanistisch erklärbar sind die Unterschiede gegenüber den proapoptotischen Inhibitoreffekten zwischen Tconv und Treg Zellen dadurch, dass Treg Zellen durch die Anwesenheit von IL-2 geschützt sind. In Abwesenheit von IL-2 sterben die Treg Zellen ebenfalls. Die gezielte Veränderung des Verhältnisses von Treg zu Tconv durch den Einsatz von Asm-inhibitorischen Medikamenten kann hilfreich bei der therapeutischen Behandlung von inflammatorischen- und Autoimmunerkrankungen sein. Inwiefern die Asm für die Funktion von T-Zellen in der anti-viralen Immunantwort entscheidend ist, wurde im Masernvirus-Infektionsmodell näher untersucht. In Asm-/- Mäusen und Amitriptylin-behandelten Mäusen konnte gezeigt werden, dass in Abwesenheit der Asm die Kontrolle der Masernvirusinfektion verschlechtert ist. Treg sind auch hier von entscheidender Bedeutung, da die Asm-abhängige, verstärkte Masernvirusinfektion bei Fehlen der Asm nur in Gegenwart von Treg auftritt. In der akuten Phase gibt es in Asm-/- Mäusen weniger masernvirusspezifische T-Zellen und dadurch eine verringerte Beseitigung der Viruslast. In der chronischen Phase ist die Anzahl masernvirusspezifischer T-Zellen zwischen WT und Asm-/- Mäusen vergleichbar. In Letzteren ist allerdings die Anzahl und Frequenz von T-Zellen im Gehirn infizierter Mäuse noch deutlich erhöht, was die verstärkte Maserninfektion widerspiegelt. Zusammenfassend zeigt sich, dass die Asm die Funktion von Treg moduliert und einen Einfluss auf das Verhältnis von Tconv und Treg zueinander hat. Im Masernvirus-Infektionsmodell kann die Veränderung des Tconv zu Treg Verhältnisses in Abwesenheit der Asm ursächlich für die verringerte Viruskontrolle sein. Die Asm Inhibitor-induzierte Treg-Aktivierung und die Beeinflussung des Treg zu Tconv Verhältnisses können wiederum für therapeutische Zwecke genutzt werden, wie beispielsweise bei Multipler Sklerose und Rheumatoider Arthritis.

Die Interaktion mit Gehirnendothelzellen stellt ein zentraler Schritt in der Infektionspathogenese von Neisseria meningitidis dar. In dieser Promotionsarbeit konnte gezeigt werden, dass die Infektion von menschlichen Gehirnendothelzellen mit N. meningitidis zu einer transienten Aktivierung der sauren Sphingomyelinase (ASM) gefolgt von einer vermehrten Ceramidproduktion führt. Als Antwort auf die Infektion mit N. meningitidis kommt es zu einer vermehrten Präsentation der ASM und von Ceramiden an der äusseren Seite der Plasmamembran und zu einer Ausbildung von großen Ceramid-reichen Membran-Domänen, welche mit cortical plaque assoziierten Proteinen kolokalisieren. Bei dieser N. meningitids vermittelten Aktivierung der ASM spielt das bakterielle Aussenmembranprotein Opc sowie die Aktivierung der Phosphatidylcholin-spezifische Phospholipase C über die Interaktion von Opc mit Heparansulfat-Proteoglykane eine entscheidende Rolle. Die pharmakologische oder genetische Inhibition der ASM Funktion führt zu einer geringeren Invasivität der Meningokokken ohne dabei die Adhärenz zu beeinflussen. Im Einklang mit diesen Ergebnissen steht die Beobachtung, dass die geringere Invasivität von ausgewählten Isolaten des ST-11/ST-8 Komplex in menschlichen Gehirnendothelzellen direkt mit ihrer eingeschränkter Fähigkeit korreliert, die ASM zu aktivieren bzw. eine Ceramidproduktion zu induzieren. Schlussfolgernd ist die ASM Aktivierung und eine nachfolgende Ceramidproduktion essenziell für die Internalisierung von Opc-exprimierende Meningokokken in Gehirnendothelzellen und bietet einen Erklärungsansatz für die unterschiedliche Invasivität von verschiedenen N. meningitidis Stämmen.

Bacterial meningitis occurs when blood-borne bacteria are able to penetrate highly specialized brain endothelial cells (BECs) and gain access to the meninges. Neisseria meningitidis (Nm) is a human-exclusive pathogen for which suitable in vitro models are severely lacking. Until recently, modeling BEC-Nm interactions has been almost exclusively limited to immortalized human cells that lack proper BEC phenotypes. Specifically, these in vitro models lack barrier properties, and continuous tight junctions. Alternatively, humanized mice have been used, but these must rely on known interactions and have limited translatability. This motivates the need to establish novel human-based in vitro BEC models that have barrier phenotypes to research Nm-BEC interactions. Recently, a human induced pluripotent stem cell (iPSC) model of BECs has been developed that possesses superior BEC phenotypes and closely mimics the in vivo blood vessels present at the blood-meningeal barrier. Here, iPSC-BECs were tested as a novel cellular model to study Nm-host pathogen interactions, with focus on host responses to Nm infection. Two wild type strains and three mutant strains of Nm were used to confirm that these followed similar phenotypes to previously described models. Importantly, the recruitment of the recently published pilus adhesin receptor CD147 underneath meningococcal microcolonies could be verified in iPSC-BECs. Nm was also observed to significantly increase the expression of pro-inflammatory and neutrophil-specific chemokines IL6, CXCL1, CXCL2, CXCL8, and CCL20, at distinct time points of infection, and the secretion of IFN γ and RANTES by iPSC-BECs. Nm was directly observed to disrupt tight junction proteins ZO-1, Occludin, and Claudin-5 at late time points of infection, which became frayed and/or discontinuous upon infection. This destruction is preceded by, and might be dependent on, SNAI1 activation (a transcriptional repressor of tight junction proteins). In accordance with tight junction loss, a sharp loss in trans-endothelial electrical resistance, and an increase in sodium fluorescein permeability was observed at late infection time points. Notably, bacterial transmigration correlated with junctional disruption, indicating that the paracellular route contributes for bacterial crossing of BECs. Finally, RNA-Sequencing (RNA-Seq) of sorted, infected iPSC-BECs was established through the use of fluorescence-activated cell sorting (FACS) techniques following infection. This allowed the detection of expression data of Nm-responsive host genes not previously described thus far to play a role during meningitidis. In conclusion, here the utility of iPSC-BECs in vitro to study Nm infection could be demonstrated. This is the first BEC in vitro model to express all major BEC tight junctions and to display high barrier potential. Altogether, here this model provides novel insights into Nm pathogenesis, including an impact of Nm on barrier properties and tight junction complexes and suggests that the paracellular route contributes to Nm traversal of BECs.