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The human specific gram-negative bacterium Neisseria meningitidis (Nme, meningococci) is a common colonizer of the upper respiratory tract. Upon becoming invasive, Nme can cause meningitis and life-threatening sepsis. The most important immune defense mechanism in invasive meningococcal disease (IMD) is the complement mediated killing of bacteria. The complement cascade is activated through different pathogen associated patterns and finally leads to the lysis of the bacteria by the membrane attack complex. In addition to the direct bacterial killing, the complement system is also an important player in different inflammatory processes. A hallmark of IMD is an overreaction of the immune system and the release of the potent anaphylatoxins C3a and C5a by the complement system is an important factor hereby. There are three anaphylatoxin receptors (ATRs), the C3aR, the C5aR1 and the C5aR2, capable of detecting these anaphylatoxins. It has already been shown that blocking the ATR C5aR1 strongly benefitted the outcome of IMD in a murine sepsis model. However, the roles of ATRs C3aR and C5aR2 in IMD are still unclear. This work aims to analyze the role of these ATRs in meningococcal sepsis and to identify possible underlying mechanisms. Furthermore, a possible involvement of the complement system, the ATRs and the type II CRISPR/Cas system on nasopharyngeal colonization is analyzed.
In vivo depletion experiments showed that without neutrophils or monocytes/macrophages the complement system alone was not able to clear a low dose Nme infection, which highlights the importance of cellular components in IMD. Analyzing the role of the ATRs in knock-out mice with high dose Nme infections, revealed that the lack of C5aR2, like the lack of C5aR1, was beneficial for the outcome of meningococcal induced sepsis. In contrast, the lack of C3aR in knock-out mice was detrimental. The positive outcome associated with the C5aRs could be reproduced by using an antagonist against both C5aRs or an antagonist specifically against C5aR1 in WT mice. These findings are giving hope to future therapeutic applications. Next, a possible contribution of neutrophils to this positive outcome was analyzed. Absence of C5aR1 led to a decrease of degranulation by neutrophils in a murine whole blood model, while the other ATRs showed no effect. Neutrophil analysis in human whole blood, on the other hand, revealed a reduced oxidative burst and IL-8 secretion upon inhibition of all three ATRs. A functional difference between the C5aRs and the C3aR in neutrophils was observed in phagocytosis, which was reduced upon C3aR inhibition, but was unaltered with C5aR1 or C5aR2 inhibition. Possible underlying mechanisms in the phosphorylation of ERK1/2 were analyzed in bone marrow derived macrophages isolated from ATR knock-out mice. The later phosphorylation of ERK1/2 in macrophages without C5aR1 or C5aR2 expression might explain, why blocking the C5aRs is beneficial for the outcome of IMD in mice. In contrast to these findings, the colonization of the nasopharynx in huCEACAM 1 expressing mice by Nme did not seem to depend on the Complement system factors C3 and C5 nor the ATRs. Additionally, no difference in the colonization could be observed in this model using Nme mutants lacking different parts of the type 2 CRISPR/Cas system.
Conclusively, this work highlights the importance of the complement system, the ATRs and the cellular components in IMD. Contrariwise, these factors did not play a role in the analyzed nasopharyngeal infection model. The beneficial effects of C5aR1 and C5aR2 lack/inhibition in IMD might have medicinal applications, which could support the standard therapies of IMD in the future.
The gram-negative diplococcus Neisseria meningitidis (Nme) is a frequent human-specific, commensal bacterium of the upper respiratory tract. Under certain conditions especially in infants, meningococci can translocate into the bloodstream and cause invasive meningococcal disease (IMD) manifesting as meningitis or sepsis or a combination of both. IMD is feared for its rapid progression and high fatality rate if it remains untreated. IMD affects up to one million people annually causing substantial morbidity and mortality worldwide. It is well-established that the complement system is an important protective factor in meningococcal disease through opsonization of bacteria with C3b and the lytic activity of the membrane attack complex although the inflammatory C5a/C5aR1 axis can aggravate IMD. The role of neutrophil granulocytes in meningococcal infection is less clear despite their abundant recruitment throughout the course of disease. This study aimed to characterize neutrophil responses to Nme in vitro and the influence of complement on these responses. In infection assays with whole blood and isolated PMNs, effective binding, internalization and killing of Nme by neutrophils was demonstrated. A significant complement-dependence of neutrophil phagocytosis and oxidative burst was observed. The opsonizing and lytic pathway of the complement cascade were found to be most relevant for these responses since blockade of C3 using inhibitor Compstatin Cp20 reduced phagocytosis and oxidative burst significantly more than the blockade of the inflammatory branch with C5aR1-antagonist PMX53. Opsonization with specific antibodies could not replicate the effect of complement activation indicating that engagement of neutrophil complement receptors, particularly complement receptor 3, is involved. Other neutrophil effector functions such as degranulation and IL-8 release were activated in a complement-independent manner implying activation by other inflammatory signals. Considering existing evidence on the overall protective effect of PMNs, further studies investigating the contribution of each neutrophil effector function to infection survival in vivo are required. Ideally, this should be studied in a murine meningitis or sepsis model in the context of complement activation.
Trotz deutlich zunehmender Durchimpfungsraten bei Kindern und Jugendlichen tritt Pertussis in Deutschland weiterhin als Ursache signifikanter Morbidität auf, v. a. bei ungeimpften Kindern und Säuglingen. Die Datenlage zur Pertussis-Epidemiologie ist vor allem in den alten Bundesländern aufgrund der bis 2013 fehlenden Meldepflicht sehr begrenzt. Das Ziel dieser Studie war die Ermittlung der Inzidenz und des Schweregrades von ICD-10-dokumentierten Bordetella pertussis-Hospitalisationen bei Kindern in Bayern.
27 (73%) von insgesamt 37 bayerischen Kinderkliniken beteiligten sich an der Surveillance-Studie. Sie führten eine Datenabfrage für im Jahr 2007 und 2008 stationär aufgenommene Kinder unter 17 Jahren mit einem ICD- 10-Code für Pertussis (A37.0 oder A37.9) als Haupt- oder Nebendiagnose bei Entlassung durch. Zu diesen Kindern wurden demographische Basisdaten sowie Jahr und Monat der Hospitalisation, Haupt- und alle Nebendiagnosen, Aufenthaltsdauer und Behandlung (OPS-Codes) erhoben.
Im 2-Jahres-Zeitraum 2007/2008 wurden insgesamt 171 Fälle identifiziert (2007:109 Fälle; 2008: 62 Fälle), mit 0-17 gemeldeten Fällen pro Klinik. Mädchen waren mit 51% (n=88) etwas häufiger betroffen als Jungen. Der Altersmedian lag bei vier Monaten (IQR: 1-14 Monate); 121 (70.7%) Kinder waren Säuglinge <1 Jahr, 102 (59.6%) <6 Monate und 41 (24.0%) <2 Monate alt. Die jährliche Inzidenz bei Säuglingen <1 Jahr wurde auf 67/100.000 Hospitalisationen geschätzt, bei Säuglingen <2 Monate auf 22/100.000. Respiratorische Komplikationen einschließlich Pneumonien und Apnoen traten bei 31% (n=53) aller Kinder auf; von diesen waren 82% (n=39) <1 Jahr bzw. 44% (n=21) <2 Monate alt. Fünf Kinder (3%) mussten intensivstationär behandelt werden, davon waren 4 jünger als 4 Monate. Bei einem Säugling (0.6%) war ein Krampfanfall dokumentiert, kardio-respiratorische Komplikationen kamen bei 2% und Dehydratation bei 8% aller Kinder vor.
Sowohl die Inzidenz der Hospitalisationen als auch die Komplikationsrate waren am höchsten bei Säuglingen <1 Jahr bzw. <2 Monaten. Die Ergebnisse belegen die Bedeutung der zeitgerechten Umsetzung der Impfempfehlung, d.h. den rechtzeitigen Start der Grundimmunisierung im Alter von 2, 3 und 4 Monaten. Auch die bereits 2004 empfohlene Impfung von Kontaktpersonen ist für die Prävention von Pertussis bei Säuglingen von hoher Wichtigkeit. Die bisher nicht allgemein empfohlene Impfung für Schwangere bzw. für Neugeborene könnte ggf. die Hospitalisationszahlen weiter senken; weitere Studien dazu werden dringend benötigt.
In der vorliegenden Arbeit sollten die unterschiedlichen Manifestationsformen der Borreliose anhand verschiedener Parameter verglichen und der Verlauf einer Borrelioseerkrankung analysiert werden.
Dabei konnte gezeigt werden, dass es sich um eine ganzjährige Erkrankung handelt, die jedoch - je nach Manifestationsform - verschiedene jahreszeitliche Gipfel aufweist. So kommen die Neuroborreliose und die Frühborreliose gehäuft im Frühling und im Sommer vor, während die Lyme Arthritis durchweg ganzjährig auftritt.
Da die Borrelien erst nach ca. 12 Stunden Latenz auf den Wirt übertragen werden, sind es vor allem die unbemerkten Zeckenstiche, die eine Infektion verursachen. Deshalb ist es nicht verwunderlich, dass sich nur rund 55 % der Patienten an einen zurück liegenden Zeckenstich erinnern konnten.
Bei der Untersuchung der verschiedenen Laborparameter ergaben sich keine wesentlichen Unterschiede zwischen den Manifestationsformen bezüglich Hämoglobingehalt, Blutsenkungsgeschwindigkeit, Thrombozyten und Leukozyten im Serum. Desweiteren ergaben sich keine Hinweise auf eine Beteiligung des Rheumafaktors oder antinukleärer Antikörper an den immunologischen Prozessen während einer Lyme Arthritis Erkrankung.
IL-17 konnte mittels ELISA weder in Serum/Plasma noch in Synovialflüssigkeit signifikant erhöht nachgewiesen werden. Es bleibt jedoch unklar, ob dies aufgrund einer langen Lagerung der Proben der Fall war oder ob IL-17 tatsächlich nicht signifikant erhöht vorlag. Aus der Literatur kann man entnehmen, dass IL-17 bei den Abläufen einer Infektion mit B. burgdorferi eine wichtige Rolle zu spielen scheint. Dies könnte einen Ansatz für neue Behandlungsmethoden der Lyme Arthritis darstellen, weshalb die Durchführung weitere Untersuchungen wichtig ist.
Durch die Analyse der initialen Serologie konnte die Antikörperreaktion während einer Infektion mit B. burgdorferi veranschaulicht werden, die mit der Bildung von IgM- Antikörpern beginnt und dann einen Shift zu IgG-Antikörpern vollzieht. Die Antigene p19, p31/34, p39 und p65 scheinen hierbei vor allem bei der Lyme Arthritis im Vordergrund zu stehen. Weiterhin konnte bei dieser Analyse beobachtet werden, dass teilweise zahlreiche serologische Untersuchungen bei ein und demselbem Patienten statt fanden, was darauf schließen lässt, dass diese Untersuchung zur Verlaufskontrolle benutzt wurde. Grundsätzlich ist die Serologie hierzu jedoch nicht geeignet. Vielmehr sollte sie lediglich zur Diagnosestellung dienen. In dieser Funktion ist sie bei korrekter Interpretation ein hervorragendenes diagnostisches Mittel.
Leider werden serologische Untersuchungen jedoch häufig falsch interpretiert und angewendet, was dazu führt, dass Patienten häufiger oder auch länger als nötig antibiotisch behandelt werden. So erhielten auch rund 8 % der Lyme Arthritis Patienten mehr als 2 Zyklen antibiotischer Therapie. Die Nebenwirkungen dieser langwierigen antibiotischen Behandlung sind nicht zu vernachlässigen. Die aktuellen Leitlinien sehen im Gegensatz dazu nämlich nach dem zweiten antibiotischen Zyklus den Beginn einer Therapie mit DMARD ́s vor, selten kommen auch intraartikuläre Steroide zum Einsatz. Diese beobachtete „Überdiagnostik und Übertherapie“ der Borrelioseerkrankung spiegelt vermutlich die Angst vor chronischen Verlaufsformen in der Bevölkerung und teilweise auch unter Ärzten wider.
Bereits in anderen Studien konnte die Existenz einer therapieresistenten Verlaufsform der Borreliose - insbesondere der Lyme Arthritis – nachgewiesen werden. In der vorliegenden Arbeit litten 24 % der Lyme Arthritis Patienten nach einer adäquaten antibiotischen Behandlung laut eigenen Angaben zum Zeitpunkt der Umfrage noch unter Gelenkbeschwerden. Ob es sich hierbei nun um eine schwerwiegendere Verlaufsform in Europa handelt, bleibt zunächst offen. Zur Objektivierung der Beschwerden, zum Ausschluss einer Zweitinfektion oder aber auch einer Fibromyalgie als mögliche Differentialdiagnose sind prospektive Studien mit klinischer Untersuchung der Patienten im Verlauf nötig.
Eindeutig ist jedoch, dass durch eine frühzeitige antibiotische Behandlung nach Infektion das Fortschreiten der Erkrankung effektiv verhindert werden kann. Chronische Beschwerden gaben hingegen auch die Patienten mit zurückliegender Neuroborreliose an. Rund 20% der Patienten litten nach eigener Angabe unter Allgemeinsymptomen, die ihre Lebensqualität subjektiv wesentlich einschränkten. Der spezifische Zusammenhang zwischen diesen Beschwerden und einer Neuroborreliose bzw. einer Borrelioseerkrankung im Allgemeinen ließ sich jedoch nicht endgültig klären. Es wäre hierfür der Vergleich mit einer gesunden Kohorte und die Anwendung spezieller neuropsychologischer Untersuchungen nötig.
Die zunehmende Antibiotikaresistenz vieler Krankheitserreger ist ein weltweites Problem, welches zu einem klinischen Bedarf an neuen antimikrobiellen Substanzen führt. Sphingolipide einschließlich Ceramide stellen eine vielfältige Gruppe strukturverwandter Lipide dar und bestehen aus einem Sphingosin-Grundgerüst, welches mit einer Fettsäure verbunden ist. Sowohl das Sphingosin-Grundgerüst allein als auch Sphingolipide zeigen eine antibakterielle Wirkung gegenüber einer Vielzahl pathogener Mikroorganismen. Die Intensität der Hemmung hängt von der Sphingolipidstruktur und dem Mikroorganismus ab. Neuere Studien konnten zeigen, dass Sphingosin, Ceramide und Ceramid-Analoga in N. meningitidis aufgenommen werden und eine bakteriostatische oder bakterizide Wirkung zeigen. Jedoch ist die antibakterielle Wirkungsweise noch nicht genau bekannt. Um mehr über den Wirkmechanismus zu erfahren haben wir die ultrastrukturellen Veränderungen von N. meningitidis nach Inkubation mit azido-funktionalisierten Sphingolipiden mit elektronenmikroskopischen Verfahren (transmissionselektronenmikroskopische und rasterelektronenmikroskopische Aufnahmen) untersucht. Mittels korrelativer Licht- und Elektronenmikroskopie (CLEM) konnten wir die azido-funktionalisierten Sphingolipide nach Aufnahme in N. meningitidis lokalisieren. Zum Anfärben der funktionalisierten Sphingolipide wurde die kupferfreie Azid-Alkin-Cyccloaddition verwendet.
Einfluss der sauren Sphingomyelinase auf anti-virale T-Zellantworten im Masernvirus-Infektionsmodell
(2017)
Die saure Sphingomyelinase (Asm), ein Enzym des Sphingolipidmetabolismus,
spaltet Sphingomyelin zu Ceramid und Phosopocholin. Aktiviert wird die Asm unter
anderem durch Stimulation des CD28 Rezeptors. CD28 Signale werden auch für die
Aktivierung von konventionellen T-Zellen (Tconv) und für die Kostimulation benötigt
und sind essentiell für die Differenzierung von regulatorischen T-Zellen (Treg) im
Thymus und deren Erhalt in der Peripherie. Wir konnten zeigen, dass sich Tconv und
Treg Zellen hinsichtlich der Asm unterscheiden. Treg haben eine höhere "basale"
Asm Aktivität, widergespiegelt im höheren Ceramidgehalt und haben eine niedrigere
Lipidordnung als Tconv Zellen. Die Abwesenheit der Asm in defizienten Mäusen
bewirkt einen relativen Anstieg der Treg-Frequenz innerhalb der CD4+ T-Zellen.
Außerdem führt die Asm-Defizienz in Treg Zellen zu einer erhöhten Umsatzrate des
immunsupprimierenden Moleküls CTLA-4 und zu einer verstärkten Suppressivität
von Treg Zellen aus Asm-/- Mäusen gegenüber Wildtyp Zellen. Ein Anstieg in der
Treg-Frequenz, äquivalent zur genetischen Defizienz, kann auch durch Inhibition der
Asm, d. h. durch Wirkstoffe wie Amitriptylin und Desipramin erreicht werden. Es
konnte gezeigt werden, dass die Inhibitorbehandlung die absolute Anzahl der Tconv
Zellen selektiv verringert, da Treg Zellen gegenüber dem Asm Inhibitor-induzierten
Zelltod resistenter sind. Mechanistisch erklärbar sind die Unterschiede gegenüber
den proapoptotischen Inhibitoreffekten zwischen Tconv und Treg Zellen dadurch,
dass Treg Zellen durch die Anwesenheit von IL-2 geschützt sind. In Abwesenheit von
IL-2 sterben die Treg Zellen ebenfalls. Die gezielte Veränderung des Verhältnisses
von Treg zu Tconv durch den Einsatz von Asm-inhibitorischen Medikamenten kann
hilfreich bei der therapeutischen Behandlung von inflammatorischen- und
Autoimmunerkrankungen sein.
Inwiefern die Asm für die Funktion von T-Zellen in der anti-viralen Immunantwort
entscheidend ist, wurde im Masernvirus-Infektionsmodell näher untersucht. In Asm-/-
Mäusen und Amitriptylin-behandelten Mäusen konnte gezeigt werden, dass in
Abwesenheit der Asm die Kontrolle der Masernvirusinfektion verschlechtert ist. Treg
sind auch hier von entscheidender Bedeutung, da die Asm-abhängige, verstärkte
Masernvirusinfektion bei Fehlen der Asm nur in Gegenwart von Treg auftritt. In der
akuten Phase gibt es in Asm-/- Mäusen weniger masernvirusspezifische T-Zellen und dadurch eine verringerte Beseitigung der Viruslast. In der chronischen Phase ist die
Anzahl masernvirusspezifischer T-Zellen zwischen WT und Asm-/- Mäusen
vergleichbar. In Letzteren ist allerdings die Anzahl und Frequenz von T-Zellen im
Gehirn infizierter Mäuse noch deutlich erhöht, was die verstärkte Maserninfektion
widerspiegelt.
Zusammenfassend zeigt sich, dass die Asm die Funktion von Treg moduliert und
einen Einfluss auf das Verhältnis von Tconv und Treg zueinander hat. Im
Masernvirus-Infektionsmodell kann die Veränderung des Tconv zu Treg
Verhältnisses in Abwesenheit der Asm ursächlich für die verringerte Viruskontrolle
sein. Die Asm Inhibitor-induzierte Treg-Aktivierung und die Beeinflussung des Treg
zu Tconv Verhältnisses können wiederum für therapeutische Zwecke genutzt
werden, wie beispielsweise bei Multipler Sklerose und Rheumatoider Arthritis.
Staphylococcus aureus (S. aureus) ist einer der häufigsten Erreger schwerer endovaskulärer Infektionen, die häufig mit einer Dissemination des Erregers in andere Organe und lebensbedrohlichen Komplikationen wie Endokarditis, Osteomyelitis oder Abszessen assoziiert sind. Entscheidender Schritt in der Pathogenese endovaskulärer Infektionen ist die Schädigung und Überwindung der Endothelbarriere. Für deren Integrität ist die Intaktheit von Zell-Zell-Verbindungen elementar, diese werden unter anderem durch Src-Kinasen reguliert. Es ist bekannt, dass S. aureus Fibronektin-Bindeproteine (FnBPs) maßgeblich für die Adhärenz und Invasion des Erregers in Endothelzellen sind. Die Invasion erfolgt über eine indirekte Bindung an α5β1-Integrine, invasive Eigenschaften finden sich in nahezu allen klinischen Isolaten. In verschiedenen Tiermodellen konnte außerdem ein Zusammenhang zwischen der Expression von FnBPs und der Dissemination von S. aureus in andere Organe gezeigt werden. Bislang ist jedoch nicht untersucht, welche Auswirkung die S. aureus-Infektion auf die Endothelbarriere hat und welche Mechanismen für die Translokation des Erregers verantwortlich sind.
In dieser Arbeit wurde analysiert, ob die Infektion mit S. aureus- und S. carnosus-Stämmen in vitro zu einer Schädigung der endothelialen Integrität von EA.hy926-Zellen führt. Hierzu wurden Änderungen der transendothelialen Impedanz und der Endothelpermeabeabilität nach Infektion im xCELLigence- bzw. Transwell-System erfasst. Zytotoxische Effekte wurden durch Kristallviolettfärbungen, immunfluoreszenz-mikroskopische Untersuchungen der Mitochondrien und Nuklei sowie die Erfassung der hypodiploiden Zellkerne mittels Durchflusszytometrie quantifiziert. Zur Entschlüsselung des molekularen Mechanismus wurden Veränderungen der Adherens und Tight Junction-Proteine ZO-1 und VE-Cadherin in der Immunfluoreszenz untersucht. Die Rolle von Src-Kinasen wurde durch pharmakologische Inhibition analysiert.
Es konnte gezeigt werden, dass FnBP-exprimierende S. aureus-Stämme eine Abnahme der transendothelialen Impedanz verursachen und dass es 4 und 24 Stunden nach Infektion zu einer signifikanten Zunahme der Endothelpermeabilität kommt. Zytotoxische Effekte auf die Endothelzellen durch die Infektion traten nach 24 Stunden auf, jedoch nicht nach 4 Stunden. VE-Cadherin und ZO-1 zeigten 4 Stunden nach Infektion eine FnBP-abhängige Konformationsänderung und Reduktion der Signalintensität. Außerdem konnte demonstriert werden, dass die Inhibition von Src-Kinasen den Anstieg der Endothelpermeabilität signifikant reduziert.
In dieser Arbeit wurde zum ersten Mal belegt, dass S. aureus FnBPs eine Erhöhung der Endothelpermeabilität bewirken. Während hierfür zu späten Zeitpunkten Apoptose verantwortlich ist, muss nach 4 Stunden ein anderer Mechanismus ursächlich sein. Da es zu einer Abschwächung der ZO-1- und VE-Cadherin-Signalintensität in der Immunfluoreszenz kam, ist anzunehmen, dass Adherens und Tight Junctions durch die Infektion geschädigt werden. Es ist bekannt, dass Src-Kinasen durch die Infektion mit S. aureus aktiviert werden. Außerdem sind sie elementar für die Regulation der Endothelpermeabilität und vermitteln diesen Effekt unter anderem über eine Phosphorylierung von Adherens und Tight Junction-Proteinen. Eine Src-vermittelte Phosphorylierung von Zell-Zell-Verbindungsproteinen wäre daher eine mögliche Erklärung für die beobachteten Veränderungen von ZO-1 und VE-Cadherin. Dieser Mechanismus könnte Wegbereiter für die parazelluläre Passage über die Endothelbarriere sein. Darüber hinaus könnte die erhöhte Endothelpermeabilität den Zugang zur Extrazellulärematrix und zum größten Pool an Fibronektin und Integrinen ermöglichen und so die Invasion und Transzytose begünstigen. Die hier gewonnenen Ergebnisse tragen dazu bei, die komplexe Interaktion zwischen S. aureus und dem Endothel und somit wichtige Schritte in der Pathogenese endovaskulärer Infektionen besser zu verstehen und neue Zielstrukturen für therapeutische Interventionen zu identifizieren.
Die Interaktion mit Gehirnendothelzellen stellt ein zentraler Schritt in der Infektionspathogenese von Neisseria meningitidis dar. In dieser Promotionsarbeit konnte gezeigt werden, dass die Infektion von menschlichen Gehirnendothelzellen mit N. meningitidis zu einer transienten Aktivierung der sauren Sphingomyelinase (ASM) gefolgt von einer vermehrten Ceramidproduktion führt. Als Antwort auf die Infektion mit N. meningitidis kommt es zu einer vermehrten Präsentation der ASM und von Ceramiden an der äusseren Seite der Plasmamembran und zu einer Ausbildung von großen Ceramid-reichen Membran-Domänen, welche mit cortical plaque assoziierten Proteinen kolokalisieren. Bei dieser N. meningitids vermittelten Aktivierung der ASM spielt das bakterielle Aussenmembranprotein Opc sowie die Aktivierung der Phosphatidylcholin-spezifische Phospholipase C über die Interaktion von Opc mit Heparansulfat-Proteoglykane eine entscheidende Rolle. Die pharmakologische oder genetische Inhibition der ASM Funktion führt zu einer geringeren Invasivität der Meningokokken ohne dabei die Adhärenz zu beeinflussen. Im Einklang mit diesen Ergebnissen steht die Beobachtung, dass die geringere Invasivität von ausgewählten Isolaten des ST-11/ST-8 Komplex in menschlichen Gehirnendothelzellen direkt mit ihrer eingeschränkter Fähigkeit korreliert, die ASM zu aktivieren bzw. eine Ceramidproduktion zu induzieren. Schlussfolgernd ist die ASM Aktivierung und eine nachfolgende Ceramidproduktion essenziell für die Internalisierung von Opc-exprimierende Meningokokken in Gehirnendothelzellen und bietet einen Erklärungsansatz für die unterschiedliche Invasivität von verschiedenen N. meningitidis Stämmen.
Zahlreiche humanpathogene bakterielle Erreger können ihre Fähigkeit zur Kolonisation epithelialer Barrieren optimieren, indem sie mit dem Zellzyklus der infizierten Wirtszelle in Wechselwirkung treten und so die Abschilferung und Erneuerung des Epithels verzögern. Die hierbei wirksamen bakteriellen Effektoren sind als „Cyclomoduline“ bekannt und gelten als neue Klasse bakterieller Pathogenitätsfaktoren. Ziel der vorliegenden Promotionsarbeit war es zu untersuchen, ob durch die Infektion menschlicher pharyngealer Epithelzellen mit N. meningitidis der Zellzyklus der Wirtszelle beeinflusst wird. Mit zwei verschiedenen Untersuchungsmethoden konnte übereinstimmend gezeigt werden, dass die Infektion der Epithelzelllinie Detroit 562 mit verschiedenen Meningokokkenisolaten zu einer signifikanten Akkumulation von Epithelzellen in der G1-Phase führte. Dieser Effekt wurde sowohl von pathogenen Meningokokkenstämmen als auch von Trägerstämmen ausgelöst, jedoch nur durch Isolate, die fähig zur Adhärenz und zur Invasion in die Epithelzelle waren. Durch Hitzebehandlung der Bakterien konnte der Zellzyklusarrest vollständig aufgehoben werden. Ebenso konnte der Effekt durch Inkubation der Epithelzellen mit bakteriellen Kulturüberständen und durch Infektion der Zellen mit E. coli-Stämmen, welche die Meningokokkenadhäsine Opa und Opc überexprimieren, nicht ausgelöst werden.
Es konnte weiterhin nachgewiesen werden, dass die Infektion mit N. meningitidis in der Zielzelle zu einer signifikant gesteigerten Expression des CDK-Inhibitors p21WAF1/Cip1 führte, begleitet von einer vermehrten Lokalisation im Zellkern. Auch zeigte sich eine veränderte Proteinexpression der für die G1-Phase relevanten Cycline D und E. Diese scheint sich erst posttranslational zu ereignen, da die unterschiedliche Expression auf mRNA-Ebene nicht festgestellt werden konnte.
Zusammenfassend konnte dargestellt werden, dass die Infektion von Pharynxepithelzellen mit lebenden, zur Adhärenz und Invasion fähigen Meningokokkenstämmen in der menschlichen Zielzelle einen Zellzyklusarrest in der G1-Phase verursacht, vermutlich durch veränderte Expression der Zellzyklusregulatoren p21WAF1/Cip1, Cyclin D und Cyclin E. Möglicherweise stellt die Induktion dieses Zellzyklusarrestes einen wichtigen Schritt in der Pathogenese der bakteriellen Kolonisation des oberen Atemwegsepithels durch N. meningitidis dar.
Bacterial meningitis occurs when blood-borne bacteria are able to penetrate highly specialized brain endothelial cells (BECs) and gain access to the meninges. Neisseria meningitidis (Nm) is a human-exclusive pathogen for which suitable in vitro models are severely lacking. Until recently, modeling BEC-Nm interactions has been almost exclusively limited to immortalized human cells that lack proper BEC phenotypes. Specifically, these in vitro models lack barrier properties, and continuous tight junctions. Alternatively, humanized mice have been used, but these must rely on known interactions and have limited translatability. This motivates the need to establish novel human-based in vitro BEC models that have barrier phenotypes to research Nm-BEC interactions. Recently, a human induced pluripotent stem cell (iPSC) model of BECs has been developed that possesses superior BEC phenotypes and closely mimics the in vivo blood vessels present at the blood-meningeal barrier.
Here, iPSC-BECs were tested as a novel cellular model to study Nm-host pathogen interactions, with focus on host responses to Nm infection. Two wild type strains and three mutant strains of Nm were used to confirm that these followed similar phenotypes to previously described models. Importantly, the recruitment of the recently published pilus adhesin receptor CD147 underneath meningococcal microcolonies could be verified in iPSC-BECs. Nm was also observed to significantly increase the expression of pro-inflammatory and neutrophil-specific chemokines IL6, CXCL1, CXCL2, CXCL8, and CCL20, at distinct time points of infection, and the secretion of IFN γ and RANTES by iPSC-BECs. Nm was directly observed to disrupt tight junction proteins ZO-1, Occludin, and Claudin-5 at late time points of infection, which became frayed and/or discontinuous upon infection. This destruction is preceded by, and might be dependent on, SNAI1 activation (a transcriptional repressor of tight junction proteins). In accordance with tight junction loss, a sharp loss in trans-endothelial electrical resistance, and an increase in sodium fluorescein permeability was observed at late infection time points. Notably, bacterial transmigration correlated with junctional disruption, indicating that the paracellular route contributes for bacterial crossing of BECs. Finally, RNA-Sequencing (RNA-Seq) of sorted, infected iPSC-BECs was established through the use of fluorescence-activated cell sorting (FACS) techniques following infection. This allowed the detection of expression data of Nm-responsive host genes not previously described thus far to play a role during meningitidis.
In conclusion, here the utility of iPSC-BECs in vitro to study Nm infection could be demonstrated. This is the first BEC in vitro model to express all major BEC tight junctions and to display high barrier potential. Altogether, here this model provides novel insights into Nm pathogenesis, including an impact of Nm on barrier properties and tight junction complexes and suggests that the paracellular route contributes to Nm traversal of BECs.