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In dieser Arbeit wurde mit Hilfe von small-molecule Inhibitoren die Rolle von clathrin- und dynaminabhängigen Endozytosemechanismen bei der Aufnahme von anti-Amphiphysin-Autoantikörpern am Zellkulturmodell primärer hippocampaler Neurone untersucht. Hierbei konnte eine Beeinflussung der Autoaantikörperaufnahme durch die Intervention gezeigt werden. Außerdem erfolgte der Versuch der Etablierung eines siRNA knockdowns unter Zuhilfenahme unterschiedlicher Traansfektionsreaaagenzien.
Fabry disease (FD) is an X-linked lysosomal storage disorder with intracellular accumulation of globotriaosylceramide (Gb3) due to α-galactosidase A deficiency. We studied α-galactosidase A knockout mice (GLA KO) as a model for sensory disturbance and pain in FD.
Pain associated behavior of young (3 months) and old (≥18 months) GLA KO mice and wildtype (WT) littermates in an inflammatory and a neuropathic pain model was investigated. Furthermore, affective and cognitive behavior was assessed in the naïve state and in an inflammatory pain model. Gene and protein expression of pain associated ion channels and Gb3 accumulation in dorsal root ganglion (DRG) neurons was determined. We also performed patch clamp analysis on cultivated DRG neurons and human embryonic kidney 293 (HEK) cells expressing voltage-gated-sodium channel 1.7 (Nav1.7) as an in vitro model of FD. Intracellular Gb3 deposits were modulated using shRNA silencing of α-galactosidase A.
After intraplantar injection of complete Freund`s adjuvant (CFA) and chronic constriction injury (CCI) of the right sciatic nerve, old GLA KO mice did not develop heat and mechanical hypersensitivity in contrast to young GLA KO and old WT mice. Additionally, we found no relevant differences between genotypes and age-groups in affective and cognitive behavior in the naïve state and after CFA injection. Gene and protein expression analysis provided no explanation for the observed sensory impairment. However, cultured DRG neurons of old GLA KO mice revealed a marked decrease of sodium and Ih-currents compared to young GLA KO and old WT mice. DRG neurons of old GLA KO mice displayed substantial intracellular accumulation of Gb3 compared to young GLA KO and old WT mice. Similar to cultured neurons, sodium currents were also decreased in HEK cells treated with shRNA and consecutively increased intracellular Gb3 deposits compared to the control condition, but could be rescued by treatment with agalsidase-alpha.
Our study unveils that, similar to patients with FD, GLA KO mice display age-dependent sensory deficits. However, contrary to patients, GLA KO mice are also protected from hypersensitivity induced by inflammation and nerve lesion due to Gb3-dependent and reversible reduction of neuronal sodium- and Ih-currents. Our data provide evidence for direct Gb3-dependent ion channel impairment in sensory DRG neurons as a potential contributor to sensory dysfunction and pain in FD.
Der zur Familie der pentameren ligandengesteuerten Ionenkanäle zugehörige Glycinrezeptor (GlyR) ist ein wichtiger Vermittler synaptischer Inhibition im Zentralnervensystem von Säugetieren. GlyR-Mutationen führen zur neurologischen Bewegungsstörung Hyperekplexie. Aufgrund fehlender struktureller Daten ist die intrazelluläre Loop-Struktur zwischen den Transmembransegmenten 3 und 4 (TM3-4 Loop) eine weitgehend unerforschte Domäne des GlyR. Innerhalb dieser Domäne wurden Rezeptortrunkierungen sowie Punktmutationen identifiziert. Rezeptortrunkierung geht mit Funktionslosigkeit einher, welche jedoch durch Koexpression des fehlenden Sequenzabschnitts zum Teil wiederhergestellt werden kann. Innerhalb dieser Arbeit wurde die Interaktion zwischen trunkierten, funktionslosen GlyR und sukzessiv verkürzten Komplementationskonstrukten untersucht. Dabei wurden als Minimaldomänen für die Interaktion das C-terminalen basische Motive des TM3-4 Loops, die TM4 sowie der extrazelluläre C-Terminus identifiziert. Die Rückkreuzung transgener Mäuse, die das Komplementationskonstrukt iD-TM4 unter Kontrolle des GlyR-Promotors exprimierten, mit der oscillator-Maus spdot, die einen trunkierten GlyR exprimiert und 3 Wochen nach der Geburt verstirbt, hatte aufgrund fehlender Proteinexpression keinen Effekt auf die Letalität der Mutation. Des Weiteren wurde die Bedeutsamkeit der Integrität beider basischer Motive 316RFRRKRR322 und 385KKIDKISR392 im TM3-4 Loop in Kombination mit der Loop-Länge für die Funktionalität und das Desensitisierungsverhalten des humanen GlyRα1 anhand von chimären Rezeptoren identifiziert. Eine bisher unbekannte Patientenmutation P366L innerhalb des TM3-4 Loops wurde mit molekularbiologischen, biochemischen und elektrophysiologischen Methoden charakterisiert. Es wurde gezeigt, dass die mutierten Rezeptorkomplexe in vitro deutlich reduzierte Glycin-induzierte Maximalströme sowie eine beschleunigte Schließkinetik aufweisen. P366L hat im Gegensatz zu bereits charakterisierten Hyperekplexiemutationen innerhalb des TM3-4 Loops keinen Einfluss auf die Biogenese des Rezeptors. P366 ist Teil einer möglichen Poly-Prolin-Helix, die eine Erkennungssequenz für SH3-Domänen darstellt. Ein potenzieller Interaktionspartner des TM3-4 Loops des GlyRα1 ist Collybistin, welches eine wichtige Rolle bei der synaptischen Rezeptorintegration spielt und die Verbindung zum Zytoskelett vermittelt. An der inhibitorischen Synapse verursacht P366L durch die Reduzierung postsynaptischer Chloridströme, das beschleunigte Desensitisierungsverhalten des GlyRα1 sowie ein verändertes Interaktionsmotiv Störungen der glycinergen Transmission, die zur Ausprägung phänotypischer Symptome der Hyperekplexie führen.
The role of vessel wall-resident stem cells in the generation of microglia and angiogenisis in the adult CNS
Das Zentralnervensystem (ZNS) wird kontinuierlich durch ein eigenes Immunsystem überwacht. Die Mikroglia sind ein wichtiger Vertreter dieses Immunsystems und ein besonderes Charakteristikum des ZNS. Für die Aufrechterhaltung der Hämostase im ZNS spielen die Mikroglia eine zentrale Rolle. Die Herkunft der Mikroglia war für lange Zeit Gegenstand der kontroversen wissenschaftlichen Diskussion. Zusammengefasst wurde deren Ursprung als hämatopoetisch, mesodermal und neuroektodermal beschrieben. Allerdings überwiegt derzeit die Meinung, dass die Mikroglia von Vorläuferzellen geliefert wird, die während der Embryonalentwicklung aus der Dottersackwand ins Gehirn migrieren, dort bis zum Erwachsenenalter persistieren und immer wieder zur Erneuerung der Mikroglia herangezogen werden. Wo genau im Hirngewebe derartige oder andere potenzielle Mikrogliavorläuferzellen im ZNS residieren, ist bis heute nicht abschließend geklärt.
In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, dass bereits die frisch präparierten Hirngefäße sowohl CD44+ als auch CD45+ Zellen in ihren Wänden aufweisen. Außerdem ließ sich beobachten, dass die CD44+ Zellen im BRA nach außen wanderten und sich zu Perizyten-ähnlichen und glatten Muskelzellen differenzierten. Diese Befunde ließen darauf schließen, dass die CD44+ Zellen mit diesen Eigenschaften das Potenzial haben, zur Gefäßneubildung beizutragen. Darüber hinaus konnten CD45+ Zellen in der Adventitia frisch isolierter Hirngefäße nachgewiesen werden, die im BRA teilweise für F4/80 und/oder Iba-1 positiv wurden. Dies wiederum lässt vermuten, dass aus der Wand der Hirngefäße Mikroglia- und Makrophagen-ähnliche Zellen generiert werden können. Es blieb jedoch offen, ob diese CD45+ Vorläuferzellen dauerhaft in der Adventitia der Hirngefäße residieren oder aber immer wieder durch im Blut zirkulierende Monozyten erneuert werden. Diese Frage zu klären, ist von klinischer Relevanz, bleibt jedoch zukünftigen Arbeiten überlassen. Das hier etablierte BRA könnte auch bei solchen Analysen hilfreich sein.
Multiple Sklerose ist eine der häufigsten und bedeutsamsten entzündlichen Autoimmunerkrankungen bei jungen Erwachsenen. Obwohl die klassischen Kennzeichen der Krankheit wie Infiltration von Immunzellen, Demyelinisierung, Astrogliose und axonale Schädigung bekannt sind, sind die genauen Ursachen und die zugrundeliegende Pathophysiologie noch nicht geklärt.
In der Fachliteratur wurden bereits biomechanische Veränderungen mit histologischen Veränderungen im ZNS in Verbindung gebracht. Der genaue Zusammenhang und das Ausmaß zwischen den mechanischen Gewebeeigenschaften und den zugrundeliegenden histologischen Veränderungen wurde bis heute jedoch nur wenig erforscht.
Die vorliegende Arbeit untersuchte in ihrem methodischen Rahmen den möglichen Zusammenhang zwischen den mechanischen Veränderungen des Gewebes und den zugrundeliegenden histologischen Gewebeveränderungen in den unterschiedlichen Krankheitsstadien der EAE, dem Tiermodell der MS.
Die hier dargestellten Experimente konnten demonstrieren, dass das ZNS-Gewebe durch zunehmende Zelldichte steifer wird, während es bei fortschreitender Demyelinisierung zur Erweichung des Gewebes kommt. Ferner wurden die mechanischen Gewebeeigenschaften in den unterschiedlichen Krankheitsstadien der EAE durch die Astrogliose und die Mikroglia/Makrophageninfiltration beeinflusst.
In the central nervous system, excitatory and inhibitory signal transduction processes are mediated by presynaptic release of neurotransmitters, which bind to postsynaptic receptors. Glycine receptors (GlyRs) and GABAA receptors (GABAARs) are ligand-gated ion channels that enable synaptic inhibition. One part of the present thesis elucidated the role of the GlyRα1 β8 β9 loop in receptor expression, localization, and function by means of amino acid substitutions at residue Q177. This residue is underlying a startle disease phenotype in the spontaneous mouse model shaky and affected homozygous animals are dying 4-6 weeks after birth. The residue is located in the β8 β9 loop and thus part of the signal transduction unit essential for proper ion channel function. Moreover, residue Q177 is involved in a hydrogen network important for ligand binding. We observed no difference in ion channel trafficking to the cellular membrane for GlyRα1Q177 variants. However, electrophysiological measurements demonstrated reduced glycine, taurine, and β alanine potency in comparison to the wildtype protein. Modeling revealed that some GlyRα1Q177 variants disrupt the hydrogen network around residue Q177. The largest alterations were observed for the Q177R variant, which displayed similar effects as the Q177K mutation present in shaky mice. Exchange with structurally related amino acids to the original glutamine preserved the hydrogen bond network. Our results underlined the importance of the GlyR β8 β9 loop for proper ion channel gating.
GlyRs as well as GABAARs can be modulated by numerous allosteric substances. Recently, we focused on monoterpenes from plant extracts and showed positive allosteric modulation of GABAARs. Here, we focused on the effect of 11 sesquiterpenes and sesquiterpenoids (SQTs) on GABAARs. SQTs are compounds naturally occurring in plants. We tested SQTs of the volatile fractions of hop and chamomile, including their secondary metabolites generated during digestion. Using the patch-clamp technique on transfected cells and neurons, we were able to observe significant GABAAR modulation by some of the compounds analyzed. Furthermore, a possible binding mechanism of SQTs to the neurosteroid binding site of the GABAAR was revealed by modeling and docking studies. We successfully demonstrated GABAAR modulation by SQTs and their secondary metabolites.
The second part of the thesis investigated three-dimensional (3D) in vitro cell culture models which are becoming more and more important in different part of natural sciences. The third dimension allows developing of complex models closer to the natural environment of cells, but also requires materials with mechanical and biological properties comparable to the native tissue of the encapsulated cells. This is especially challenging for 3D in vitro cultures of primary neurons and astrocytes as the brain is one of the softest tissues found in the body. Ultra-soft matrices that mimic the neuronal in vivo environment are difficult to handle. We have overcome these challenges using fiber scaffolds created by melt electrowriting to reinforce ultra-soft matrigel. Hence, the scaffolds enabled proper handling of the whole composites and thus structural and functional characterizations requiring movement of the composites to different experimental setups. Using these scaffold-matrigel composites, we successfully established methods necessary for the characterization of neuronal network formation. Before starting with neurons, a mouse fibroblast cell line was seeded in scaffold-matrigel composites and transfected with the GlyR. 3D cultured cells displayed high viability, could be immunocytochemically stained, and electrophysiologically analyzed.
In a follow-up study, primary mouse cortical neurons in fiber-reinforced matrigel were grown for up to 21 days in vitro. Neurons displayed high viability, and quantification of neurite lengths and synapse density revealed a fully formed neuronal network already after 7 days in 3D culture. Calcium imaging and patch clamp experiments demonstrated spontaneous network activity, functional voltage-gated sodium channels as well as action potential firing. By combining ultra-soft hydrogels with fiber scaffolds, we successfully created a cell culture model suitable for future work in the context of cell-cell interactions between primary cells of the brain and tumor cells, which will help to elucidate the molecular pathology of aggressive brain tumors and possibly other disease mechanisms.
Aktuell herrscht in der Wissenschaft Unklarheit über die pathologischen Prozesse, die durch Caspr2-aAK ausgelöst werden. Dissens herrscht, ob es durch die aAK im Serum oder im Liquor zu einer Internalisierung von an der Zellmembran exprimierten Caspr2 kommt. Ebenso ist nicht abschließend geklärt, inwieweit die Struktur des VGKC durch die aAK-Bindung verändert wird.
Mit der vorliegenden Arbeit wurden Untersuchungen zum Pathomechanismus von Caspr2-aAK vorgenommen, indem die Oberflächenexpression von Caspr2 in DRGs im Langzeitversuch näher untersucht wurde. Dafür wurden zunächst die Caspr2-aAK in den Patientenseren mithilfe immunzytochemischer Färbungen in vitro sowohl in transfizierten HEK293, als auch in adulten DRGs nachgewiesen. Zusätzlich wurde mit der Membranpräparation von Caspr2 transfizierten HEK293-Zellen die Caspr2 Bindung mittels proteinbiochemischen Nachweises verifiziert.
Es wurde zudem eine Subklassenbestimmung an den 9 vorliegenden Patientenseren und einer Probe mit aufgereinigtem IgG durchgeführt. Die dominante Subklasse war IgG4 was mit dem wissenschaftlichen Forschungsstand kongruiert, dass IgG4 bei Caspr2-aAK der dominierende Subtyp ist.
Im Langzeitversuch zur Untersuchung einer möglichen Internalisierung von Caspr2 durch die Inkubation in Caspr2-aAK positiven Seren wurden in vitro kultivierte DRGs adulter Mäuse für 24h, 48h, bzw. 96 h mit den Seren konfrontiert. Zusätzlich wurde überprüft wie sich ein Rescue der Zellen – nach 48 h wurde das Caspr2-aAK positive Serum gegen ein Caspr2-negatives Serum für weitere 48 h ausgetauscht – auf die Oberflächenexpression auswirkt. Zur Überprüfung der Dichte des an der Zellmembran exprimierten Caspr2 Proteins wurde diese abschließend quantifiziert und statistisch ausgewertet. Zusammenfassend ließ sich bei keinem der untersuchten Seren eine signifikante Veränderung der Caspr2 Oberflächenexpression erkennen.
Mit diesen Ergebnissen konnte gezeigt werden, dass eine vorübergehende Erniedrigung/Erhöhung der Caspr2 Expression nach Inkubation mit aAK durch primäre DRG Neurone kompensiert wird und eine erhöhte Internalisierung nicht als ursächlich für den Pathomechanismus der Caspr2-aAK in Frage kommt.
Immune-mediated polyneuropathies like chronic inflammatory demyelinating polyradiculoneuropathy or Guillain-Barré syndrome are rare diseases of the peripheral nervous system. A subgroup of patients harbors autoantibodies against nodal or paranodal antigens, associated with a distinct phenotype and treatment response. In a part of patients with pathologic paranodal or nodal immunoreactivity the autoantigens remain difficult or impossible to determine owing to limitations of the used detection approach - usually ELISAs (enzyme-linked-immunosorbent-assays) - and incomplete knowledge of the possible autoantigens. Due to their high-throughput, low sample consumption and high sensitivity as well as the possibility to display many putative nodal and paranodal autoantigens simultaneously, peptide microarray-based approaches are prime candidates for the discovery of novel autoantigens, point-of-care diagnostics and, in addition, monitoring of pathologic autoimmune response. Current applications of peptide microarrays are however limited by high false-positive rates and the associated need for detailed follow-up studies and validation. Here, robust peptide microarray-based detection of antibodies and the efficient validation of binding signals by on-chip neutralization is demonstrated. First, autoantigens were displayed as overlapping peptide libraries in microarray format. Copies of the biochips were used for the fine mapping of antibody epitopes. Next, binding signals were validated by antibody neutralization in solution. Since neutralizing peptides are obtained in the process of microarray fabrications, neither throughput nor costs are significantly altered. Similar in-situ validation approaches could contribute to future autoantibody characterization and detection methods as well as to therapeutic research. Areas of application could be expanded to any autoimmune-mediated neurological disease as a long-term vision.
The mammalian central clock, located in the suprachiasmatic nucleus (SCN) of the anterior hypothalamus, controls circadian rhythms in behaviour such as the sleep-wake cycle. It is made up of approximately 20,000 heterogeneous neurons that can be classified by their expression of neuropeptides. There are three major populations: AVP neurons (arginine vasopressin), VIP neurons (vasoactive intestinal peptide), and GRP neurons (gastrin releasing peptide). How these neuronal clusters form functional units to govern various aspects of rhythmic behavior is poorly understood. At a molecular level, biological clocks are represented by transcriptional-posttranslational feedback loops that induce circadian oscillations in the electrical activity of the SCN and hence correlate with behavioral circadian rhythms. In mammals, the sleep wake cycle can be accurately predicted by measuring electrical muscle and brain activity. To investigate the link between the electrical activity of heterogeneous neurons of the SCN and the sleep wake cycle, we optogenetically manipulated AVP neurons in vivo with SSFO (stabilized step function opsin) and simultaneously recorded an electroencephalogram (EEG) and electromyogram (EMG) in freely moving mice. SSFO-mediated stimulation of AVP positive neurons in the anterior hypothalamus increased the total amount of wakefulness during the hour of stimulation. Interestingly, this effect led to a rebound in sleep in the hour after stimulation. Markov chain sleep-stage transition analysis showed that the depolarization of AVP neurons through SSFO promotes the transition from all states to wakefulness. After the end of stimulation, a compensatory increase in transitions to NREM sleep was observed. Ex vivo, SSFO activation in AVP neurons causes depolarization and modifies the activity of AVP neurons. Therefore, the results of this thesis project suggest an essential role of AVP neurons as mediators between circadian rhythmicity and sleep-wake behaviour.