Aktuell herrscht in der Wissenschaft Unklarheit über die pathologischen Prozesse, die durch Caspr2-aAK ausgelöst werden. Dissens herrscht, ob es durch die aAK im Serum oder im Liquor zu einer Internalisierung von an der Zellmembran exprimierten Caspr2 kommt. Ebenso ist nicht abschließend geklärt, inwieweit die Struktur des VGKC durch die aAK-Bindung verändert wird. Mit der vorliegenden Arbeit wurden Untersuchungen zum Pathomechanismus von Caspr2-aAK vorgenommen, indem die Oberflächenexpression von Caspr2 in DRGs im Langzeitversuch näher untersucht wurde. Dafür wurden zunächst die Caspr2-aAK in den Patientenseren mithilfe immunzytochemischer Färbungen in vitro sowohl in transfizierten HEK293, als auch in adulten DRGs nachgewiesen. Zusätzlich wurde mit der Membranpräparation von Caspr2 transfizierten HEK293-Zellen die Caspr2 Bindung mittels proteinbiochemischen Nachweises verifiziert. Es wurde zudem eine Subklassenbestimmung an den 9 vorliegenden Patientenseren und einer Probe mit aufgereinigtem IgG durchgeführt. Die dominante Subklasse war IgG4 was mit dem wissenschaftlichen Forschungsstand kongruiert, dass IgG4 bei Caspr2-aAK der dominierende Subtyp ist. Im Langzeitversuch zur Untersuchung einer möglichen Internalisierung von Caspr2 durch die Inkubation in Caspr2-aAK positiven Seren wurden in vitro kultivierte DRGs adulter Mäuse für 24h, 48h, bzw. 96 h mit den Seren konfrontiert. Zusätzlich wurde überprüft wie sich ein Rescue der Zellen – nach 48 h wurde das Caspr2-aAK positive Serum gegen ein Caspr2-negatives Serum für weitere 48 h ausgetauscht – auf die Oberflächenexpression auswirkt. Zur Überprüfung der Dichte des an der Zellmembran exprimierten Caspr2 Proteins wurde diese abschließend quantifiziert und statistisch ausgewertet. Zusammenfassend ließ sich bei keinem der untersuchten Seren eine signifikante Veränderung der Caspr2 Oberflächenexpression erkennen. Mit diesen Ergebnissen konnte gezeigt werden, dass eine vorübergehende Erniedrigung/Erhöhung der Caspr2 Expression nach Inkubation mit aAK durch primäre DRG Neurone kompensiert wird und eine erhöhte Internalisierung nicht als ursächlich für den Pathomechanismus der Caspr2-aAK in Frage kommt.

In dieser Arbeit wurde mit Hilfe von small-molecule Inhibitoren die Rolle von clathrin- und dynaminabhängigen Endozytosemechanismen bei der Aufnahme von anti-Amphiphysin-Autoantikörpern am Zellkulturmodell primärer hippocampaler Neurone untersucht. Hierbei konnte eine Beeinflussung der Autoaantikörperaufnahme durch die Intervention gezeigt werden. Außerdem erfolgte der Versuch der Etablierung eines siRNA knockdowns unter Zuhilfenahme unterschiedlicher Traansfektionsreaaagenzien.

Theoretischer Hintergrund: Im Zuge der aktuellen demographischen Entwicklung konnte in den letzten Dekaden eine extreme Prävalenzzunahme der Demenz vom Alzheimertyp (AD) verzeichnet werden, die insbesondere künftige Generationen vor enorme gesundheitspolitische Herausforderungen stellen wird und zur Entwicklung früherer diagnostischer wie auch effektiver therapeutischer Verfahren drängt. Derzeit verfügbare Biomarker der AD sind entweder zu unspezifisch, invasiv oder zu teuer, um sie als breite Screeningwerkzeuge einsetzen zu können. Insbesondere die Erkenntnis, dass die pathologischen Prozesse der AD lange vor ihrer klinischen Manifestation im unteren Hirnstamm beginnen, führte zu der Entwicklung der neuen Methode der somatosensibel evozierten Potentiale des N. vagus (VSEP), die zunehmend als Marker der vagalen Hirnstammfunktion angesehen wird. Dennoch wurde in letzter Zeit die Aussagekraft der Vaguspotentiale angezweifelt, nachdem eine neuere Studie ihren muskulären Ursprung postulierte. Zur Validierung der parasympathischen Ätiologie der VSEP schien die Herzratenvariabilität (HRV) als breit anerkannter Marker der parasympathischen Aktivität besonders geeignet. Beide Methoden wurden auf ihren Zusammenhang sowie auf eine potentielle Veränderung im Rahmen eines „mild cognitive impairment“ (MCI) untersucht, um ihr diagnostisches Potenzial bezüglich eines prädementiellen Stadiums der AD zu überprüfen. Methoden: Die vorliegende Studie erfolgte als Querschnittsanalyse des ersten Untersuchungszeitpunktes der Vogel-Studie. Nach Ausschluss von Probanden mit HRV- wie VSEP-relevanten Erkrankungen (nicht Hypertonie, Medikamente) und sorgfältiger Datenbearbeitung enthielt die Gesamtstichprobe 218 ältere Probanden im Alter von 74 ± 1.4 Jahren (MCI: n=27; kognitiv gesunde Kontrollen: n=191). Die Erhebung der VSEP erfolgte nach den gängigen Methoden von Fallgatter et al. (2003) an den Elektrodenpositionen Fz-F3, Fz-F4, C3-F3, C4-F4 und T4-O1/T3-O1 bei sukzessiver Stimulation beider Innenseiten des Tragus, die Messung der HRV über 15 min mit einem Finometer® Midi. Nur VSEP-Latenzen (P1, N1, P2) und die vagal modulierten HRV-Variablen RMSSD, LF, HF, RSAnorm (natürlicher Logarithmus) wurden in die weitere Analyse eingeschlossen. Zur Gegenüberstellung von VSEP und HRV in der Kontrollgruppe wurden Korrelationen sowie univariate Varianzanlysen der Quartilgruppen HRV-korrelierter VSEP-Latenzen, zum Vergleich von VSEP und HRV in MCI- und Kontrollgruppe T-Tests für unabhängige Stichproben durchgeführt. Ergebnisse: Für die gesunde Kontrollgruppe konnten in den Korrelationsberechnungen unter Kontrolle potentieller Einflussfaktoren signifikante Ergebnisse in den Elektrodenpositionen T4-O2 (Stimulation rechts) sowie C4-F4 (Stimulation links) verzeichnet werden. Alle Latenzkomponenten des Kanals C4-F4 zeigten signifikante, negative Korrelationen mit den vagal modulierten HRV-Parametern (P1 mit ln RMSSD, ln LF, ln HF, RSAnorm; N1 mit ln RMSSD, ln LF, ln HF; P2 mit ln LF). Die jeweiligen Latenz-Quartilgruppenvergleiche bestätigten, dass längere P1-Latenzen mit einem signifikant geringeren parasympathischen Tonus (RSAnorm, Trend bei HF) und einer signifikant geringeren Funktion der Baroreflexe (LF) einhergeht, wobei letzteres auch für P2 gilt. Die Ergebnisse der VSEP im Kanal T4-O2 fielen zwar konträr aus (positive Korrelation von P2 mit ln LF, ln HF, ln RSAnorm), konnten jedoch auch in Anbetracht eines allgemein schwächeren Zusammenhanges zwischen VSEP und HRV nur unzureichend durch die Varianzanalysen untermauert werden. Die Mittelwertsvergleiche zwischen MCI- und Kontrollgruppe ergaben einerseits vergleichbare HRV-Werte in beiden Gruppen, andererseits eine signifikante P2-Latenzverlängerung im Kanal T4-O2 (Stimulation rechts) in der MCI-Gruppe im Vergleich zu kognitiv gesunden Kontrollen. Schlussfolgerung: Trotz nicht hundertprozentig kongruenter Ergebnisse konnte unter anderem anhand der P1-Latenz im Kanal C4-F4 und der in hohem Maße parasympathisch modulierten RSAnorm ein sehr signifikanter Zusammenhang zwischen HRV und VSEP-Latenzen deutlich gemacht werden. Dies legt den Ursprung der VSEP in den autonomen Strukturen des Hirnstamms nahe. So könnte sich eventuell eine Verzögerung der VSEP-Latenz P2, wie es in der vorliegenden Studie bei MCI-Patienten beobachtet wurde, als additiver, nicht-invasiver Biomarker zur Frühdiagnose von prädementiellen Phasen der AD etablieren. Bereits angelaufene Längsschnittstudien wie die Vogelstudie werden künftig genauere Aussagen über die prädiktive Aussagekraft der VSEP zur Vorhersage einer AD liefern.

Die (Para-)nodopathie ist neben der primär axonalen und der primär demyelinisierenden Polyneuropathie eine neue Krankheitsentität, die sich durch eine Schädigung der Funktion des Ranvierschen Schnürringes auszeichnet. Die Forschung zu (para-)nodalen Autoantikörpern fokussierte sich bislang hauptsächlich auf Neurofascin-155- und Contactin-1-Autoantikörper der Subklasse IgG4. In dieser Studie wurden die Seren von insgesamt 264 PatientInnen mit CIDP, GBS oder anderen Formen von Polyneuropathien mittels Bindungsassays an murinen Ischiadicuszupfnerven und gegebenenfalls ELISA auf (para-)nodale Autoantikörper gescrennt. Positive Autoantikörperbefunde wurden bei IgG-Autoantikörpern mittels Bindungsassays an transfizierten HEK-293-Zellen und bei IgM-Autoantikörpern mittels Western Blot bestätigt. ELISA Untersuchungen dienten zur näheren Spezifizierung. Weiterhin wurde die zeitabhängige Wirkung von Contactin-1-Autoantikörpern im Zellkulturmodell untersucht. Die im folgenden dargestellten Ergebnisse zeigen, dass die (Para-)nodopathie nicht auf die bisher am häufigsten beschriebene Erkrankung mit IgG4-Autoantikörpern beschränkt werden sollte. Bei dem extrem schwer betroffenen IgG-Patient 1 konnte ein Pan-Neurofascin-IgG3-Autoantikörper nachgewiesen werden. Als charakteristische Symptome für diese Autoantikörper konnten in Übereinstimmung mit weiteren Fallberichten Tetraplegie, Beatmungspflichtigkeit sowie eine schwere Hirnnervenbeteiligung bis zur Locked-In-Symptomatik identifiziert werden. Diese Patienten heben sich deutlich von den PatientInnen mit den bisher hauptsächlich beschriebenen Neurofascin-155-IgG4-Autoantikörpern ab, die wie IgG-Patient 2 charakteristischerweise in jungem Alter an einer CIDP mit Tremor ohne Besserung unter IVIG-Therapie leiden. Es wurden fünf PatientInnen mit Neurofascin-155-IgM-Autoantikörpern identifiziert, die eine akut beginnende Erkrankung mit Tetraparese, Tremor und neuropathischen Schmerzen zeigten. Ob sich dieser Phänotyp als charakteristisch für eine Neurofascin-155-IgM-(Para-)nodopathie bestätigt, sollte in weiteren Studien untersucht werden. Im murinen Zellkulturmodell an cerebellären Neuronen und Spinalganglienneuronen zeigte sich nach Inkubation mit Contactin-1-IgG-Patientenantikörpern eine zeitabhängige, rasch reversible Verminderung der Contactin-1-Protein-Expression in immunhistochemischen Färbungen sowie Western Blots, die durch eine Internalisierung des Contactin-1-Proteins erklärbar wäre. Der Angriff von Autoantikörpern an Spinalganglienneuronen und cerebellären Neurone sollte in weitere pathophysiologische Überlegungen miteinbezogen werden, da hierdurch typische Symptome der (Para-)nodopathie wie eine sensible Ataxie oder ein cerebellärer Tremor erklärt werden könnten.

Fabry disease (FD) is an X-linked lysosomal storage disorder with intracellular accumulation of globotriaosylceramide (Gb3) due to α-galactosidase A deficiency. We studied α-galactosidase A knockout mice (GLA KO) as a model for sensory disturbance and pain in FD. Pain associated behavior of young (3 months) and old (≥18 months) GLA KO mice and wildtype (WT) littermates in an inflammatory and a neuropathic pain model was investigated. Furthermore, affective and cognitive behavior was assessed in the naïve state and in an inflammatory pain model. Gene and protein expression of pain associated ion channels and Gb3 accumulation in dorsal root ganglion (DRG) neurons was determined. We also performed patch clamp analysis on cultivated DRG neurons and human embryonic kidney 293 (HEK) cells expressing voltage-gated-sodium channel 1.7 (Nav1.7) as an in vitro model of FD. Intracellular Gb3 deposits were modulated using shRNA silencing of α-galactosidase A. After intraplantar injection of complete Freund`s adjuvant (CFA) and chronic constriction injury (CCI) of the right sciatic nerve, old GLA KO mice did not develop heat and mechanical hypersensitivity in contrast to young GLA KO and old WT mice. Additionally, we found no relevant differences between genotypes and age-groups in affective and cognitive behavior in the naïve state and after CFA injection. Gene and protein expression analysis provided no explanation for the observed sensory impairment. However, cultured DRG neurons of old GLA KO mice revealed a marked decrease of sodium and Ih-currents compared to young GLA KO and old WT mice. DRG neurons of old GLA KO mice displayed substantial intracellular accumulation of Gb3 compared to young GLA KO and old WT mice. Similar to cultured neurons, sodium currents were also decreased in HEK cells treated with shRNA and consecutively increased intracellular Gb3 deposits compared to the control condition, but could be rescued by treatment with agalsidase-alpha. Our study unveils that, similar to patients with FD, GLA KO mice display age-dependent sensory deficits. However, contrary to patients, GLA KO mice are also protected from hypersensitivity induced by inflammation and nerve lesion due to Gb3-dependent and reversible reduction of neuronal sodium- and Ih-currents. Our data provide evidence for direct Gb3-dependent ion channel impairment in sensory DRG neurons as a potential contributor to sensory dysfunction and pain in FD.