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The discovery, heterologous expression, and characterization of channelrhodopsin-2 (ChR2) – a light-sensitive cation channel found in the green alga Chlamydomonas reinhardtii – led to the success of optogenetics as a powerful technology, first in neuroscience. ChR2 was employed to induce action potentials by blue light in genetically modified nerve cells. In optogenetics, exogenous photoreceptors are expressed in cells to manipulate cellular activity. These photoreceptors were in the beginning mainly microbial opsins. During nearly two decades, many microbial opsins and their mutants were explored for their application in neuroscience. Until now, however, the application of optogenetics to plant studies is limited to very few reports. Several optogenetic strategies for plant research were demonstrated, in which most attempts are based on non-opsin optogenetic tools. Opsins need retinal (vitamin A) as a cofactor to generate the functional protein, the rhodopsin. As most animals have eyes that contain animal rhodopsins, they also have the enzyme - a 15, 15'-Dioxygenase - for retinal production from food-supplied provitamin A (beta-carotene). However, higher plants lack a similar enzyme, making it difficult to express functional rhodopsins successfully in plants. But plant chloroplasts contain plenty of beta-carotene. I introduced a gene, coding for a 15, 15'-Dioxygenase with a chloroplast target peptide, to tobacco plants. This enzyme converts a molecule of β-carotene into two of all-trans-retinal. After expressing this enzyme in plants, the concentration of all-trans-retinal was increased greatly. The increased retinal concentration led to increased expression of several microbial opsins, tested in model higher plants. Unfortunately, most opsins were observed intracellularly and not in the plasma membrane. To improve their localization in the plasma membrane, some reported signal peptides were fused to the N- or C-terminal end of opsins. Finally, I helped to identify three microbial opsins -- GtACR1 (a light-gated anion channel), ChR2 (a light-gated cation channel), PPR (a light-gated proton pump) which express and work well in the plasma membrane of plants. The transgene plants were grown under red light to prevent activation of the expressed opsins. Upon illumination with blue or green light, the activation of these opsins then induced the expected change of the membrane potential, dramatically changing the phenotype of plants with activated rhodopsins.
This study is the first which shows the potential of microbial opsins for optogenetic research in higher plants, using the ubq10 promoter for ubiquitous expression. I expect this to be just the beginning, as many different opsins and tissue-specific promoters for selective expression now can be tested for their usefulness. It is further to be expected that the here established method will help investigators to exploit more optogenetic tools and explore the secrets, kept in the plant kingdom.
The light-gated cation channel Channelrhodopsin-2 was discovered and characterized in 2003. Already in 2005/2006 five independent groups demonstrated that heterologous expression of Channelrhodopsin-2 is a highly useful and simply applicable method for depolarizing and thereby activating nerve cells. The application of Channelrhodopsin-2 revolutionized neuroscience research and the method was then called optogenetics. In recent years more and more light-sensitive proteins were successfully introduced as “optogenetic tools”, not only in neuroscience. Optogenetic tools for neuronal excitation are well developed with many different cation-conducting wildtype and mutated channelrhodopsins, whereas for inhibition of neurons in the beginning (2007) only hyperpolarizing ion pumps were available. The later discovered light-activated anion channels (anion channelrhodopsins) can be useful hyperpolarizers, but only at low cytoplasmic anion concentration. For this thesis, I optimized CsR, a proton-pumping rhodopsin from Coccomyxa subellipsoidea, which naturally shows a robust expression in Xenopus laevis oocytes and plant leaves. I improved the expression and therefore the photocurrent of CsR about two-fold by N-terminal modification to the improved version CsR2.0, without altering the proton pump function and the action spectrum. A light pulse hyperpolarised the mesophyll cells of CsR2.0-expressing transgenic tobacco plants (N. tabacum) by up to 20 mV from the resting membrane potential of -150 to -200 mV. The robust heterologous expression makes CsR2.0 a promising optogenetic tool for hyperpolarization in other organisms as well. A single R83H point-mutation converted CsR2.0 into a light-activated (passive) proton channel with a reversal potential close to the Nernst potential for intra-/extra-cellular H+ concentration. This light-gated proton channel is expected to become a further useful optogenetic tool, e.g. for analysis of pH-regulation in cells or the intercellular space. Ion pumps as optogenetic tools require high expression levels and high light intensity for efficient pump currents, whereas long-term illumination may cause unwanted heating effects. Although anion channelrhodopsins are effective hyperpolarizing tools in some cases, their effect on neuronal activity is dependent on the cytoplasmic chloride concentration which can vary among neurons. In nerve cells, increased conductance for potassium terminates the action potential and K+ conductance underlies the resting membrane potential in excitable cells. Therefore, several groups attempted to synthesize artificial light-gated potassium channels but 2 all of these published innovations showed serious drawbacks, ranging from poor expression over lacking reversibility to poor temporal precision. A highly potassium selective light-sensitive silencer of action potentials is needed. To achieve this, I engineered a light-activated potassium channel by the genetic fusion of a photoactivated adenylyl cyclase, bPAC, and a cAMP-gated potassium channel, SthK. Illumination activates bPAC to produce cAMP and the elevated cAMP level opens SthK. The slow diffusion and degradation of cAMP makes this construct a very light-sensitive, long-lasting inhibitor. I have successfully developed four variants with EC50 to cAMP ranging from 7 over 10, 21, to 29 μM. Together with the original fusion construct (EC50 to cAMP is 3 μm), there are five different light- (or cAMP-) sensitive potassium channels for researchersto choose, depending on their cell type and light intensity needs.
Optogenetics became successful in neuroscience with Channelrhodopsin-2 (ChR2), a light-gated cation channel from the green alga Chlamydomonas reinhardtii, as an easy applicable tool. The success of ChR2 inspired the development of various photosensory proteins as powerful actuators for optogenetic manipulation of biological activity. However, the current optogenetic toolbox is still not perfect and further improvements are desirable. In my thesis, I engineered and characterized several different optogenetic tools with new features.
(i) Although ChR2 is the most often used optogenetic actuator, its single-channel conductance and its Ca2+ permeability are relatively low. ChR2 variants with increased Ca2+ conductance were described recently but a further increase seemed possible. In addition, the H+ conductance of ChR2 may lead to cellular acidification and unintended pH-related side effects upon prolonged illumination. Through rational design, I developed several improved ChR2 variants with larger photocurrent, higher cation selectivity, and lower H+ conductance.
(ii) The light-activated inward chloride pump NpHR is a widely used optogenetic tool for neural silencing. However, pronounced inactivation upon long time illumination constrains its application for long-lasting neural inhibition. I found that the deprotonation of the Schiff base underlies the inactivation of NpHR. Through systematically exploring optimized illumination schemes, I found illumination with blue light alone could profoundly increase the temporal stability of the NpHR-mediated photocurrent. A combination of green and violet light eliminates the inactivation effect, similar to blue light, but leading to a higher photocurrent and therefore better light-induced inhibition.
(iii) Photoactivated adenylyl cyclases (PACs) were shown to be useful for light-manipulation of cellular cAMP levels. I developed a convenient in-vitro assay for soluble PACs that allows their reliable characterization. Comparison of different PACs revealed that bPAC from Beggiatoa is the best optogenetic tool for cAMP manipulation, due to its high efficiency and small size. However, a residual activity of bPAC in the dark is unwanted and the cytosolic localization prevents subcellular precise cAMP manipulation. I therefore introduced point mutations into bPAC to reduce its dark activity. Interestingly, I found that membrane targeting of bPAC with different linkers can remarkably alter its activity, in addition to its localization. Taken together, a set of PACs with different activity and subcellular localization were engineered for selection based on the intended usage. The membrane-bound PM-bPAC 2.0 with reduced dark activity is well-tolerated by hippocampal neurons and reliably evokes a transient photocurrent, when co-expression with a CNG channel.
(iv) Bidirectional manipulation of cell activity with light of different wavelengths is of great importance in dissecting neural networks in the brain. Selection of optimal tool pairs is the first and most important step for dual-color optogenetics. Through N- and C-terminal modifications, an improved ChR variant (i.e. vf-Chrimson 2.0) was engineered and selected as the red light-controlled actuator for excitation. Detailed comparison of three two-component potassium channels, composed of bPAC and the cAMP-activated potassium channel SthK, revealed the superior properties of SthK-bP. Combining vf-Chrimson 2.0 and improved SthK-bP “SthK(TV418)-bP” could reliably induce depolarization by red light and hyperpolarization by blue light. A residual tiny crosstalk between vf-Chrimson 2.0 and SthK(TV418)-bP, when applying blue light, can be minimized to a negligible level by applying light pulses or simply lowering the blue
light intensity.
Channelrhodopsin 2 (ChR2) aus dem Augenfleck von C. rheinhardtii gehört zur Gruppe der mikrobiellen Rhodopsine (Typ1-Rhodopsine). ChR2 besteht aus einem extrazellulär gelegenen N-Terminus, 7 Transmembranhelices und einem zytosolisch gelegenen C-Terminus. Der lichtreaktive Bestandteil (Chromophor) all-trans-Retinal ist via Schiff´ Base kovalent an ein Lysinrest der siebten Transmembranhelix gebunden. Bei Applikation von Blaulicht isomerisiert all-trans- zu 13-cis-Retinal, was in einer Konformationsänderung und dem Öffnen des Kanals resultiert. Abhängig vom elektrochemischen Gradienten können ein- und zweiwertige Kationen in die Zelle ein- oder aus der Zelle herausströmen.
Eine retinalabhängige Stabilität konnte bereits für Bakteriorhodopsin (BR) bestätigt werden (Booth, Farooq et al. 1996, Turner, Chittiboyina et al. 2009, Curnow and Booth 2010), bezüglich ChR2 waren bisher nur wenige Daten verfügbar (Hegemann, Gartner et al. 1991, Lawson, Zacks et al. 1991). Die heterologe Expression von wildtypischem und modifiziertem ChR2 in Oozyten von X. laevis erlaubte einen detaillierteren Einblick in die retinalabhängige Stabilität und pH-abhängige Dunkelleitfähigkeit von Guanidinium.
Wildtypisches Chop2 zeigte bei Zugabe von Retinal zum Inkubationsmedium, direkt nach RNA-Injektion, Stromamplituden im µA-Bereich und deutliche Fluoreszenzintensitäten. Ausschließlich endogen vorhandenes Retinal hatte verminderten Fluoreszenzen und Stromamplituden zur Folge, was auf ein geringes Vorhandensein von Chop2-Proteinen in der Plasmamembran hindeutete. Da die Inkubation über Nacht in retinalsupplementierter Lösung nur eine minimale Erhöhung des resultierenden Stromes erbrachte, deuten die in dieser Arbeit erhaltenen Ergebnisse stark auf eine verminderte Stabilität des Proteins bei fehlender Bindung des Kofaktors Retinal.
Das Einfügen einer aromatischen Aminosäure (Y/F/W) an Position 159 führte zu einer, von der Retinalsupplementation unabhängigen, in beiden Ansätzen gleichwertigen Expressionsstärke. Diese äusserte sich in äquivalenten Fluoreszenzintensitäten. Die erhaltenen Stromamplituden wiesen eine starke Differenz auf: ohne Zugabe zusätzlichen Chromophors lag die Stromstärke bei nur wenigen Nanoampere, die bei Inkubation in einer retinalhaltigen Lösung über Nacht auf das Niveau von retinalsupplementierten Oozyten anstieg. Des Weiteren konnte die Zunahme der Stromamplitude innerhalb von 15 Minuten beobachtet werden, wenn die vermessenen Oozyten mit einer retinalhaltigen Lösung perfundiert wurden. Zusammengefasst weisen die Ergebnisse auf eine Stabilisierung des aromatisch substituierten Proteins hin. Bei der von Berndt et al. (2011) beschriebenen Mutante T159C konnten diese Eigenschaften nicht nachgewiesen werden.
Die Modifikation der Retinalbindestelle (K257) in Verbindung mit einer aromatischen Substitution an Position 159 resultierte in deutlichen Fluoreszenzintensitäten, unabhängig von der Retinalverfügbarkeit bei, in beiden Fällen, fehlenden lichtaktivierten Strömen. Diese und die gleichwertigen Bandenstärken des Proteinimmunoblots von aromatisch substituierten ChR2-Varianten unterstützen die Hypothese der retinalunabhängigen Stabilität zusätzlich.
Die Ergebnisse legen, im Falle von Chop2-WT, eine Degradation des Apoproteins nahe. Bei Einfügen einer aromatischen AS an Position 159 ist das Apoprotein davor geschützt (siehe Abb. 75). Infolge der strukturellen Similarität, dem Vorhandensein delokalisierter π-Elektronen und der räumlichen Größe der aromatischen AS ist eine strukturelle Veränderung des Apoproteins denkbar, die eine Degradation aufgrund von nunmehr unzugänglichen Ubiquitinierungsstellen verhindert.
Des Weiteren besteht die Möglichkeit, dass sich bei fehlender Bindung des Kofaktors Wassermoleküle in der Nähe der Bindetasche befinden, welche von umliegenden Aminosäuren (u.a. T159, D156) unter großem Energieaufwand koordiniert werden und die strukturelle Integrität bis hin zur Degradation beeinträchtigen können. Dies könnte durch eine Erhöhung der Hydrophobizität bei Einfügen einer aromatischen Aminosäure verhindert werden.
Bei Substitutionen durch eine aromatische AS (Y/W/F) an Position 159 zeigte sich ein weiteres, bisher nicht beschriebenes, Charakteristikum. Bei Perfusion der Oozyten mit einer guanidiniumhaltigen Lösung, konnten in Abhängigkeit des pH-Wertes ohne die Applikation von Licht Stöme im µA Bereich aufgezeichnet werden. Die Größe der Stromamplitude korreliert hierbei mit dem Anstieg des pH-Wertes und der Konzentration an Guanidiniumionen der perfundierten Lösung und kann durch das Hinzufügen von 1mM Lanthan reversibel geblockt werden. Des Weiteren konnten die vorgenommenen Messungen die Ergebnisse der retinalabhängigen Degradation verifizieren, da der Einstrom von Gua+ sowohl bei retinalsupplementierter Inkubation, als auch bei ausschließlich endogen vorhandenem Retinal zu beobachten war. Des Weiteren zeigte auch die Doppelmutante T159Y/K257R trotz ihres Unvermögens Retinal zu binden, die beschriebenen lichtunabhängigen Ströme.
Die Ergebnisse bei Substitution durch Phenylalanin (F) stellen eine Abweichung des Musters dar. Bei Inkubation von T159F-injizierten Zellen bei ausschließlich endogen vorhandenem Retinal konnte eine stark erhöhte Guanidiniumleitfähigkeit festgestellt werden, diese kam jedoch bei retinalsupplementierter Inkubation nicht zum Tragen. Dies könnte ein Hinweis auf eine sterische Hinderung durch das gebundene Chromophor sein, die bei den Substitutionen durch Tyrosin und Tryptophan, möglicherweise durch unterschiedliche chemische Eigenschaften der AS, nicht auftreten.
Die hervorgerufene pH-Abhängigkeit kann in zwei möglichen Ursachen begründet liegen:
• Vorhandensein einer (de)protonierbaren Gruppe wie Histidin, Arginin oder Lysin, die als pH-Sensor dienen könnte
• Deprotonierung der Schiff´ Base durch Guandininium
Das Vorhandensein eines pH-Sensors konnte durch die vorgenommenen Modifikationen von H114, R115, R120 und H249 nicht bestätigt werden.
Bei Substitution von K257 (in Verbindung mit T159Y) zu Arginin (R) konnte weiterhin ein pH-abhängiger Gua+-Dunkelstrom festgestellt werden. Die Modifikation zu Alanin (A) oder Glutamin (Q) hingegen resultierte im Ausbleiben der Ströme. Der Austausch einer basischen zu einer neutralen Gruppe ohne protonierbaren Rest deutet auf die Beteiligung der Schiff´ Base bzw. der Aminosäure an Position 257 am Mechanismus der Dunkelleitfähigkeit hin.
Characterization of novel rhodopsins with light-regulated cGMP production or cGMP degradation
(2019)
Photoreceptors are widely occurring in almost all kingdoms of life. They mediate the first step in sensing electromagnetic radiation of different wavelength. Absorption spectra are found within the strongest radiation from the sun and absorption usually triggers downstream signaling pathways. Until now, mainly 6 classes of representative photoreceptors are known: five water-soluble proteins, of these three classes of blue light-sensitive proteins including LOV (light-oxygen-voltage), BLUF (blue-light using FAD), and cryptochrome modules with flavin (vitamin B-related) nucleotides as chromophore; while two classes of yellow and red light-sensitive proteins consist of xanthopsin and phytochrome, respectively. Lastly, as uniquely integral membrane proteins, the class of rhodopsins can usually sense over a wide absorption spectrum, ranging from ultra-violet to green and even red light. Rhodopsins can be further divided into two types, i.e., microbial (type I) and animal (type II) rhodopsins. Rhodopsins consist of the protein opsin and the covalently bound chromophore retinal (vitamin A aldehyde). In this thesis, I focus on identification and characterization of novel type I opsins with guanylyl cyclase activity from green algae and a phosphodiesterase opsin from the protist Salpingoeca rosetta.
Until 2014, all known type I and II rhodopsins showed a typical structure with seven transmembrane helices (7TM), an extracellular N-terminus and a cytosolic C-terminus. The proven function of the experimentally characterized type I rhodopsins was membrane transport of ions or the coupling to a transducer which enables phototaxis via a signaling chain. A completely new class of type I rhodopsins with enzymatic activity was identified in 2014. A light-activated guanylyl cyclase opsin was discovered in the fungus Blastocladiella emersonii which was named Cyclop (Cyclase opsin) by Gao et al. (2015), after heterologous expression and rigorous in-vitro characterization. BeCyclop is the first opsin for which an 8 transmembrane helices (8TM) structure was demonstrated by Gao et al. (2015). Earlier (2004), a novel class of enzymatic rhodopsins was predicted to exist in C. reinhardtii by expressed sequence tag (EST) and genome data, however, no functional data were provided up to now. The hypothetical rhodopsin included an N-terminal opsin domain, a fused two-component system with histidinekinase and response regulator domain, and a C-terminal guanylyl cyclase (GC) domain. This suggested that there could be a biochemical signaling cascade, integrating light-induction and ATP-dependent phosphate transfer, and as output the light-sensitive cGMP production.
One of my projects focused on characterizing two such opsins from the green algae Chlamydomonas reinhardtii and Volvox carteri which we then named 2c-Cyclop (two-component Cyclase opsin), Cr2c-Cyclop and Vc2c-Cyclop, respectively. My results show that both 2c-Cyclops are light-inhibited GCs. Interestingly, Cr2c-Cyclop and Vc2c-Cyclop are very sensitive to light and ATP-dependent, whereby the action spectra of Cr2c-Cyclop and Vc2c-Cyclop peak at ~540 nm and ~560 nm, respectively. More importantly, guanylyl cyclase activity is dependent on continuous phosphate transfer between histidine kinase and response regulator. However, green light can dramatically block phosphoryl group transfer and inhibit cyclase activity. Accordingly, mutation of the retinal-binding lysine in the opsin domain resulted in GC activity and lacking light-inhibition.
A novel rhodopsin phosphodiesterase from the protist Salpingoeca rosetta (SrRhoPDE) was discovered in 2017. However, the previous two studies of 2017 claimed a very weak or absent light-regulation. Here I give strong evidence for light-regulation by studying the activity of SrRhoPDE, expressed in Xenopus laevis oocytes, in-vitro at different cGMP concentrations. Surprisingly, hydrolysis of cGMP shows a ~100-fold higher turnover than that of cAMP. Light can enhance substrate affinity by decreasing the Km value for cGMP from 80 μM to 13 μM, but increases the maximum turnover only by ~30%. In addition, two key single mutants, SrRhoPDE K296A or K296M, can abolish the light-activation effect by interrupting a covalent bond of Schiff base type to the chromophore retinal. I also demonstrate that SrRhoPDE shows cytosolic N- and C- termini, most likely via an 8-TM structure. In the future, SrRhoPDE can be a potentially useful optogenetic tool for light-regulation of cGMP concentration, possibly after further improvements by genetic engineering.
Water transport through the water channels, aquaporins (AQPs), is involved in epithelial fluid secretion and absorption, cell migration, brain edema, adipocyte metabolism, and other physiological or pathological functions. Modulation of AQP function has therapeutic potential in edema, cancer, obesity, brain injury, glaucoma, etc. The function of AQPs is in response to the osmotic gradient that is formed by the concentration differences of ions or small molecules. In terms of brain edema, it is a pathophysiological condition, resulting from dysfunction of the plasma membrane that causes a disorder of intracellular ion homeostasis and thus increases intracellular fluid content. Optogenetics can be used to regulate ion transport easily by light with temporal and spatial precision. Therefore, if we control the cell ion influx, boosting the water transport through AQPs, this will help to investigate the pathological mechanisms in e.g. brain edema. To this end, I investigated the possibility for optogenetic manipulating water transport in Xenopus oocytes. The main ions in Xenopus oocyte cytoplasm are ~10 mM Na+, ~50 mM Cl- and ~100 mM K+, similar to the mammalian cell physiological condition. Three light-gated channels, ChR2-XXM 2.0 (light-gated cation channel), GtACR1 (light-gated anion channel) and SthK-bPAC (light-gated potassium channel), were used in my study to regulate ion transport by light and thus manipulate the osmotic gradient and water transport. To increase water flow, I also used coexpression of AQP1. When expressing ChR2-XXM 2.0 and GtACR1 together, mainly Na+ influx was triggered by ChR2-XXM2.0 under blue light illumination, which then made the membrane potential more positive and facilitated Cl- influx by GtACR1. Due to this inward movement of Na+ and Cl-, the osmotic gradient was formed to trigger water influx through AQP1. Large amounts of water uptake can speedily increase the oocyte volume until membrane rupture. Next, when co-expressing GtACR1 and SthK-bPAC, water efflux will be triggered with blue light because of the light-gated KCl efflux and then oocyte shrinking could be observed.
I also developed an optogenetic protein purification method based on a light-induced protein interactive system. Currently, the most common protein purification method is based on affinity chromatography, which requires different chromatography columns and harsh conditions, such as acidic pH 4.5 - 6 and/or adding imidazole or high salt concentration, to elute and collect the purified proteins. The change in conditions could influence the activity of target proteins. So, an easy and flexible protein purification method based on the photo-induced protein interactive system iLID was designed, which regulates protein binding with light in mild conditions and does not require a change of solution composition. For expression in E. coli, the blue light-sensitive part of iLID, the LOV2 domain, was fused with a membrane anchor and expressed in the plasma membrane, and the other binding partner, SspB, was fused with the protein of interest (POI), expressed in the cytosol. The plasma membrane fraction and the soluble cytosolic fraction of E. coli can be easily separated by centrifugation. The SspB-POI can be then captured to the membrane fraction by light stimulation and released to clean buffer in the dark after washing. This method does not require any specific column and functions in mild conditions, which are very flexible at scale and will facilitate extensive protein engineering and purification of proteins, sensitive to changed buffer conditions.
In der vorliegenden Arbeit wurden lichtaktivierte Nucleotidcyclasen auf Basis der lichtaktivierten Adenylatcyclase bPAC (=BlaC, Ryu et al., 2010; Stierl et al., 2011), sowie der direkt lichtaktivierbare Kationenkanal Channelrhodopsin-2 (Nagel et al., 2003) eingesetzt, um lichtinduzierte und damit nicht-invasive Manipulationen der Second Messenger cAMP, cGMP und Calcium, sowie des Membranpotentials in Pflanzenzellen vorzunehmen. Nach transienter Transfektion von N. benthamiana konnte sowohl die Expression der beiden Channelrhodopsinvarianten C128A::YFP und C128T::YFP (unveröffentlichte Daten von R. Gueta und G. Nagel, 2008, Berndt et al., 2009; Bamann et al., 2010), als auch deren Lokalisation in der Plasmamembran von Protoplasten fluoreszenzmikroskopisch gezeigt werden. Die Funktion von Channelrhodopsin als lichtaktivierbarer Kationenkanal konnte in dieser Arbeit erstmals elektrophysiologisch in Pflanzenzellen nachgewiesen werden. In Einstichmessungen im Mesophyllgewebe von N. benthamiana wurden reproduzierbar blaulichtinduzierte Depolarisationen der Plasmamembran erzielt, die in Dauer und Frequenz über das applizierte Lichtmuster steuerbar waren. In Patch-Clamp-Messungen an epidermalen Protoplasten von N. benthamiana, welche transient Channelrhodopsin-2-C128A und Channelrhodopsin-2-C128T exprimierten, konnten zudem blaulichtinduzierte Einwärts-Ströme gezeigt werden. Die Expression der beiden verwendeten Channelrhodopsinvarianten schien hierbei annähernd unabhängig von der vorliegenden Konzentration des zugegebenen Retinals. Des Weiteren konnte in A. thaliana sowohl die Expression als auch die Funktion der lichtaktivierbaren Adenylatcyclase bPAC::YFP (Stierl et al., 2011), sowie einer hieraus durch gezielte Mutation (nach Ryu et al., 2010) abgeleiteten lichtaktivierbaren Guanylatcyclase (bPGC::YFP) erstmalig in höheren Pflanzen gezeigt werden. Nach Bestätigung der Funktion dieser beiden lichtaktivierbaren Nucleotidcyclasen in transient transfizierten Protoplasten von A. thaliana wurden zwei stabil transgene Pflanzenlinien generiert. ZUSAMMENFASSUNG DER ARBEIT - 190 - Pflanzen dieser Linie exprimierten neben dem konstitutiv unter der Kontrolle des 35S-CaMV-Promotors exprimierten Calciumreporterprotein Aequorin zusätzlich und unter der Kontrolle eines östrogeninduzierbaren Glucocorticoidpromotors (Zuo et al., 2000) die lichtaktivierten Nucleotidcyclasen bPAC::YFP bzw. bPGC::YFP. In beiden stabil transgenen Pflanzenlinien wurden Expression und Funktion der jeweiligen lichtaktivierten Nucleotidcyclase gezeigt. In Messungen an einem modifizierten Luminometer konnten weiterhin erstmals blaulichtinduzierte Calciumsignaturen in Pflanzenzellen generiert werden. Auf die Folge von Blaulichtpulsen kam es wiederholt zum Calciumeinstrom in Zellen der erstellten transgenen Pflanzenlinien. Neben der Möglichkeit, sowohl die Konzentration der cyclischen Nucleotide als auch des cytoplasmatischen Calciums über Licht zu manipulieren, wurde durch diese Pflanzen ein direkter Zusammenhang beider Second Messenger gezeigt. Weiterhin sind phänotypische Auffälligkeiten der erstellten Pflanzenlinien beobachtet worden. Es kam zur Verzögerung des Keimungszeitpunktes bPAC::YFP-exprimierender Samen im Licht, jedoch wuchsen die Pflanzen im Anschluss an die verzögerte Keimung normal und uneingeschränkt weiter. In bPAC::YFP-exprimierenden Pollen von Nicotiana SR-1 konnte zudem das Wachstum der Pollenschläuche durch blaues Licht gestoppt werden. bPGC::YFP-exprimierende Pollen hingegen zeigten auch im blauen Licht unverändertes Pollenschlauchwachstum. Neben den beiden erfolgreich generierten, stabil transgenen Pflanzenlinien wurden in analogen Ansätzen transgene A. thaliana Col-0 Aequorin Zellkulturlinien generiert, die neben dem konstitutiv aktiven Calciumreporterprotein Aequorin ebenso bPAC::YFP bzw. bPGC::YFP unter der Kontrolle des östrogeninduzierbaren Glucocorticoidpromotors (Zuo et al., 2000) exprimierten. Auch hier konnten Expression und Funktion beider Nucleotidcyclasen immunologisch und fluoreszenzmikroskopisch gezeigt werden. Über den Einsatz einer sog. 2A-Sequenz wurde weiterhin ein funktionsfähiges Fusionskonstrukt aus dem cAMP-aktivierten Kationenkanal CNGA2 (C460W-E583M, nach Rich et al., 2001) und der lichtaktivierten Adenylatcyclase EuPACα (Iseki et al., 2002) erstellt. Die Funktion dieses Fusionskonstruktes wurde elektrophysiologisch sowie immunologisch gezeigt.
All living organisms need timekeeping mechanisms to track and anticipate cyclic changes in their environment. The ability to prepare for and respond to daily and seasonal changes is endowed by circadian clocks. The systemic features and molecular mechanisms that drive circadian rhythmicity are highly conserved across kingdoms. Therefore, Drosophila melanogaster with its relatively small brain (ca. 135.000 neurons) and the outstanding genetic tools that are available, is a perfect model to investigate the properties and relevance of the circadian system in a complex, but yet comprehensible organism.
The last 50 years of chronobiological research in the fruit fly resulted in a deep understanding of the molecular machinery that drives circadian rhythmicity, and various histological studies revealed the neural substrate of the circadian system. However, a detailed neuroanatomical and physiological description on the single-cell level has still to be acquired. Thus, I employed a multicolor labeling approach to characterize the clock network of Drosophila melanogaster with single-cell resolution and additionally investigated the putative in- and output sites of selected neurons.
To further study the functional hierarchy within the clock network and to monitor the “ticking clock“ over the course of several circadian cycles, I established a method, which allows us to follow the accumulation and degradation of the core clock genes in living brain explants by the means of bioluminescence imaging of single-cells.
Ionotrope Glutamatrezeptoren (iGluRs) sind ligandengesteuerte Ionenkanäle und vermitteln den Großteil der exzitatorischen Signalweiterleitung im gesamten zentralen Nervensystem. Darüber hinaus spielen iGluRs eine entscheidende Rolle bei der neuronalen Entwicklung und Funktion, einschließlich Lernprozessen und Gedächtnisbildung. Da eine Fehlfunktion dieser Rezeptoren mit zahlreichen neurodegenerativen Erkrankungen verbunden ist, stellen iGluRs zudem wichtige Zielproteine für die pharmakologische Wirkstoffentwicklung dar. Im Allgemeinen wird zwischen drei Untergruppen ionotroper Glutamatrezeptoren unterschieden, welche aufgrund ihrer Selektivität für einen bestimmten Liganden benannt sind: AMPA-, Kainate-, und NMDA-Rezeptoren. Die iGluRs jeder dieser Untergruppen bestehen in der Regel aus vier Untereinheiten, welche wiederum aus vier semiautonomen Domänen aufgebaut sind: (i) die aminoterminale Domäne (ATD), (ii) die Ligandenbindedomäne (LBD), (iii) die Transmembrandomäne (TMD) und (iv) die carboxyterminale Domäne (CTD).
Die Ligandenbindedomäne, welche wiederum aus zwei Lobes (D1 und D2) besteht und in ihrer Struktur einer Muschelschale ähnelt, vollzieht bei Bindung eines Neurotransmitters eine Konformationsänderung, wobei sie sich um den gebundenen Agonisten herumschließt. Diese Konformationsänderung der LBD wird auf die Transmembrandomäne, welche den membranüberspannenden Ionenkanal ausbildet, übertragen, was in einer Umlagerung der Transmembranhelices und infolgedessen der Öffnung des Ionenkanals resultiert. Die Konformationsänderung der LBD ist demnach die treibende Kraft, welche dem Öffnen und Schließen des Ionenkanals zugrunde liegt. Aus diesem Grund stellt die isolierte Ligandenbindedomäne, welche als lösliches Protein hergestellt werden kann, ein etabliertes Modellsystem zur Untersuchung der strukturellen und funktionellen Zusammenhänge innerhalb des Funktionsmechanismus ionotroper Glutamatrezeptoren dar.
Im Rahmen dieser Arbeit wurden die Konformationsdynamiken der in Escherichia coli-Bakterien exprimierten isolierten Ligandenbindedomänen der drei homologen Untergruppen – AMPA-, Kainate- und NMDA-Rezeptoren – sowohl als Monomer als auch als Dimer untersucht. Hierbei wurden im ungebundenen Apo-Zustand der Proteine signifikante Kinetiken im Bereich von Nanosekunden bis Mikrosekunden festgestellt, welche bei Bindung eines Agonisten sowie bei Dimerisierung erheblichen Veränderungen zeigen. Darüber hinaus wurde allosterische Kommunikation zwischen den LBDs der NMDA-Untergruppe untersucht, wobei in der Tat ein deutlicher allosterischer Effekt in Bezug auf die Konformationsdynamiken der Proteine gemessen werden konnte. Weiterhin wurde ein PET-FCS-basiertes Verfahren zur Messung der Dissoziationskonstante der Bindung eines Liganden an die LBD eines AMPA-Rezeptors entwickelt. Zuletzt wurde außerdem ermittelt, ob ein Unterschied zwischen vollen und partiellen Agonisten hinsichtlich ihres Einflusses auf die Konformationsdynamiken einer AMPA-Rezeptor LBD besteht, was nachgewiesenermaßen nicht der Fall ist.
Alle Messungen wurden auf Einzelmolekülebene auf Zeitskalen von Nanosekunden bis Millisekunden basierend auf Fluoreszenzfluktuationen unter Verwendung des photoinduzierten Elektronentransfers (PET) in Kombination mit Korrelationsspektroskopie (PET-FCS) durchgeführt. Zu diesem Zweck wurden PET-basierte Fluoreszenzsonden entwickelt, um Konformationsänderungen auf einer räumlichen Skala von einem Nanometer zu detektieren.
Durch die Experimente innerhalb dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die PET-FCS-Methode eine vielversprechende Ergänzung zu allen bisher bestehenden Methoden zur Untersuchung der Konformationsdynamiken der Ligandenbindedomäne ionotroper Glutamatrezeptoren darstellt und daher eine aussichtsreiche Möglichkeit zur Erweiterung des zukünftigen Verständnisses der Funktionsweise von iGluRs bietet.
Platelets play an essential role in haemostasis. Through granule secretion of second wave mediators and aggregation, they secure vascular integrity. Due to incorrect activation, platelet aggregation and subsequent thrombus formation can cause blood vessel occlusion, leading to ischemia. Patients with defects in platelet production have a low platelet count (thrombocytopenia), which can cause an increased bleeding risk. In vitro platelet generation is still in its development phase. So far, no convincing results have been obtained. For this reason, the health care system still depends on blood donors. Platelets are produced by bone marrow megakaryocytes (MKs), which extend long cytoplasmic protrusions, designated proplatelets, into sinusoidal blood vessels. Due to shear forces, platelets are then released into the bloodstream. The molecular mechanisms underlying platelet production are still not fully understood. However, a more detailed insight of this biological process is necessary to improve the in vitro generation of platelets and to optimise treatment regimens of patients.
Optogenetics is defined as “light-modulation of cellular activity or of animal behaviour by gene transfer of photo-sensitive proteins”. Optogenetics has had a big impact on neuroscience over the last decade. The use of channelrhodopsin 2 (ChR2), a light-sensitive cation channel, made it possible to stimulate neurons precisely and minimally invasive for the first time. Recent developments in the field of optogenetics intend to address a broader scope of cellular and molecular biology.
The aim of this thesis is to establish optogenetics in the field of MK research in order to precisely control and manipulate MK differentiation. An existing “optogenetic toolbox“ was used, which made it possible to light-modulate the cellular concentration of specific signalling molecules and ion conductance in MKs. Expression of the bacterial photoactivated adenylyl cyclase (bPAC) resulted in a significant increase in cAMP concentration after 5 minutes of illumination. Similarly, intracellular cGMP concentrations in MKs expressing photoactivated guanylyl cyclase (BeCyclop) were elevated. Furthermore, proplatelet formation of MKs expressing the light-sensitive ion channels ChR2 and anion channelrhodopsin (ACR) was altered in a light-dependent manner. These results show that MK physiology can be modified by optogenetic approaches. This might help shed new light on the underlying mechanisms of thrombopoiesis.