Dendritische Zellen können als antigenpräsentierende Zellen sowohl immunogene als auch tolerogene Funktionen im Immunsystem wahrnehmen und werden in der Therapie von Tumorerkrankungen und Autoimmunerkrankungen eingesetzt. IL-10 gilt als Induktor tolerogener dendritischer Zellen. Diese werden in der Literatur oft als unreif bezeichnet und stehen im Gegensatz zu den reifen immunogenen dendritischen Zellen, die durch die Expression des Reifungsmarkers CD83 gekennzeichnet sind. Ausdifferenzierte dendritische Zellen exprimieren zudem das Antigen CD86, das der T-Zell-Aktivierung dient. In der vorliegenden Arbeit wurde der Einfluss von IL-10 auf den Reifungsprozess dendritischer Zellen in vitro untersucht. Zur Generierung unreifer dendritischer Zellen wurden humane Monozyten nach etabliertem Protokoll mit IL-4 und GM-CSF stimuliert. Nach anschließender IL-10-Stimulation, insbesondere in Kombination mit einem TLR-Agonisten, bildeten sich zwei exklusive Zellpopulationen: eine CD14+ Population und eine CD83+ Population. Unreife CD14-CD83- dendritische Zellen reexprimierten einerseits CD14 oder exprimierten andererseits CD83. Dabei zeigte sich, dass das kostimulierende Antigen CD86 gleichermaßen sowohl mit als auch ohne IL-10-Inkubation hoch exprimiert wurde und IL-10 folglich keinen zusätzlichen Einfluss auf dessen Expression hat. Insgesamt waren Veränderungen bezüglich der Oberflächenantigene, die bei der Betrachtung der Gesamtheit aller Zellen auffallen, auf eine quantitative Verschiebung der beiden Zellpopulationen zurückzuführen. IL-10 beeinflusst also nicht direkt einzelne kostimulierende oder inhibitorische Moleküle, sondern beeinflusst den Anteil der CD14+ Zellen gegenüber den CD83+ dendritischen Zellen. Funktionell betrachtet zeigten die CD14+ Zellen eine gesteigerte Makropinozytose im Gegensatz zu den reifen CD83+ dendritischen Zellen. Zusammenfassend führt IL-10 zu einer Reexpression von CD14 auf unreifen dendritischen Zellen und aktiviert einen alternativen Differenzierungsweg. Die CD14+ Zellen weisen einen stabilen immunregulatorischen Phänotyp auf und unterscheiden sich somit von reifen dendritischen Zellen, die nach Inkubation mit IL-10 nicht reguliert werden. Damit muss die Begrifflichkeit und Klassifikation tolerogener dendritischer Zellen weiter diskutiert werden.

Die Tumormikroumgebung (TME) spielt eine wichtige Rolle in Bezug auf das Ansprechen von Therapien, Tumorwachstum und die Bildung von Metastasen. In den letzten Jahren konnte belegt werden, dass Tyrosinkinaseinhibitoren (TKIs) Einfluss auf Zellen des TME haben und vor allem die dort vorherrschenden Zellen, Tumor-assoziierte Makrophagen (TAM), durch die TKIs moduliert werden können. Sie entsprechen meist dem M2-Phänotyp, sezernieren antiinflammatorische Zytokine und sind protumoral, indem sie u.a. die Metastasierung und das Tumorwachstum unterstützen. Zentrale Targets für die Reprogrammierung von Makrophagen stellen sowohl der NF-κB als auch die Inhibition des CSF1-Rezeptors dar. An diesen beiden Schlüsselstellen wirken u.a. TKIs. In den durchgeführten Versuchen wurden drei TKIs verwendet – Dasatinib, Src-Kinase-Inhibitor-I, Bosutinib – um die Ergebnisse von Vorarbeiten zu verifizieren und um zu untersuchen, ob ein Klasseneffekt in Bezug auf eine gesteigerte IL-12-Produktion vorliegen könnte. Ein wichtiger Ansatzpunkt in der Bekämpfung von Tumoren ist die Aktivierung von Immunzellen gegen Tumorzellen, in unserem Fall eine Modulation von TAM in Richtung M1-Makrophagen. Eine signifikante Änderung des Phänotyps konnte nicht festgestellt werden. Allerdings wurde eine gesteigerte IL-12-Produktion aller Makrophagensubtypen durch die Inkubation mit Dasatinib- bzw. Src-kinase-inhibitor-I oder Bosutinib gezeigt. IL-12 ist ein wichtiges proinflammatorisches Schlüsselzytokin des Immunsystems, indem es u.a. NK-Zellen und T-Zellen aktiviert. Die funktionellen Auswirkungen der verstärkten IL-12-Produktion in Hinblick auf NK-Zellen haben wir untersucht. Eine deutlich verstärkte Aktivierung anhand Aktvierungsmarker von NK-Zellen konnten wir nicht beweisen. Allerdings wurde eine erhöhte Zytotoxizität durch Ko-Kultivierung der NK-Zellen mit den unterschiedlichen Makrophagensubtypen und gleichzeitiger Inkubation mit Dasatinib demonstriert. Die erhöhte IL-12-Produktion von APCs sowie verringerte IL-10-Produktion und der Einfluss auf andere Immunzellen, hier am Beispiel der NK-Zellen, zeigen u.a. das therapeutische Potential der TKIs als antineoplastisch wirksame Substanz. Als alleinige Therapie ist deren Wirkungsbereich nach den hier vorliegenden Ergebnissen jedoch noch zu gering. In Kombination mit anderen Therapieoptionen stellen die TKIs allerdings ein mögliches Therapieregime dar. Der genaue Wirkmechanismus und die dadurch entstehenden Veränderungen sind noch genauer zu untersuchen. Ein weiteres Ziel ist in vitro etablierte Ergebnisse auch in die klinische Anwendung einfließen zu lassen. Der zweite Teil der Arbeit befasste sich mit einem proinflammatorischen Zytokin IL-32γ und dessen Wirkung auf Makrophagen. Wie bereits auch bei den TKIs wurde der Einfluss des Interleukins auf das Tumormikromilieu und die entsprechenden Auswirkungen untersucht. IL-32γ wirkt nicht nur selbst als proinflammatorisches Zytokin, sondern reguliert eine Vielzahl an weiteren Zytokinen. Der Einfluss von IL-32 auf das Tumormikromilieu und dessen Zellen stellt einen der zentralen Interessenspunkte dar. In unseren Versuchen konnte unter IL-32γ eine effektivere Antigenpräsentation der Makrophagen – gemessen an einer verstärkten Expression von CD80 und CD86 – gezeigt werden. Auf der anderen Seite wurde das antiinflammatorische Zytokin, IL-10, von IL-32γ-stimulierten Makrophagen ebenfalls verstärkt sezerniert. Eine Ko-Kultivierung von Makrophagen und NK-Zellen und gleichzeitige Inkubation mit IL-32γ führte bei NK-Zellen zu einer verstärkten Aktivierung sowie zu einer erhöhten Zytotoxizität. Die Auswirkungen auf NK-Zellen deuten eine antitumorale Wirkung von IL-32γ an. Das breite Wirkspektrum des Interleukins ist vielversprechend und könnte neue Therapiestrategien eröffnen, wofür allerdings weitere Versuche sowohl in vitro als auch in vivo notwendig sind, um das Interleukin und seine Wirkungen genauestens zu verstehen.

Das Medulloblastom ist der häufigste, maligne Hirntumor des Kindesalters. In den letzten Jahren ist es gelungen, molekularbiologisch definierte Subgruppen innerhalb dieser Tumorentität zu definieren, die sich durch ein unterschiedliches therapeutisches Ansprechen differenzieren lassen. Es werden vier Gruppen abgegrenzt: Tumore mit Aktivierung des WNT-Signalwegs, des SHH-Signalwegs, sowie der Gruppe 3, die sich vor allem durch eine Myc Amplifikation auszeichnen und Gruppe 4, in der MycN amplifiziert wird. Während Patienten mit SHH- und WNT-Tumoren eher eine günstige Prognose haben, ist der Bedarf an neuen Therapieansätzen für Patienten mit Gruppe 3- und Gruppe 4-Tumoren auf Grund der schlechten Prognose sehr hoch. Die aus einem malignen Pleuraerguss eines Gruppe 3-Medulloblastom Patienten gewonnenen Tumorzellen konnten erfolgreich als permanente Zelllinie etabliert sowie in vitro und in vivo charakterisiert werden. Dieses Tumormodell habe ich in meiner Dissertationsarbeit genutzt um die zytotoxische Wirkung neuer Zytostatika und Inhibitoren Kombinationen auf das Gruppe 3-Medulloblastom in vitro und im Tiermodell zu untersuchen. Bei der Auswahl neuer Therapieansätze galt die Maßgabe, Substanzen zu wählen, die für den klinischen Einsatz geeignet sind, neue gezielte zytostatische Mechanismen aufweisen und bei denen bereits publizierte Vorarbeiten nahelegen, dass diese das ZNS tatsächlich erreichen. In unserem in vitro Modell testeten wir 23 Substanzen und wählten dann die fünf vielversprechendsten für das subkutane Tumormausmodell aus. Als Vergleichsgruppen für das Therapieansprechen wählten wir die Kombination aus Cisplatin und Etoposid, die gerade bei den Patienten mit einem HochrisikoMedulloblastom die Therapie der Wahl ist. Im ersten Tierversuch konnte gezeigt werden, dass Gemcitabin als Monotherapie den gleichen zytotoxischen Therapieeffekt zeigt, wie Cisplatin und Etoposid in Kombination. Deshalb war nun das Ziel eine Substanz zu finden, welche dann in Kombination mit Gemcitabin einen besseres Therapieansprechen als die Standardtherapie zeigt. Bei der Tumorpräparation im initialen Tierversuch fiel auf, dass die Tumoren stark vaskularisiert sind. Nach dieser Beobachtung stellten wir uns die Fragen, ob die Inhibition des Vaskularisierungsvorgangs im Tumor einen additiven zytotoxischen Effekt auf das Tumorwachstum hat. Daraufhin erweiterten wir die Suche nach geeigneten Substanzen für das Gruppe 3-Medulloblastom um Multikinaseinhibitoren, die auch VEGF-Rezeptoren inhibieren. Überraschenderweise konnten wir zeigen das Gemcitabin in Kombination mit verschiedenen VEGF-Rezeptor-Inhibitoren in den Toxizitätsversuchen in vitro eine 10.000 fach niedrigere EC50 hat als die Kombination aus Cisplatin und Etoposid. Auch in den anschließenden Tierversuchen konnten wir zeigen, dass Gemcitabin in Kombination mit Axitinib einen besseren Therapieerfolg bezogen auf das Tumorwachstum zeigt, als die bisherige Standardtherapie. Darüber hinaus verloren die Tiere, die mit Gemcitabin und Axitinib behandelt wurden deutlich weniger an Gewicht, als die Tiere die die Standardtherapie erhielten. Zusammenfassend können wir zeigen, dass Axitinib, ein neuer pan-VEGF-Rezeptor-Inhibitor der bisher nur in anderen Tumorentitäten wie dem Nierenzellkarzinom zum Einsatz kommt, in Kombination mit Gemcitabin, einem Nukleosidanalogon, einen deutlichen zytotoxischen Effekt an Medulloblastom Zelllinien in vitro als auch im subkutanen und orthotopen Tiermodell hat. Diese Ergebnisse könnten die Basis sein für neue therapeutische Strategien gegen das Gruppe 3-Medulloblastom bei Kindern, die die bisherige Therapie nicht mehr tolerieren oder bereits irreversible Nebenwirkungen der Standardtherapie entwickelt haben