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Nach einem Myokardinfarkt setzen Wundheilungsprozesse ein, um die Durchblutung wieder herzustellen und nekrotisches Muskelgewebe durch Narbengewebe zu ersetzen. Die Einsprossung neuer Kapillaren vom bestehenden Gefäßnetz aus wird als Angiogenese bezeichnet. Das dabei vermehrt exprimierte proteolytische Enzym Aminopeptidase N (APN) spielt eine entscheidende Rolle bei der Einsprossung von Endothelzellen. Beim kardialen Remodeling werden abgestorbene Myozyten mithilfe der Einwanderung von Fibroblasten durch Binde- oder Stützgewebe ersetzt, dabei übernimmt das Fibroblasten-Aktivierungs-Protein alpha (FAP) Aufgaben bei der Proliferation und Fortbewegung von Fibroblasten.
Durch ihre erhöhte Expression bei den Wundheilungs- und Remodelingprozessen nach einem Herzinfarkt stellen die Metalloprotease APN und die Serinprotease FAP molekulare Targets für die Diagnostik und Therapie dar. Als Diagnosemethode besonders geeignet ist die Positronen-Emissions-Tomographie (PET), die es ermöglicht, biochemische Prozesse in Echtzeit im zu untersuchenden Organismus zu visualisieren und zu quantifizieren. Eine als Radiopharmakon oder Tracer bezeichnete biochemische Sonde kann im Falle eines Enzyms dessen radioaktiv markiertes Substrat oder ein Inhibitor sein.
Ziel dieser Arbeit war es, spezifische APN- und FAP-affine Tracer für die nicht-invasive Untersuchung der APN- und FAP-Expression mittels PET zu entwickeln und dadurch die Rolle von APN und FAP bei Remodelingprozessen nach Myokardinfarkt besser verstehen bzw. klären zu können.
Um die Protease APN mittels PET zu untersuchen, wurden die für APN affine Verbindung NOTA-NGR (Komplexbildner + cyclisches Peptid inkl. Asparagin-Glycin-Arginin) mit dem Positronen-emittierenden Nuklid Gallium-68 (68Ga) markiert. Das Potential von 68Ga-NOTA-NGR als PET-Tracer wurde in vivo am Infarktmodell mittels Kleintier-PET untersucht und mit 68Ga-NOTA-RGD, einem zur Visualisierung des neo-angiogenetischen alphavbeta3-Integrins etablierten Tracer, verglichen. Untersuchungen ergaben, dass 68Ga-NOTA-NGR einen vielversprechenden neuen PET-Tracer für die Visualisierung und Quantifizierung der APN-Expression im Rahmen der Angiogenese nach einem Myokardinfarkt darstellt. 68Ga-NOTA-NGR zeigte eine erhöhte Aufnahme im Bereich des Myokardinfarkts im Sinne einer vermehrten Angiogenese. Die Aufnahme des Tracers in infarzierten Arealen war quantitativ höher als in der Untersuchung mit 68Ga-NOTA-RGD. In Autoradiographie-Experimenten wurde 68Ga-NOTA-NGR ex vivo untersucht. Die Akkumulation von 68Ga-NOTA-NGR im ischämischen Bereich war deutlich höher als im gesunden Myokard. Der Nachweis der unterschiedlichen Bereiche des Herzens erfolgte mit HE-Färbung.
Die Expression von APN wurde immunohistochemisch mittels spezifischer Antikörper bestätigt. Zum Vergleich wurden ebenso einige andere an der Angiogenese beteiligte Faktoren untersucht. APN stellte sich auch hier als geeignetes Target zum Nachweis der Angiogenese heraus.
Um die Protease FAP mittels PET zu untersuchen, wurden eine Reihe peptidomimetischer Inhibitoren, die die Erkennungssequenz Glycin-Prolin mit einer Carbonitril-Gruppe als elektrophiler Einheit zur kovalent-reversiblen Hemmung des Enzyms enthalten, entwickelt. Ausgehend vom N-Acetylglycin-pyrrolidin-(2S)-carbonitril als Leitstruktur wurden Inhibitoren und Vorstufen zur Radiomarkierung inkl. verschieden substituierter Benzoesäuren dargestellt. Zusätzlich wurden noch bereits bekannte Inhibitoren synthetisiert, die zum Vergleich in den Enzymassays dienten.
Drei Verbindungen zeigten gute inhibitorische Wirkung an FAP und außerdem Selektivität gegenüber DPP IV. Keine der entwickelten Verbindungen zeigte einen KI-Wert im nanomolaren Bereich, erforderlich für einen potentiellen Tracer zur in-vivo-Visualisierung einer Enzymexpression mittels PET.
Um die Inhibitoren mit der besten Hemmung an FAP zum PET-Tracer weiterzuentwickeln, mussten sie mit einem Positronenemitter markiert werden. Die Markierung erfolgte über Isotopenaustausch, bei dem nicht-radioaktives Iod am aromatischen Ring des Precursors durch das radioaktive Iod-124 (124I) substituiert wurde. Es konnten dadurch die radioiodierten Verbindungen 1-(2-[124I]Iodhippursäure)-pyrrolidin-(2S)-carbonitril und 1-(4-[124I]Iod-hippursäure)-pyrrolidin-(2S)-carbonitril synthetisiert werden.
Trotz der relativ niedrigen Affinität für FAP wurde das neue 1-(2-[124I]Iodhippursäure)-pyrrolidin-(2S)-carbonitril in Ratten am Infarktmodell mittels Kleintier-PET getestet. Die Lage der ischämischen Zone wurde im Anschluss durch HE-Färbung bestimmt. In vivo zeigte sich eine nur sehr geringe Aufnahme des Radiopharmakons in der ischämischen Zone des Myokards. Damit ist 1-(2-[124I]Iod-hippursäure)-pyrrolidin-(2S)-carbonitril kein für den gewünschten Zweck geeigneter PET-Tracer. Nichtsdestotrotz war der Ansatz vielversprechend und es wurde zum ersten Mal ein PET-Tracer dieser Art zur Untersuchung des FAP im Myokardinfarkt hergestellt.
Schimmelpilze können in Abhängigkeit des Immunstatus und der Vorerkrankungen betroffener Patienten unterschiedliche Krankheitsbilder wie Hypersensitivitäts-erkrankungen oder lebensbedrohliche invasive Infektionen hervorrufen. Da die Diagnosestellung dieser Erkrankungen mitunter komplex und insensitiv ist, sollten im Rahmen dieser Arbeit unterschiedliche Ansätze neuer diagnostischer Assays untersucht werden.
In den letzten Jahren wurden Assays entwickelt, die auf Basis durchflusszytometrisch quantifizierter Pilz-spezifischer T-Zellen aus peripherem Blut einen supportiven Biomarker zur Diagnostik invasiver Mykosen liefern könnten. Da die hierfür isolierten T-Zellen anfällig gegenüber präanalytischer Lagerzeiten und immunsuppressiver Medikation sind, wurden hier Protokolloptimierungen vorgenommen, um anhand eines Vollblut-basierten Assays mit zusätzlicher CD49d-Kostimulation diesen Limitationen entgegen zu wirken. In einer Studie an gesunden Probanden konnte dabei gezeigt werden, dass die Kombination der Durchflusszytometrie mit ausgewählten Zytokin-Messungen (IL-5, IL-10 und IL-17) zu einer verbesserten Erkennung vermehrt Schimmelpilz-exponierter Personen beitragen könnte. Neben Infektionen könnten dabei im umwelt- und arbeitsmedizinischen Kontext Polarisationen der T-Zell-Populationen detektiert werden, welche mit Sensibilisierungen und Hypersensitivität assoziiert werden.
Zusätzlich wurde ein in vitro Transwell® Alveolarmodell zur Simulation pulmonaler Pilzinfektionen für Erreger der Ordnung Mucorales adaptiert, durch Reproduktion wichtiger Merkmale der Pathogenese von Mucormykosen validiert, und für Untersuchungen der Immunpathologie und Erreger-Invasion verwendet. Das Modell wurde anschließend zur in vitro Evaluation von radioaktiv markiertem Amphotericin B mit 99mTc oder 68Ga als nuklearmedizinischen Tracer verwendet. Die untersuchten Schimmelpilze zeigten dabei eine zeit- und dosis-abhängige Aufnahme der Tracer, während bakteriell infizierte Proben nicht detektiert wurden. Die erhobenen Daten dokumentieren ein vielversprechendes Potenzial von Amphotericin B-basierten Tracer, das in zukünftigen in vivo Studien weiter evaluiert werden sollte.
Die präklinische Forschung stellt den ersten wichtigen Meilenstein in der Klärung und Untersuchung klinisch-relevanter Erkrankungen dar. Darüber hinaus unterstützt die präklinische Forschung erheblich die Entwicklung von Therapien. Die Kleintier-Positronenemissionstomographie (µ-PET) spielt dabei eine wichtige Rolle, da sie in der Lage ist, funktionelle, physiologische und biochemische Prozesse in vivo darzustellen und zu quantifizieren. Trotz diverser etablierter PET-Datenauswertungs-Programme bleibt die Analyse von in vivo akquirierten Bilddaten aufgrund der Vielzahl an medizinischen Fragestellungen, der Komplexität der Krankheitsbilder, sowie der Etablierung neuer Radiotracer weiterhin eine große Herausforderung in der Medizin. Ziel dieser Doktorarbeit ist es daher, ein geeignetes, brauchbares Auswertungstool für eine einfache und effiziente Analyse von akquirierten µ-PET-Daten zu entwickeln und zu etablieren, welches das Spektrum bereits vorhandener Programme erweitert. Das entwickelte nuklearmedizinische Datenverarbeitungs-Analyseprogramm (engl. nuclear medicine data processing analysis tool, NU_DPA) wurde in Matlab implementiert und anhand dreier präklinischer Versuchs- bzw. Testreihen erprobt und etabliert. Bei den Datenreihen handelt es sich um µ-PET-Datensätze verschiedener Schlaganfall-Rattenhirnmodelle unter Verwendung folgender Radiotracer. Zum einen die im Gehirn homogen akkumulierende 2-[18F]Fluor-2-desoxy-glukose ([18F]FDG) zum anderen das spezifisch an P-Selektin anreichernde [68Ga]Fucoidan.
Das NU_DPA umfasst die automatische Selektion des Zielvolumens (volume-of-interest, VOI) aus dem vollständigen PET-Bild und die anschließende Ausrichtung des VOI mit Hilfe eines PET-Templates (gemittelter PET-Datensatz). Dieses PET Template wird aus den eigenen akquirierten PET-Daten erstellt. Durch das Einbinden eines geeigneten anatomischen MRT-Atlas‘ (anpassbar) können die ausgerichteten PET-Daten einzelnen, Atlas-spezifischen Teilregionen zugeordnet werden. Eine solche Subklassifikation des VOI erlaubt eine genauere Betrachtung und Auswertung der Radiotracer-Akkumulation.
Des Weiteren bietet NU_DPA die Möglichkeit einer semiquantitativen Auswertung der PET-Bilddaten anhand von drei unterschiedlichen Parametern, der normalisierten Aktivität, dem Standardized Uptake Value und der Uptake Ratio. Durch die Matlab-integrierten Statistik-Algorithmen ist zusätzlich eine Möglichkeit der statistischen Auswertung der zuvor berechneten Parameter gegeben. Das NU_DPA-Programm stellt somit ein semi-automatisiertes Datenauswertungs-Programm dar, das sowohl die Registrierung als auch die semiquantitative Auswertung von PET-Bilddaten innerhalb einer Versuchsreihe ermöglicht und bereits erfolgreich für die Radiotracer [18F]FDG und [68Ga]Fucoidan in Tiermodellen getestet wurde. Nach derzeitigem Kenntnisstand ist kein Datenauswertungs-Programm bekannt, das PET-Bilddaten unter Verwendung des hinzugefügten Atlas‘ semi-automatisiert analysieren kann und potenziell für homogene und Target-spezifisch akkumulierende Radiotracer geeignet ist.