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Trotz hochmoderner Technologien und ausgefeilter therapeutischer und rekonstruktiver chirurgischer Heilungsmethoden beträgt die 5-Jahres Überlebensrate bei der Diagnose PECA der Mundhöhle im Durchschnitt auch im Jahre 2017 nur 55 % und die Heilungsmethoden haben sich in den letzten drei Jahrzehnten kaum verbessert. Umso wichtiger ist es deshalb, die Forschung voranzutreiben und ein aussagekräftiges Tumormodell zu etablieren, das bei der Entwicklung neuer Therapieansätze schnell und sicher gute Ergebnisse liefert.
In dieser Studie soll mit Hilfe des Tissue Engineering (TE) ein in gesunder Mundschleimhaut (MSH) integriertes 3D-Tumormodell generiert werden, welches bestmöglich die Analyse pathologischer Mechanismen im Tumorzentrum, sowie im Randbereich von gesundem und erkranktem Gewebe, und auch die Analyse der Auswirkungen neuartiger Chemotherapeutika auf gesunde und maligne Zellen in direkter Nachbarschaft ermöglicht – ohne Tierversuche. In der Konsequenz könnte ein erheblicher Fortschritt mit höheren Erfolgsaussichten der Therapieansätze erzielt werden.
Es wird ein Tumormodell generiert, in dem auf Basis eines gesunden MSH-Modells Tumorzellen eingebracht werden, um - genauso, wie die Tumorentstehung in vivo von statten gehen würde – Tumorentstehung und Tumorwachstum in der Umgebung von gesunder MSH analysieren zu können. Das Modell basiert dabei auf einer Matrix aus dezellularisierter, porciner, small-intestinal-submucosa (SIS/MUC), die mit primären Fibroblasten, primären Keratinozyten und Tumorzellen der Tumorzelllinie FaDu besiedelt wird. Eine Besonderheit der FaDu-Zellen ist die vorangegangene Transduktion mit dem Lentivirus RFP – um die eingewanderten Zellen von gesunden Zellen unterscheiden zu können. Der Vorgang der Transduktion war gelungen und es konnte eine Fluoreszenz der noch in Zellkulturschalen kultivierten Zellen erzielt werden. Allerdings waren die fluoreszierenden Zellen in den fixierten Schnitten nicht mehr nachweisbar.
Zur Generierung eines Tumormodelles wurden auf Basis eines OMÄ drei unterschiedliche Applikationsformen zur Integration von Tumorzellen getestet. Die Integration von Tumorzellen fand in Form von Spots, Sphäroiden oder Tumorzellgemischen (prim. Keratinozyten/FaDu-Zellen) in zuvor kultivierte gesunde OMÄ statt. Dabei sollte das Applizieren von Spots oder Sphäroiden das Tumorzellwachstum auch in der Umgebung von gesundem Gewebe initiieren. Dies würde die Möglichkeit schaffen, auch in vitro, gesundes neben pathologischem Gewebe und den Übergang dazu genau analysieren zu können.
Es sollen sowohl die optimale Konzentration der Tumorzellen, welche für die Entstehung von Tumoren nötig ist, als auch die geeignetste Applikationsmethode eruiert werden, um optimale Tumormodelle zuverlässig reproduzierbar ansetzen zu können. Die Modelle wurden histologisch und immunhistochemisch analysiert und die Ergebnisse mit ermittelten TEER-Werte in Korrelation gesetzt.
In dieser Arbeit konnte mit der Applikation von Spots oder Sphäroiden kein suffizientes Tumorwachstum in Umgebung von gesunder MSH erzielt werden. Die Zellen lagen ohne Reaktion des angrenzenden Stratum corneums auf der zu stark ausgeprägten Hornschicht der OMÄ auf und es war keine Einwanderung in das darunterliegende Gewebe möglich.
Allerdings ist es gelungen, durch Applikation eines Zellgemisches variierender Mischungsverhältnisse von primären Keratinozyten und Tumorzellen der Zelllinie FaDu ein 3D-Tumorwachstum unterschiedlicher Malignitätsstufen zu initiieren. Je kleiner das Mischungsverhältnis und je höher in der Konsequenz die Anzahl der FaDu-Tumorzellen, desto ausgeprägter waren die morphologischen Anzeichen einer Tumorbildung. Abhängig vom Mischungsverhältnis war dabei die Ausprägung des Tumors. Auch wenn dadurch keine Kombination von gesundem und pathologischem Gewebe in einem Modell mehr imitiert werden konnte, so konnten zumindest nach histologischen und immunhistochemischen Untersuchungen eindeutige pathologische, maligne Tumormodelle generiert werden. Die Tumormodelle zeigten durchgehend Zell- und Kernpleomorphismen, atypische und vermehrte suprabasale Mitosen, eine Störung der normalen Gewebearchitektur, die Ausbildung von Interzellularbrücken, Einzelzelldyskeratosen und Verhornungsknospen, sowie Stellen der Durchbrechung der Basalmembran und Invasion von Tumorzellen in die darunterliegende Lamina propria. All das sind eindeutige Kennzeichen malignen Wachstums
Auch die Ergebnisse der TEER-Wert Messung stimmten mit den morphologischen Entwicklungen der Modelle überein. So stiegen die TEER-Werte der Kontrollmodelle konsequent an, was für eine deutliche Entwicklung von kontinuierlichem Gewebe spricht und im Gegensatz dazu fielen die TEER-Werte im zeitlichen Verlauf der Tumormodelle, bei denen die Basalmembran und somit die Kontinuität des Gewebes durchbrochen wurde rapide ab, bzw. lagen im konstant niedrigen Bereich.
Der Erfolg der Etablierung dieses zuverlässig rekonstruierbaren 3D, in vitro generierten Tumormodells, das der in vivo Situation eines Plattenepithelkarzinoms sehr nahekommt, bietet der Wissenschaft eine sehr gute Möglichkeit, weitere Studien zum Tumorwachstum durchzuführen. Außerdem kann die Weiterentwicklung und Verbesserung vielversprechender, neuartiger chemotherapeutischer und radiologischer Therapieverfahren erheblich voran¬getrieben und dadurch die Heilungschancen mit geringeren Nebenwirkungen für den Patienten verbessert und eine erhöhte Lebensqualität erzielt werden.
Bei der zystischen Fibrose (CF) sowie der primären Ziliendyskinesie (PCD) handelt es sich um zwei seltene Erkrankungen, die unter anderem den mukoziliären Transport beeinträchtigen. CF gehört hierbei zu den am häufigsten vorkommenden angeborenen Stoffwechselerkrankungen, wobei Betroffene unter einem Defekt des Cystic Fibrosis Transmembrane Conductor Regulator (CFTR)-Gens leiden, der durch die Produktion von hochviskosem Sekret in muzinproduzierenden Organen, wie dem gastrointestinalen Trakt und der Lunge, gekennzeichnet ist. Patienten, die an PCD leiden, weisen Defekte in, zum jetzigen Zeitpunkt, ca. 38 bekannten und PCD-assoziierten Genen auf, die in strukturellen Defekten des ziliären Apparats und somit in dysfunktionalen Kinozilien resultieren. Da aktuell weder für die CF noch für die PCD eine Heilung möglich ist, steht bei der Therapie vor allem die Linderung der Symptome im Fokus. Grundlegendes Ziel ist der langfristige Erhalt der Lungenfunktion sowie die Prävention bakterieller Infekte. Als bisherige Modellsysteme zur Erforschung möglicher Therapeutika gelten Tiermodelle, die den humanen Phänotyp aufgrund von Speziesdiversität nicht vollständig abbilden können. Als vielversprechende Testsysteme für die zystische Fibrose gelten humane intestinale Organoidkulturen. Nachdem allerdings vorwiegend respiratorische Symptome für die Mortalität der Patienten verantwortlich sind, stellen CF-Atemwegsmodelle bessere Testsysteme für zukünftige Therapeutika dar. Atmungsorganoidkulturen wurden verwendet, um die CFTR-Funktionalität zu untersuchen, repräsentieren aber nicht vollständig die in vivo Situation. Deshalb werden zur Entwicklung neuer Therapiestrategien patientenspezifische 3D in vitro Testsysteme der humanen Atemwege benötigt, die insbesondere im Hinblick auf personalisierte Medizin ihren Einsatz finden. In der vorliegenden Arbeit wurde eine für den Lehrstuhl neue Methode zur Zellgewinnung aus nasalen Schleimhautabstrichen etabliert, die eine standardisierte Versorgung mit humanem Primärmaterial garantiert. Zur Generierung einer krankheitsspezifischen Zelllinie, wie beispielsweise einer PCD-Zelllinie mit Hilfe des CRISPR/Cas9-Systems, ist eine Atemwegszelllinie erforderlich, die die in vivo Situation vollständig repräsentiert. So wurden vier verschiedene respiratorische Epithelzelllinien (HBEC3-KT, Calu-3, VA10 und Cl-huAEC) auf ihren mukoziliären Phänotyp hin untersucht, wobei lediglich die Zelllinie HBEC3-KT in zilientragende Zellen differenzierte. Diese zeigten jedoch nur auf ca. 5 % der Modelloberfläche Kinozilien, wodurch die humane respiratorische Mukosa nicht komplett abgebildet werden konnte und die HBEC3-KT-Zelllinie keine geeignete Zelllinie zur Generierung einer PCD-Zelllinie darstellte. Mit Hilfe des Tissue Engineering war es möglich, 3D in vitro Testsysteme basierend auf zwei unterschiedlichen Matrices, der biologischen SIS (small intestinal submucosa) und der synthetischen Polyethylenterephthalat (PET)-Membran, aufzubauen. Es wurden 3D Atemwegstestsysteme mit humanen primären nasalen und tracheobronchialen Epithelzellen generiert. Ergänzend zu histologischen Untersuchungen und zur Charakterisierung spezifischer Marker des respiratorischen Systems mittels Immunfluoreszenz, wurde die Ultrastruktur der Modelle, mit speziellem Fokus auf ziliäre Strukturen, analysiert. Um Rückschlüsse auf die ziliäre Funktionalität ziehen zu können und somit eine hohe in vivo Korrelation zu bestätigen, wurde im Rahmen dieser Arbeit am Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin die Methode der Hochgeschwindigkeitsvideomikroskopie etabliert, welche die Analyse der Zilienschlagfrequenz sowie des mukoziliären Transports ermöglicht. Ebenfalls wurde der Einfluss von isotoner Kochsalzlösung und des � 2-adrenergen Agonisten Salbutamol, das vor allem als Bronchodilatator bei Asthmapatienten eingesetzt wird, auf die Zilienschlagfrequenz analysiert. Es konnte gezeigt werden, dass beide Substanzen den Zilienschlag im Atemwegsmodell erhöhen. Zur Generierung der Testsysteme der beiden seltenen Erkrankungen CF und PCD wurden Epithelzellen der betroffenen Patienten zunächst mittels nicht-invasiver Raman-Spektroskopie auf einen potentiellen Biomarker untersucht, welcher Einsatz in der Diagnostik der beiden Krankheiten finden könnte. Es konnte jedoch weder für die CF noch für die PCD ein Biomarker aufgedeckt werden. Jedoch zeigten PCD-Zellen eine geringe Auftrennung gegenüber nicht-PCD Zellen. Anschließend wurden 3D-Atemwegstestsysteme basierend auf Patientenzellen aufgebaut. Der Phänotyp der CF-Modelle wurde mittels immunhistologischer Färbung und der Analyse des gestörten mukoziliären Transports verifiziert. Strukturelle ziliäre Defekte konnten durch die ultrastrukturelle Analyse von Zilienquerschnitten in drei donorspezifischen PCD-Modellen identifiziert werden. Darüber hinaus konnte die ziliäre Funktionalität mit Hilfe der Hochgeschwindigkeitsvideomikroskopie nicht nachgewiesen werden. Zusammenfassend ist es in dieser Arbeit gelungen, eine neue Methode zur vollständigen Charakterisierung von 3D-Atemwegstestsystemen zu etablieren, die die Analyse der Zilienschlagfrequenz sowie des mukoziliären Transports ermöglicht. Es konnte erstmalig gezeigt werden, dass mit Hilfe des Tissue Engineering ein personalisiertes Krankheitsmodell für die PCD auf Segmenten eines dezellularisierten porzinen Jejunums generiert werden kann, das zukünftig ein Testsystem für potentielle Therapeutika darstellen kann.
Gegenstand dieser Arbeit war die Etablierung eines dreidimensionalen in vitro Tumormodells, welches ein orales in vivo Plattenepithelkarzinom nachbilden sollte. Dabei standen Aufbau, Reproduzierbarkeit und Reliabilität an vorderster Stelle. Als Zellquelle sollten sowohl Tumorzellen aus den Zelllinien FaDu, HLaC79 und HLaC79 Clone 1 als auch primäre Zellen aus karzinogenem Primärgewebe dienen. Als Referenz wurden dabei stets Modelle aus primär isolierten Zellen herangezogen, die ein Äquivalent zur gesunden Mundschleimhaut bildeten. Während der Isolationsvorgang von pathologischen Zellen primärer Plattenepithelkarzinomen aus der Mundhöhle und dem Pharynx aufgrund zahlreicher Kontaminationen und Stagnationen des Zellwachstums keinen Erfolg erzielte und der Versuch eingestellt wurde, war es mit den Tumorzelllinien FaDu und HLaC79 möglich, dreidimensionale in vitro Tumormodelle herzustellen. Ihre Malignität wurde durch die besonderen histologischen Architekturstörungen wie die geringere Epitheldicke, das Fehlen einer Parakeratinisierung im Stratum corneum und die Invasion von Tumorzellen in die Submukosa verdeutlicht. Um einen eindeutigen Vergleich zu den Mukosaäquivalenten zu ziehen, fand eine Immunhistochemie mit unterschiedlichen Markern statt, die vor allem den gestörten Epithelaufbau des Tumormodells verdeutlichte. Als Maß für die Zell-Zell-Kontakte, die im Laufe der Kultivierung entstanden, diente der transepitheliale elektrische Widerstand. Die Behandlung der Tumorzellen und Tumormodelle mit dem klinisch bewährten Zytostatikum Paclitaxel und dem neuen Polyether-Antibiotikum Salinomycin erzielte vor allem in der zweidimensionalen Kultivierung große Erfolge. Hier wurde verdeutlicht, dass Paclitaxel toxisch auf die HLaC79 Tumorzellen wirkt, während die paclitaxelresistenten HLaC79 Clone 1 Tumorzellen immun gegen dieses Medikament sind. Salinomycin hingegen sorgte für eine Verringerung der Zellviabilität bei beiden Zelllinien. Die histologischen Untersuchungen nach der 24-stündigen Medikamentenapplikation mit Paclitaxel bei den Tumormodellen zeigten keine signifikanten Unterschiede, während der transepitheliale elektrische Widerstand stieg und auf eine verstärkte Barriere nach Paclitaxelgabe schließen ließ.
Bisherige per Tissue Engineering hergestellte Testsysteme der Mundschleimhaut basieren in der Regel auf allogenen und teils dysplastischen Keratinozyten. Dies schmälert die Aussagekraft der gewonnenen Ergebnisse hinsichtlich des Anspruchs, Nativgewebe bestmöglich nachzubilden.
In der vorliegenden Arbeit sollte daher ein am Lehrstuhl für Tissue Engineering und Regenerative Medizin entwickeltes Protokoll zur Herstellung dreidimensionaler epidermaler Oralmukosaäquivalente auf Basis autologer Keratinozyten auf seine Eigenschaften und Einsatzmöglichkeit als in-vitro Testsystem untersucht werden.
Nach erfolgreicher Isolierung und Kultivierung im Monolayer konnten insgesamt 420 Modelle zu drei verschiedenen Zeitpunkten (Passagen) aufgebaut werden. Die Untersuchung von Histologie, Viabilität und Barrierefunktion mittels MTT, TEER und Natriumfluoresceinpermeabilität konnte einen suffizienten Aufbau von verhorntem, mehrschichtigen oralen Plattenepithel nachweisen. Gleichzeitig konnte eine Abnahme der Epithelqualität mit steigendem Keratinozytenalter festgestellt werden.
Eine sich anschließende Untersuchung von 14 Cytokeratinen sowie Apoptosemarkern per effizienzkorrigierter und normalisierter RT-qPCR konnte die Überlegenheit der dreidimensionalen autologen Oralmukosaäquivalente gegenüber der zweidimensionalen Monolayerkultur auf Genebene zeigen.