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Die Multiple Sklerose (MS) und ihr Tiermodell, die Experimentelle Autoimmune Enzephalomyelitis (EAE), sind Autoimmunerkrankungen des Zentralen Nervensystems (ZNS). Neben myelinspezifischen CD4+ T-Zellen tragen auch CD8+ T-Zellen zur Pathogenese dieser Erkrankungen bei. Allerdings ist die Rolle der CD8+ T-Zellen während der Induktionsphase der Erkrankung außerhalb des ZNS noch unklar. In dieser Arbeit wurde daher der Beitrag der CD8+ T-Zellen in der EAE der Lewis-Ratte näher untersucht.
Dazu wurde die Krankheitsaktivität der aktiven EAE in normalen Lewis-Ratten mit Tieren verglichen, in denen die CD8+ T-Zellen durch CD8-spezifische monoklonale Antikörper depletiert wurden. Die CD8-depletierten Tiere zeigten dabei eine verminderte Krankheitsaktivität im Vergleich zu den Kontrolltieren. Ebenso entwickelten CD8 knockout Ratten, die durch die Abwesenheit funktionsfähiger CD8+ T-Zellen gekennzeichnet sind, deutlich reduzierte Krankheitssymptome im Vergleich zu wildtypischen Tieren. Die reduzierte Krankheitsaktivität in den CD8-defizienten Tieren war von einer verminderten Infiltration von T-Zellen und Makrophagen in das ZNS begleitet. Zwar konnten aktivierte gpMBP-spezifische CD4+ T-Zellen in den drainierenden Lymphknoten von CD8-depletierten Ratten detektiert werden, diese produzierten jedoch in deutlich reduziertem Umfang pro-inflammatorische Zytokine wie beispielsweise Interferon-. Offensichtlich können in der aktiven EAE myelinspezifische CD4+ T-Zellen in Abwesenheit von CD8+ T-Zellen nicht vollständig zu Effektorzellen differenzieren und infolgedessen das ZNS nicht infiltrieren. Umgekehrt konnten nach adoptivem Transfer von voll ausdifferenzierten enzephalitogenen CD4+ Effektorzellen sowohl in normalen als auch CD8-defizienten Empfängertieren gleich starke Symptome einer AT-EAE beobachtet werden. Die Entfaltung des pathogenen Potentials voll ausgereifter CD4+ Effektorzellen scheint somit nicht von der Präsenz von CD8+ T-Zellen abzuhängen.
Mit Hilfe eines Ratten-IFN- ELISpots gelang erstmals die Detektion Interferon--produzierender gpMBP-spezifischer CD8+ T-Zellen in Tieren, die zuvor mit gpMBP immunisiert wurden. Zum direkten Nachweis von gpMBP-spezifischen CD8+ T-Zellen wurden RT1.Al-Ig Dimere generiert und mit verschiedenen gpMBP-Peptiden beladen. Tatsächlich konnten in den drainierenden Lymphknotenzellen von Ratten, die zuvor mit gpMBP in CFA immunisiert wurden, CD8+ T-Zellen detektiert werden, die gpMBP125-133-beladene RT1.Al-Ig Dimere erkennen.
Die Ergebnisse dieser Arbeit legen insgesamt den Schluss nahe, dass bei der EAE der Lewis-Ratte Interferon--produzierende CD8+ T-Zellen in der Peripherie mit myelinspezifischen CD4+ T-Zellen interagieren und damit deren Differenzierung zu ZNS-infiltrierenden Effektorzellen ermöglichen.
Genome-wide association studies revealed CLEC16A as a candidate gene for Type 1 Diabetes and multiple other autoimmune disorders. The function of CLEC16A remains unknown. However, previous work showed that the CLEC16A ortholog ema and the murine Clec16a were both implicated in autophagy, a process partially required for MHC class II loading and antigen presentation. Furthermore, studies could show that autophagy was required in thymic epithelial cells for antigen presentation during T cell selection, suggesting a possible role of CLEC16A in T cell selection in the thymus. Additionally, it was postulated that CLEC16A may function as an expression quantitative trait locus for its neighboring genes and that Clec16a KD was involved in pancreatic islet function and impaired insulin secretion and glucose homeostasis. Prior to this work, Schuster et al. had created a Clec16a KD NOD mouse, which was protected from spontaneous autoimmune diabetes.
For this work it was hypothesized that CLEC16A variation serves as a Type 1 Diabetes risk gene by affecting autophagy in thymic epithelial cells, which modulates antigen presentation and shapes the T cell repertoire. To expand and complement previous findings by Schuster et al., this thesis aimed to investigate how CLEC16A modifies the function of thymic epithelial cells. For this purpose, CLEC16A KD was induced in human cells via RNA interference and autophagy was studied through immunoblotting. Additionally, inflammation of pancreatic tissue in Clec16a KD NOD mice was scored using H.E. stained pancreatic sections. Thymic transplantation experiments were conducted to test whether the effects of Clec16a KD were T cell intrinsic. Also, intraperitoneal glucose tolerance tests were performed to study glucose homeostasis in Clec16a KD NOD animals. Finally, using qPCR, gene expression levels of neighboring genes such as Dexi and Socs1 were measured to study Clec16a as an expression quantitative trait locus.
In combination with the findings of Schuster et al., this thesis demonstrates that Clec16a KD reduces the severity of insulitis and protects from onset of spontaneous diabetes in the NOD mouse. Disease protection is conveyed by impaired autophagy in TEC, which leads to altered T cell selection and hyporeactive CD4+ T cells. The effects of Clec16a KD in the NOD mouse are thymus intrinsic. Glucose homeostasis remains unchanged in the Clec16a KD NOD mouse and plays no role in disease protection. Clec16a and Dexi presented similar expression levels, but further studies are required to investigate a clear link between these two genes. Finally, impaired autophagy could be replicated in human CLEC16A KD cells, which demonstrates a conserved function of CLEC16A and suggests a possible link between CLEC16A variation and risk of autoimmune disease in human.
Human Vγ9Vδ2 T cells are the main γδ T cell subset in the circulation, accounting for up to 5% of the total peripheral blood lymphocyte population. They have been suggested to be important in response to tumors and infections. Their immune mechanisms encompass cell killing via cytotoxicity and secretion of pro-inflammatory cytokines such as IFNγ and tumor necrosis factor (TNF). The main stimulators of Vγ9Vδ2 T cells are isopentenyl pyrophosphate (IPP) and (E)-4-hydroxy-3-methyl-but-2-enyl pyrophosphate (HMBPP), denominated phosphoantigens (PAg).
A major advance in the understanding of PAg detection and Vγ9Vδ2 T cell activation has been the identification of the butyrophlin 3A (BTN3A) proteins as key mediators in these processes. In humans, three isoforms constitute the BTN3A family: BTN3A1, BTN3A2, and BTN3A3; and their genes are localized on the short arm of chromosome 6. The role of BTN3A1 has been highlighted by BTN3A-specific monoclonal antibody 20.1 (mAb 20.1), which has an agonist effect and causes proliferation, expansion, and activation of primary human Vγ9Vδ2 T cells. On the other hand, BTN3A-specific monoclonal antibody 103.2 (mAb 103.2) is antagonistic, inhibiting the Vγ9Vδ2 T cell response. The actual mechanism underlying both PAg- and mAb 20.1-mediated activation is not completely elucidated, but the importance of BTN3A1 is clear.
The main objective of this dissertation was to characterize the role of BTN3A1 in the PAg-dependent and PAg-independent Vγ9Vδ2 T cell activation and to evaluate its contribution in the response to influeza A virus infected cells. This research work demonstrated, by using Vγ9Vδ2 TCR MOP-transduced murine cells (reporter cells), that human chromosome 6 (Chr6) is mandatory for PAg-induced stimulation, but not for stimulation with mAb 20.1. The reporter cells responded to mAb 20.1 in cultures with BTN3A1-transduced Chinese hamster ovary cells (CHO BTN3A1) as antigen presenting cells. Nevertheless, for PAg-dependent activation the presence of Chr6 in CHO BTN3A1 was mandatory.
Although reporter cells expressing clonotypically different Vγ9Vδ2 TCRs showed similar PAg response, they clearly differed in the mAb 20.1 response. The reporter cell line transduced with Vγ9Vδ2 TCR D1C55 demonstrated essentially no response to mAb 20.1 compared to Vγ9Vδ2 TCR MOP cells. These findings were further supported by experiments performed with human PBMCs-derived Vγ9Vδ2 T cell clones. The results indicate heterogeneity in the PAg- and 20.1-dependent responses, in terms of CD25 and CD69 expression, among three different Vγ9Vδ2 T cells clones.
Co-cultures of reporter cells with Raji RT1BI and PAg plus mAb 20.1 or single chain antibody 20.1 (sc 20.1) revealed no additive or synergistic activating effects. In contrast, mAb 20.1 or sc 20.1 inhibited the PAg-mediated activation of the reporter cells.
The comparison of the relative contribution of the isoforms BTN3A2 and BTN3A3, in the activation of Vγ9Vδ2 T cells, was undertaken by overexpression of these isoforms in CHO cells. The results showed that BTN3A2 contributes to both PAg- and mAb-induced Vγ9Vδ2 T cell activation. On the contrary, BTN3A3 does not support PAg-mediated γδ T cell response.
Additionally, mutations in the proposed PAg- and mAb 20.1-binding sites of the extracellular BTN3A1 domain were generated by means of site-directed mutagenesis. These mutations revoked the mAb 20.1-induced Vγ9Vδ2 T cell activation, but not that induced by PAg.
Finally, co-cultures of Vγ9Vδ2 TCR MOP-transduced murine reporter cells with influenza A/PR/8/34-infected cells, or infection of PBMCs with this virus strain indicated that BTN3A1 might be dispensable for the Vγ9Vδ2 T cell response against influenza A.
The data of this research work points out that: i) in addition to BTN3A1, other Chr6-encoded genes are necessary for Vγ9Vδ2 T cell activation with PAg; ii) clonotypical (CDR3) differences influence the PAg- and mAb 20.1-mediated Vγ9Vδ2 T cell activation; iii) the PAg- and mAb 20.1-induced responses are not synergistic and interfere with each other; iv) BTN3A2 and BTN3A3 isoforms differ in the ability to support PAg- or mAb 20.1-dependent Vγ9Vδ2 T cell activation; v) the importance of the intracellular B30.2 domain of BTN3A1, in the Vγ9Vδ2 T cell activation, might be higher than that of the extracellular domain; and vi) in spite of the importance of BTN3A1 in the activation of Vγ9Vδ2 T cells, it is possible that many molecules with redundant functions are involved in the elimination of influenza virus infection by these cells.
In summary, it is possible to hypothesize a model in which BTN3A1 detects prenyl pyrophosphates in the cytoplasm via its B30.2 domain and in association with another protein(s). The binding of PAg to this domain induces a multimerization of BTN3A1 or a conformational change of its extracellular domain (mimicked by mAb 20.1). These modifications might be recognized by the Vγ9Vδ2 TCR or by an associated T cell protein. In the case that the TCR directly recognizes BTN3A1, the intensity of the response will depend on the Vγ9Vδ2 TCR clonotype. Future research will allow to gain a better understanding of BTN3A1, its interaction with other proteins, its actual role in the activation of Vγ9Vδ2 T cells, and its importance in specific models of cancer or infection. This knowledge will be necessary to transform these cells into effective tools in the clinic.
Immunologische Gedächtnisreaktionen sind die Grundlage um wiederkehrende Erreger schnell und effizient zu bekämpfen und um einen Impfschutz zu generieren. Das zellvermittelte Gedächtnis wird unter anderem durch CD8 Gedächtnis-T-Zellen aufgebaut, welche vor allem im Kontext von Immunreaktionen gegen intrazellulärer Erreger vonnöten sind, um bei Reinfektion mit den Erregerstämmen einen schnellen Schutz zu gewährleisten. Ein detailliertes Wissen über die Generierung, Kontrolle und Reaktivierung der Gedächtniszellen ist nützlich, um Gedächtnisreaktionen verstehen und lenken zu können. Durch die Entdeckung des TZR und CD28 wurden Meilensteine für das Verständnis der T-Zellaktivierung gelegt und die Grundlage geschaffen, CD8 Gedächtnisreaktionen zu verstehen. Auch wenn für primäre Immunreaktionen die „2-Signal-Theorie“ lange als erwiesen gilt, so blieb die Rolle der Kostimulation für Gedächtnisreaktionen lange umstritten. In dieser Arbeit wurden verschiedene methodische Herangehensweisen verwendet, mit denen durchgehend die Bedeutung von CD28 vermittelter Kostimulation für immunologische CD8 T-Zell-Gedächtnisreaktionen nachgewiesen wurde. CD28 blockierende Antikörper und CD28 induzierbar deletierbare Mauslinien wurden im Modellinfektionssystem mit Ovalbumin produzierenden Listeria monocytogenes zur Analyse der Primär- und Sekundärantworten verwendet. Mit diesen Methoden konnte eine Beeinträchtigung der Expansion von CD8 Gedächtniszellen in Abwesenheit von CD28 bewiesen werden. Weiterhin werden Effektorfunktionen wie Degranulation und Produktion von IFN-γ während der Sekundärinfektion in Abwesenheit von Kostimulation eingeschränkt. Mit Hilfe von Experimenten, bei denen CD28 suffizienten Mäusen eine geringe Anzahl an naiven, antigenspezifischen, CD28 deletierbaren CD8 T-Zellen transferiert wurden, wurde die Bedeutung der Kostimulation für die Expansion von Gedächtniszellen bestätigt, jedoch konnte überraschenderweise auch ein Anstieg der Effektorfunktionen in Abwesenheit von CD28 sowohl während der Primär- als auch der Sekundärantwort dokumentiert werden. Diese zur globalen Blockade bzw. Deletion widersprüchlichen Ergebnisse lassen eine Beteiligung anderer CD28 abhängiger Zelltypen an der Induktion der Effektorfunktionen der CD8 T-Zellen plausibel erscheinen, wie zum Beispiel Einflüsse von T-Helferzellen, welche die Effektorfunktionen positiv verstärken, solange sie selbst Kostimulationssignale empfangen können. Weiterhin konnte gezeigt werden, dass sich Gedächtniszellen an den CD28 defizienten Phänotyp – eine CD28 intakte immunologische Umgebung vorausgesetzt – adaptieren können, wenn ausreichend Zeit nach Deletion und vor Sekundärinfektion verstreichen konnte.
Multiple Sklerose (MS) ist die häufigste neurologische Erkrankung, die bei jungen Erwachsenen zu dauerhaften körperlichen Einschränkungen führt. Ein Kennzeichen der MS sind zeitlich und örtlich disseminierte entzündliche Läsionen im zentralen Nervensystem (ZNS). Die Läsionsart, die am häufigsten auftritt, ist u. a. durch Antikörperablagerungen charakterisiert. Die häufigste Verlaufsform der MS tritt in Schüben auf. Im Laufe der Erkrankung bilden sich die Symptome in der Mehrzahl der Patienten unvollständig zurück und es entwickelt sich ein chronischer Verlauf. Trotz intensiver Forschung ist die Ätiologie der MS bisher unbekannt Bis heute gibt es keine Biomarker, um den Therapieerfolg oder das Therapieversagen der MS-Basistherapeutika (Glatirameracetat und β-Interferon) zu bestimmen. Aktuelle Studien, bei denen B-Zellen depletiert wurden, zeigten eine signifikante Reduktion MS-typischer Läsionen und der Schubrate bei der schubförmigen MS. Man vermutet, dass autoreaktive B-Zellen vielfältige Aufgaben in der Pathogenese der MS übernehmen: sie produzieren Autoantikörper, präsentieren autoreaktiven T-Zellen Autoantigene und sezernieren Mediatoren, die zur Aktivierung anderer Immunzellen führen. Es ist noch unklar, welche B-Zell-Untergruppe bei der MS besondere Relevanz hat. Vor kurzem wurden B1-Zellen beim Menschen beschrieben. Eine Studie zeigte, dass die Anzahl der B1-Zellen in unbehandelten MS-Patienten signifikant erniedrigt war. Des Weiteren wurden im ZNS von chronisch erkrankten MS-Patienten B-Zell-Aggregate nachgewiesen. Diese B-Zell-Aggregate ähneln sekundären lymphatischen Organen und könnten zur Progredienz der Erkrankung beitragen. Eine ex vivo-Studie zeigte, dass die B-Zell-Aggregat-Bildung durch das Adhäsionsmolekül CEACAM1-(carcinoembryogenic antigen-related cell adhesion molecule 1) vermittelt wird. Überdies ist die Koexpression von CEACAM1 und TIM-3 (T-cell immunoglobulin- and mucin-domain containing-3) für immunerschöpfte und tolerante T-Zellen charakteristisch. Schließlich konnte unsere Arbeitsgruppe zeigen, dass ZNS-reaktive B-Zellen nur im Blut von Patienten mit einem klinisch isolierten Syndrom und MS-Patienten nachweisbar waren.
In meiner Studie habe ich den Einfluss von MS-Basistherapeutika und einer MS-Eskalationstherapie auf die B-Zell-Untergruppen untersucht. Dabei habe ich die naive B-Zell-, B-Gedächtniszell-, B1-Zell- und Plasmablasten-Zahl von gesunden Probanden sowie unbehandelten und behandelten MS-Patienten miteinander verglichen. Die B-Zell-Untergruppen wurden durchflusszytometrisch untersucht. Die B1-Zell-Zahl war bei behandelten und unbehandelten MS-Patienten signifikant erniedrigt. In einer weiteren Studie konnte ich zeigen, dass die Anwesenheit von ZNS-reaktiven B-Zellen im Blut von glatirameracetat-behandelten MS-Patienten mit dem Therapieerfolg assoziiert war. Die ZNS-reaktiven B-Zellen wurden durch einen ZNS-Lysat-ELISPOT detektiert. Schließlich habe ich in einer dritten Studie die Expression von CEACAM1 und TIM-3 auf B-Zellen bei natalizumab-behandelten MS-Patienten durchflusszytometrisch untersucht. Im Vergleich zu gesunden Probanden zeigte sich, dass im Blut der MS-Patienten die CEACAM1+- und die CEACAM1\(^+\)TIM-3\(^+\)-B-Zell-Zahl signifikant erhöht war. Im Gegensatz dazu waren CEACAM1\(^+\)TIM-3\(^+\)-T-Helferzellen signifikant erniedrigt in behandelten MS-Patienten.
Meine Arbeit belegt, dass die B1-Zell-Population unabhängig von der MS-Therapie in MS-Patienten erniedrigt ist. Ungeklärt bleibt, ob diese Erniedrigung eine Folge oder eine Ursache der Erkrankung ist. B1-Zellen sind die Quelle von natürlichen Antikörpern in Mensch und Tier. Sie haben protektive Eigenschaften und sind bei der B-Zell-Toleranzinduktion beteiligt. Die protektiven Funktionen der natürlichen Antikörper könnten durch die Erniedrigung der B1-Zell-Zahl ausbleiben. Zusätzlich waren B-Zellen mit einem immunerschöpften Phänotyp im Blut von MS-Patienten erhöht. Trotz Stimulation konnte kein Phänotyp bei T-Helferzellen induziert werden, der für tolerante und immunerschöpfte T-Zellen beschrieben worden ist. In zukünftigen Studien sollte man die B1-Zell-Zahl und die CEACAM1\(^+\)TIM-3\(^+\)-B- und -T-Zell-Zahl bei Patienten mit einem klinisch isolierten Syndrom im Liquor und im Blut untersuchen. Damit könnte man feststellen, ob B1-Zellen aus der Peripherie bei MS-Patienten in das ZNS migrieren. Die Anwesenheit ZNS-reaktiver B-Zellen im Blut von behandelten MS-Patienten zeigte sich in meiner Arbeit als ein Marker, um den Therapieerfolg zu dokumentieren. Eine weiterführende Querschnittstudie (COPSELECT) wird ZNS-reaktive B-Zellen mittels ZNS-Lysat-ELISPOT als zukünftige Therapie-Biomarker ausführlicher untersuchen. MS-Biomarker wären für den einzelnen Betroffenen von großer Bedeutung und hätten ebenfalls gesundheitsökonomisch eine hohe Relevanz.
Die invasive Aspergillose (IA) z¨ ahlt zu den seltenen, bei immunsupprimierten Patienten
jedoch mit einer hohen Letalit¨ at verbundenen Infektionskrankheiten. Sie wird, wie alle
Aspergillosen, durch den humanpathogenen Schimmelpilz Aspergillus fumigatus ausgel¨ ost.
Bis heute ist die oft nicht effektive Therapie einer IA mit hohen Nebenwirkungen und
Kosten verbunden. Die Entwicklung von Pathogen-spezifischen Immuntherapien soll durch
die Forschung im Bereich der immunologischen Infektionsbiologie vorangetrieben werden.
Fur neuen Erkenntnisse wird die Interaktion von humanen Immunzellen mit ¨ A. fumigatus
analysiert.
In der vorliegenden Studie wurde mit dendritischen Zellen (DCs) gearbeitet, da diese
Pilzmorphologien von A. fumigatus phagozytieren k¨ onnen und uber Antigenpr ¨ ¨ asentation
das adaptive Immunsystem aktivieren. Es wurden aus humanen Monozyten differenzierte DCs (moDCs) verwendet, mit welchen viele Forschergruppen aufgrund ihrer verfugbar ¨
großen Anzahl arbeiten. Allerdings dauert die Generierung von moDCs funf Tage. Aus ¨
dem peripheren Blut entstammende CD1c-positive myeloide DCs (mDCs) oder CD303-
positive plasmazytoide DCs (pDCs) k¨ onnen dagegen direkt nach der Isolation verwendet
werden. Die beiden DC-Populationen werden aus verschiedenen Vorl¨ auferzellen des h¨ amatopoetischen Systems im Knochenmark gebildet. Ihr Ph¨ anotyp und ihre Immunfunktionen
unterscheiden sich untereinander und auch von denen der moDCs.
In Interaktionsstudien konnte analysiert werden, dass die drei verwendeten DC-Subtypen
(moDCs, mDCs, pDCs) unterschiedlich auf A. fumigatus reagieren. moDCs und mDCs reiften in direktem Kontakt zu Aspergillus, sie sekretierten ein relativ ¨ ahnliches Zytokinprofil
und exprimierten die bekannten Aspergillus-Rezeptoren Dectin-1, TLR2 und TLR4. Im
Kontrast dazu verblieben pDCs trotz Aspergillus-Kontakt unreif und sekretierten nahezu
keine Zytokine. Da moDCs und mDCs eine Immunreaktion auf den Pilz zeigten, wurden
sie mit verschiedenen Aspergillus-Antigenen beladen und n¨ aher untersucht.
Bevor verschiedene Aspergillus-Antigene zur Beladung der DCs eingesetzt werden konnten, wurden diese analysiert und aufgereinigt. Hierfur wurde ein routinierter Arbeitsprozess ¨
etabliert. Zwei der vier verfugbaren Proteinantigene waren mit Endotoxin kontaminiert. ¨
Da schon geringe Mengen an Endotoxinen auf DCs einen stimulatorischen Effekt ausubten, ¨
wurden die Proteine mittels Affinit¨ atschromatografie von den verunreinigenden Endotoxinen befreit.
In den Stimulationsexperimenten wirkten die beiden Proteinantigene CcpA und SHMT
immunogen auf moDCs und mDCs. CcpA induzierte eine st¨ arkere Maturierung und Zytokinfreisetzung als SHMT. Auff¨ allig war, dass mDCs im Vergleich zu moDCs die Expression
von MHC Klasse II st¨ arker erh¨ ohten und mehr IL18 freisetzten. Die mit CcpA oder SHMT
beladenen moDCs und mDCs aktivierten autologe T-Zellen zur IFNg Sekretion und zur
Proliferation. Zudem wurden durch die beiden Proteine Aspergillus-spezifische, CD154-
positive T-Zellen induziert. Diese Aspergillus-spezifische Immunogenit¨ at von CcpA und
SHMT macht die beiden Proteine zu interessanten Kandidaten fur einen Vakzinierungs- ¨
Cocktail einer DC-Immuntherapie. Aspergillus Lysat induzierte als weiteres Antigen eine
T-Zell Immunantwort mit CD154-positiven T-Zellen. Zudem war die Proliferation und
IFNg Sekretion von T-Zellen induziert, obwohl moDCs und mDCs nicht reiften und nur
wenige Zytokine sekretierten. Die beiden Aspergillus-Proteine CpcB und fg-gap induzierten die Reifung und Zytokinsekretion von moDCs und mDCs nicht. Demzufolge sind CpcB
und fg-gap fur eine DC-Immuntherapie nicht empfehlenswert. ¨
Ein Vakzinierungs-Cocktail enth¨ alt in der Regel Adjuvantien, welche die Immunreaktion
verst¨ arken. Adjuvante Effekte auf moDCs konnten die getesteten Aspergillus-RezeptorLiganden Zymosan, Pam3CSK4, LPS ultrapur und R848 ausl¨ osen. Hyalurons¨ aure konnte keine Verbesserung der Reifung oder Vitalit¨ at von moDCs und mDCs bewirken. Die
Antigen-bedingte Reifung der DCs fur n ¨ ¨ otige Restimulationen w¨ ahrend der Therapie konnte mittels einer tiefgekuhlten Lagerung in CryoStor Einfriermedium stabil beibehalten ¨
werden.
Die beiden immunogenen Aspergillus-Proteine, die adjuvanten Rezeptor-Agonisten und
die stabile Lagerung in CryoStor k¨ onnen als elementare Grundsteine fur einen Vakzinierungs- ¨
Cocktail einer anti-fungalen DC-Immuntherapie mit moDCs oder mDCs angesehen werden.
Wilms tumor protein 1 (WT1) is a suitable target to develop an immunotherapeutic approach against high risk acute myeloid leukemia (AML), particularly their relapse after allogeneic hematopoietic stem cell transplantation (HSCT). As an intracellular protein traversing between nucleus and cytoplasm, recombinant expression of WT1 is difficult. Therefore, an induction of WT1-specific T-cell responses is mostly based on peptide vaccination as well as dendritic cell (DC) electroporation with mRNA encoding full-length protein to mount WT1-derived peptide variations presented to T cells. Alternatively, the WT1 peptide presentation could be broadened by forcing receptor-mediated endocytosis of DCs.
In this study, antibody fusion proteins consisting of an antibody specific to the human DEC205 endocytic receptor and various fragments of WT1 (anti-hDEC205-WT1) were generated for a potential DC-targeted recombinant WT1 vaccine. Anti-hDEC205-WT1 antibody fusion proteins containing full-length or major parts of WT1 were not efficiently expressed and secreted due to their poor solubility and secretory capacity. However, small fragment-containing variants: anti-hDEC205-WT110-35, anti-hDEC205-WT191-138, anti-hDEC205-WT1223-273, and anti-hDEC205-WT1324-371 were obtained in good yields.
Since three of these fusion proteins contain the most of the known immunogenic epitopes in their sequences, the anti-hDEC205-WT191-138, anti-hDEC205-WT1223-273, and anti-hDEC205-WT1324-371 were tested for their T-cell stimulatory capacities. Mature monocyte-derived DCs loaded with anti-hDEC205-WT191-138 could induce ex vivo T-cell responses in 12 of 16 blood samples collected from either healthy or HSC transplanted individuals compared to included controls (P < 0.01). Furthermore, these T cells could kill WT1-overexpressing THP-1 leukemia cells in vitro after expansion.
In conclusion, alongside proving the difficulty in expression and purification of intracellular WT1 as a vaccine protein, our results from this work introduce an alternative therapeutic vaccine approach to improve an anti-leukemia immune response in the context of allogeneic HSCT and potentially beyond.
Die Arteriosklerose ist ein chronisch entzündlicher Prozess der Gefäßwand, in dem CD4+CD25+FoxP3+ regulatorische T-Zellen („\(T_{reg}\)“) eine atheroprotektive Rolle spielen. Durch exogenen \(T_{reg}\)-Transfer konnten andere Gruppen eine Reduktion der Arteriosklerose nachweisen. In der vorliegenden Arbeit wurde die Aktivität der endogenen Treg durch spezielle Antikörper modifiziert, ihr Einfluss auf die Entwicklung arteriosklerotischer Plaques in ApoEko-Mäusen untersucht sowie eine mögliche Abhängigkeit dieser Wirkung vom zellulären Immunstatus des Wirts geprüft.
Im Abstand von 28 Tagen wurde weiblichen ApoEko-Mäusen zweimal der CD28-spezifische superagonistische monoklonale Antikörper D665 injiziert, um eine polyklonale Vermehrung ihrer \(T_{reg}\) anzuregen. In einer zweiten Versuchsreihe wurden endogene \(T_{reg}\) zweimal im Abstand von 28 Tagen durch Gabe eines CD25-spezifischen Antikörpers (PC61) zunächst depletiert und jeweils 7 Tage später durch D665 geboostert, um den Effekt der \(T_{reg}\) auf ein initial Treg defizientes Tiermodell zu testen. Verglichen wurde mit der alleinigen Treg-Depletion durch PC61 sowie mit einem Kontrollantikörper (Isotyp-IgG, MOPC). Die Quantifizierung der Arterioskleroseentwicklung erfolgte mittels Planimetrie der Plaquefläche der Aorta. Die Wirksamkeit der Antikörper auf die \(T_{reg}\)-Konzentrationen wurde mittels FACS-Analysen aus Blut und Milz untersucht.
Nach alleiniger \(T_{reg}\)-Amplifikation durch D665-Injektion zeigte sich kein Unterschied in der prozentualen Plaquefläche im Vergleich zur Kontrollgruppe. Auch eine alleinige Depletion mit PC61 zeigte keine Veränderungen in der Läsionsfläche. Durch Kombination beider Antikörper jedoch kam es nach Treg-Depletion mittels PC61, gefolgt von Treg-stimulierender D665-Behandlung, zu einer signifikanten Verminderung der prozentualen Plaquefläche der Aorta um 32,02% im Vergleich zur MOPC Kontrolle und um 28,73% im Vergleich zur alleinigen \(T_{reg}\)-Depletion mit PC61+MOPC. Die FACS-Analysen bestätigten eine signifikante Depletion durch PC61-Injektion sowie eine signifikante Zunahme der Treg eine Woche nach D665-Injektion.
Die Stimulation regulatorischer T-Zellen in einem Treg-defizienten arteriosklerotischen Tiermodell reduzierte die aortale arteriosklerotische Läsionsfläche signifikant. In der immunkompetenten ApoEko Maus jedoch bewirkte die alleinige Vermehrung oder die alleinige Depletion regulatorischer T-Zellen keine messbare Veränderung in der Plaqueentwicklung. Diese Arbeit zeigt, dass ein Zusammenhang zwischen der Wirksamkeit regulatorischer T-Zellen und der inflammatorischen Veränderung der Gefäßwand besteht.
Genome wide association studies (GWAS) have identified Clec16a as disease suscepti-bility gene for numerous auto-immune disorders in particular type 1 diabetes. In spite of this strong genetic link, the role of Clec16a for immune regulation continues to be largely unknown. To study the function of Clec16a in an environment susceptible to autoimmune diseases a Clec16a deficient non obese diabetic (NOD) mouse strain was generated by means of lentiviral RNA interference. Clec16a knock down (KD) mice prove to be strongly protected against developing type 1 diabetes, an effect that is mediated by hyporeactive T effector cells. T cell hyporeactivity seems to result from an impairment of proximal TCR signalling and its cause is likely to be external to T cells. Given evidence on the involvement of the Clec16a Drosophila ortholog ema in endo- and autophagosomal processes, alterations in peripheral and/or central antigen presenting cells appeared to be potential reasons for the observed T cell hyporeactivity. While we are not able to identify any changes in quantity and quality of peripheral antigen presenting cells due to Clec16a silencing activation status of thymic epithelial cells in Clec16a KD mice deviates from NOD WT. The findings presented here suggest that thymic T cell development is affected by Clec16a variation. Such a relationship could explain the genetic association between Clec16a variations in humans and susceptibility to immune-mediated diseases, yet further investigations are needed to confirm this notion.
Peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are the only source of human lymphoid cells routinely available for immunologic research and for immunomonitoring of T-cell responses to microbial and tumor-associated antigens. However the large majority of human T-cells resides in tissues, especially in lymphatic organs, while only 1 % of the body’s T-cells circulate in the blood stream. Previous work in mice and humans had indicated that CD4 T-cells transiently lose antigen sensitivity when cellular contacts are lost, e.g. by leaving lymphoid organs such as lymph nodes (LNs) and entering the circulation. In this study, these findings were extended to CD8 T-cells. Thus, CD8 T-cell responses of the human tonsil show a significant drop in sensitivity to viral antigens if tissue-exit was simulated by keeping cells in dispersed culture at body temperature for two hours.
Conversely, tissue-like functionality in blood-derived CD8 T-cells was restored by applying the simple and robust RESTORE protocol. Indeed, application of the RESTORE protocol, i.e. pre-culturing PBMCs for two days at a high cell density before initiation of antigenic stimulation, demonstrated that CD8 T-cell responses to a broad range of viral and to tumor-associated antigens are greatly underestimated, and sometimes even remain undetected if conventional, unprocessed PBMC cultures are used. The latter finding is particularly striking with regard to the appearance of Wilms tumor 1 (WT1)-specific CD8 T-cell responses in leukemia patients after allogeneic bone marrow transplantation. My studies on the mechanism of the RESTORE protocol show that HD preculture of PBMCs does not involve antigen-or cytokine-driven clonal expansion of T-cells. Moreover, the gain in antigen sensitivity cannot be explained by a decreased activity of regulatory T-cells during the preculture step. The increased antigen sensitivity of CD8 T-cells from HD precultures of PBMCs is associated with tonic T-cell receptor signaling as indicated by enhanced tyrosine phosphorylation of the CD3 ζ chains and the tyrosine kinase Lck, thereby preparing T-cells for full responses. The upregulation of genes involved in aerobic glycolysis in “restored” CD8 memory T-cells relative to fresh cells might be an essential requirement for increased T-cell functionality including the regulation of IFN-γ production. Taken together, the RESTORE protocol, which was initially described for the CD4 T-cell response to the antibody TGN1412 permits a more meaningful monitoring of CD8 T-cell responses to viral infections and tumors. Furthermore, when generating T-cell lines for adoptive T-cell therapy, the RESTORE protocol allows the generation of CD8 T-cell lines with an improved representation of clones responding to low antigen concentrations.
Effect of cytokine inhibition on peripheral memory B cells in patients with Rheumatoid arthtritis
(2015)
Objective: Rheumatoid arthritis (RA) is a chronic, systemic, inflammatory autoimmune disease. Enhanced B cell activity has been proposed in the pathogenesis of RA along with different pro-inflammatory cytokines such as interleukin 6 (IL-6) and tumor necrosis factor alpha (TNF-α), critically involved in chronic inflammation. Biological agents targeting these cytokines IL-6 and TNF-α have considerably advanced treatment of autoimmunity. Enhanced B cell activity, particularly memory B cells gained particularly interest in evaluating response during therapies from biologics. Human peripheral memory B cells can be distinguished by the phenotypic expression of CD27 and IgD defining three major B cell subpopulations: CD27+IgD+ pre-switch, CD27+IgD- post-switch and CD27-IgD- double negative (DN) memory B cells. Therefore, we analyzed different memory populations during cytokine inhibition by using tocilizumab (anti-IL-6R, TCZ) and adalimumab (anti-TNF-α, ADA), with focus on DN B cells Suspended. DN B cells lacking the conventional memory marker CD27, but due to their mutational Ig repertoire (IgR) considered in the memory compartment. However, only scare data are available for this DN subpopulation in RA.
Methods: Phenotype analysis of activation markers (CD95 and ki-67) of B cell and their subsets were compared in RA patients (median age ~56 years) and in HD. DN memory B cells were phenotypically analyzed from RA patients during IL-6R or TNF-α inhibition at baseline week 12, week 24 and 1 year. Single B cell PCR approach was used to study Ig- receptors VH genes and isotype specific genes. Nonparametric Wilcoxon matched pair test and Mann-Whitney U test was used for statistical analysis by using GraphPadPrism 5. Univariate logistic regression was used to calculate odd ratios and correlation using Pearson r using SPSS statistics 22.
Results: Surface and intracellular staining of B cells showed a significantly higher percentage of CD95 and ki-67 expressions in RA, which was highest in post-switch memory B cells followed by pre-switch and DN memory B cells. During cytokines (IL-6R & TNF-α) inhibition, both CD95 and ki-67 expression were significantly reduced at week 12 and 24 along with reduction in their clinical parameters like DAS28, CRP, ESR. Furthermore, the phenotypic analysis in 107 RA patients and 49 healthy donors (HD) showed a significantly expanded population of DN B cells in RA which contain a heterogeneous mixture of IgA, IgG and IgM expressing cells with a clear dominance of IgG+ cells. Pre-therapy analysis of rearranged IgR sequences from patients (n=9) revealed that DN B cells carry rearranged heavy chain gene sequences with a diversified mutational pattern consistent with memory B cells. In contrast to tumor necrosis factor alpha (TNF-alpha) inhibition, a significant reduction in mutational frequency of BCR gene rearrangements at week 12, 24 and 1 year (p < 0.0001) was observed by in vivo IL-6R inhibition. These changes were observed for all BCR isotypes IgG, IgA and IgM at week 12, 24 and 1 year (p < 0.0001). IgA-RF, IgA serum level and IgA+ DN B cells decreased significantly (p < 0.05) at week 12 and week 24 during TCZ. Patients with a good European league against rheumatism (EULAR) response to TCZ had less DN B cells at baseline as compared to moderate responders (p = 0.006). Univariate logistic regression analysis revealed that the frequency of DN B cells at baseline is inversely correlated to a subsequent good EULAR response (p = 0.024) with an odds ratio of 1.48 (95% confidence interval as 1.05-2.06).
Conclusion: Both anti-TNF-α and anti-IL-6R could reduce higher B cell activity and improve disease activity tremendously in RA patients. The heterogeneous DN B cell compartment is expanded in RA and dominated by IgG isotype. TCZ can modulate the mutational status of DN Ig isotype receptors over 1 year. Interestingly, the frequency of DN B cells in RA may serve as a baseline predictor of subsequent EULAR response to TCZ.
Accurate information transfer between neurons governs proper brain function. At chemical synapses, communication is mediated via neurotransmitter release from specialized presynaptic intercellular contact sites, so called active zones. Their molecular composition constitutes a precisely arranged framework that sets the stage for synaptic communication.
Active zones contain a variety of proteins that deliver the speed, accuracy and plasticity inherent to neurotransmission. Though, how the molecular arrangement of these proteins influences active zone output is still ambiguous. Elucidating the nanoscopic organization of AZs has been hindered by the diffraction-limited resolution of conventional light microscopy, which is insufficient to resolve the active zone architecture on the nanometer scale. Recently, super-resolution techniques entered the field of neuroscience, which yield the capacity to bridge the gap in resolution between light and electron microscopy without losing molecular specificity. Here, localization microscopy methods are of special interest, as they can potentially deliver quantitative information about molecular distributions, even giving absolute numbers of proteins present within cellular nanodomains.
This thesis puts forward an approach based on conventional immunohistochemistry to quantify endogenous protein organizations in situ by employing direct stochastic optical reconstruction microscopy (dSTORM). Focussing on Bruchpilot (Brp) as a major component of Drosophila active zones, the results show that the cytomatrix at the active zone is composed of units, which comprise on average ~137 Brp molecules, most of which are arranged in approximately 15 heptameric clusters. To test for a quantitative relationship between active zone ultrastructure and synaptic output, Drosophila mutants and electrophysiology were employed. The findings indicate that the precise spatial arrangement of Brp reflects properties of short-term plasticity and distinguishes distinct mechanistic causes of synaptic depression. Moreover, functional diversification could be connected to a heretofore unrecognized ultrastructural gradient along a Drosophila motor neuron.
Regulatorische T-Zellen (Tregs) spielen eine ntscheidende Rolle beim Erhalt der Immunhomöostase und bei der Kontrolle überschießender Immunantworten. Sie können anhand ihres Entstehungsortes in im Thymus generierte natürliche Tregs (nTregs) und in der Peripherie generierte induzierte Tregs (iTregs) unterteilt werden. Ihr Phänotyp wie auch ihre Funktion werden zu einem großen Teil durch den transkriptionellen Masterregulator Foxp3 kontrolliert. Das kostimulatorische Molekül CD28 wird von nTregs für die Differenzierung benötigt und von Tregs und konventionellen T-Zellen (Tkons) für ihre Aktivierung. Superagonistische CD28 spezifische monoklonale Antikörper (CD28SA) aktivieren T-Zellen im
Gegensatz zu konventionellen anti-CD28 Antikörpern ohne zusätzliche Ligation des T-Zellrezeptors. Die in vivo Applikation des CD28SA bewirkt eine starke Aktivierung der
Tregs und eine präferentielle Expansion der Tregs gegenüber Tkons. Dies erklärt die präventive und therapeutische Wirkung der CD28SA Behandlung in verschiedenen Krankheitsmodellen bei Nagern. Die erste Anwendung des humanisierten CD28SA TGN1412 führte in den Testpersonen jedoch zu einem unerwarteten „Cytokine-Release Syndrom“. Daher wurde hier am Mausmodell der Zusammenhang zwischen Treg Aktivierung und systemischer Zytokinausschüttung näher untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass die CD28SA vermittelte Proliferation der T-Zellen abhängig vom CD28 Signal und von parakrinem
Interleukin (IL)-2 ist. Durch die in vivo Depletion der Tregs vor der CD28SA Injektion wurde deutlich, dass es auch in Mäusen nach CD28SA Stimulation zu einer systemischen Ausschüttung pro-inflammatorischer Zytokine kommt, die jedoch, im Gegensatz zum humanen System, von Tregs effektiv kontrolliert werden kann. Um die usschüttung pro-inflammatorischer Zytokine zu verhindern, wäre eine zusätzliche prophylaktische Behandlung
mit Corticosteroiden möglich, da diese auch in hohen Dosen die CD28SA vermittelte Aktivierung und Expansion der Tregs nicht beeinflussen. Neben der Expansion wird durch die Stimulation mit CD28SA auch die Produktion des
anti-inflammatorischen Zytokins IL-10 in Tregs induziert und so eine genauere Untersuchung des Ursprungs und des Schicksals IL-10 produzierender Tregs ermöglicht. Diese
Tregs exprimieren im Vergleich zu IL-10 negativen Tregs ein höheres Niveau an Molekülen, die mit einer supprimierenden Aktivität verbunden sind. Zudem werden IL-10 Produzenten aufgrund der Veränderung im Expressionsmuster der Migrationsrezeptoren nach der Stimulation von einem lymphknotensuchenden CCR7+CCR5-CCR6- zu einem entzündungssuchenden CCR7-CCR5+CCR6+ Phänotyp verstärkt in Bereiche mit stattfindender Immunantwort rekrutiert. Schließlich sind IL-10 produzierende Tregs von CD28SA stimu2 lierten Mäusen in vitro stärker apoptoseanfällig als die IL-10 negativen Tregs. Die
Aktivierung der Tregs scheint somit die terminale Differenzierung zu einem IL-10 produzierenden
Effektorphänotyp mit begrenzter Lebensdauer zu induzieren. Dies führt auch zur Beendigung der Immunsuppression. Die Kombination aus schwachem TZR und starkem CD28 Signal, die die CD28SA Stimulation
in naiven T-Zellen auslöst, induziert zumindest in vitro abhängig von IL-2 und TGFβ effizient die Expression von Foxp3. Die so generierten iTregs haben, ähnlich wie konventionell in vitro erzeugte iTregs, in Bezug auf die Expression von Oberflächenmolekülen und den Methylierungsstatus bestimmter Regionen des Foxp3 Gens einen Phänotyp, der zwischen dem von Tkons und Tregs liegt. Da auch die supprimierende Aktivität der iTregs
geringer ist als die der ex vivo Tregs bedarf es einer weiteren Optimierung des Stimulationsprotokolls,
um diese Zellen für therapeutische Zwecke verwenden zu können. Zusammenfassend zeigt diese Arbeit, dass die superagonistische Stimulation des CD28 Moleküls ein vielseitig einsetzbares Instrument ist. Einerseits können durch die CD28SA Stimulation Tregs polyklonal aktiviert und für therapeutische Zwecke mobilisiert werden
und andererseits kann die besondere Art der T-Zellstimulation auch dazu genutzt werden, neue Aspekte von nTregs und iTregs zu untersuchen.
Kinasen der SRC-Familie (SFKs) sind sowohl in Wachstum und Metastasierung von Tumor- und Leukämiezellen als auch an prominenter Stelle in vielgestaltige Signalwege aller Immunzellen involviert. Eine Hemmung von SFKs ist damit ein vielversprechendes Mittel zur Therapie maligner Erkrankungen, kann aber darüber hinaus auch sehr effektiv zur Immunmodulation genutzt werden. Für den zur Therapie von CML und AML zugelassenen Tyrosinkinaseinhibitor (TKI) Dasatinib (Handelsname Sprycel®), für den unter anderem SFKs die Hauptziele darstellen, wurden, neben der antitumoralen Wirkung, sowohl immunsuppressive als auch immunstimulierende Effekte beschrieben. Aus diesem Grund könnte Dasatinib ein für die Modulation von Immunantworten sehr interessantes Hilfsmittel darstellen. In der vorliegenden Arbeit werden die hemmenden und fördernden Einflüsse von Dasatinib auf zwei Typen von Immunzellen genauer untersucht, um so die Auswirkungen einer Dasatinib-Behandlung auf Zellen des Immunsystems besser zu verstehen und sich das immunmodulatorische Potenzial von Dasatinib besser nutzbar machen zu können.
Der erste Teil der Arbeit beschäftigt sich mit der Untersuchung möglicher kombinatorischer Effekte zwischen Dasatinib und dem Glucocorticoid Dexamethason auf verschiedene Subsets von T-Zellen vor dem Hintergrund eines potentiellen Einsatzes der Kombination bei der allogenen Hämatopoetischen Stammzelltransplantation (HSCT) zur Separation von Graft-versus-Leukemia (GvL)-Effekten und der Graft-versus-host Disease (GvHD). Während keine kombinatorischen Effekte bei der Aktivierung von T-Zellen auftraten, ergaben sich bei der Untersuchung des Einflusses auf die Proliferation besonders in CD8+ T-Zellen additive Effekte durch die Kombination. Die Proliferation naiver T-Zell-Subsets wurde bereits durch die beiden Einzelsubstanzen alleine stark gehemmt. Dagegen waren Memory T-Zell-Subsets deutlich unempfindlicher, allerdings konnte durch eine Kombination von Dexamethason und Dasatinib auch die Proliferation dieser Memory Subsets effektiv gehemmt werden. Hierbei zeigten sich bei CD8+ Memory Subsets die deutlichsten synergistischen Effekte. Da eine Kombination in stärkerem Maße auch CD8+ gegenüber CD4+ Memory Subsets hemmt und diese Subsets unterschiedliche Rollen in der Induktion von GvL-Effekten und der Auslösung einer GvHD zu spielen scheinen, ist eine Steigerung der GvL-Effektivität durch die Medikamenten-Kombination bei gleichzeitiger Minimierung eines GvHD-Risikos in Zusammenhang mit anderen publizierten Ergebnissen durchaus denkbar. Weil eine starke Hemmung von virus-spezifischen T-Zellen nur bei sehr hohen Konzentrationen auftrat, ist zudem das Risiko einer Virus-Reaktivierung, die ein großes Problem bei einer HSCT darstellt, eher als gering einzuschätzen.
Der zweite Teil der Arbeit befasst sich mit dem Einfluss von Dasatinib auf aus Monozyten generierte Dendritische Zellen (moDCs) mit einem Fokus auf der Beeinflussung ihrer Migration. Während eine Behandlung mit Dasatinib nur sehr geringe Auswirkungen auf die Ausreifung der moDCs und die Expression von kostimulatorischen Molekülen hatte, führte eine Dasatinib-Behandlung zu einer Zeit- und Dosis-abhängigen Verringerung der Zytokinsekretion (IL-10 und IL-12). Im Gegensatz dazu hatte Dasatinib keinen Einfluss auf die phagozytotische Aktivität der moDCs und auf ihre Fähigkeit, Virus-spezifische T-Zell-Antworten auszulösen. Dasatinib zeigte dagegen einen deutlich steigernden Einfluss auf die Migration von moDCs gegen einen CCL19-Gradienten im Transwell-Assay, ohne die Expression des CCL19-Rezeptors CCR7 zu beeinflussen. Da ähnliche Migrations-steigernde Effekte auch bei einer Behandlung mit dem spezifischen SFK-Inhibitor SKI-1 auftraten, eine Behandlung mit Nilotinib, einem TKI der nicht auf SFKs wirkt, im Gegensatz dazu aber zu einer Hemmung der Migration führte, liegt es nahe dass die Migrations-steigernde Wirkung von Dasatinib über SFKs vermittelt wird. Dasatinib führte zu einer deutlichen Inhibierung der Phosphorylierung der inhibitorischen Immunrezeptoren Siglec-9 und Siglec-3 (CD33) ohne ihre Expressionslevel zu beeinflussen. Eine mit spezifischen Antikörpern durchgeführte Blockierung dieser Immunrezeptoren, deren ITIM-Domänen mutmaßlich von SFKs phosphoryliert werden, hatte eine deutliche Steigerung der Migration und eine verringerte Phosphorylierung von Siglec-9, Siglec-3 und SHP-2 zur Folge. Letztere ist eine Phosphatase, die nach Bindung an phosphorylierte ITIM-Domänen von Rezeptoren wie den Siglecs verschiedene Zielmoleküle dephosphoryliert. Die Ergebnisse dieser Arbeit legen nahe, dass die Migrations-steigernde Wirkung von Dasatinib über eine Hemmung von SFKs und daraus resultierend auf dem Wegfall eines inhibitorischen Signalwegs erfolgt. Diese Steigerung der Migration könnte in der Tumor-Therapie von großem Nutzen sein, da bei einer Vakzinierung mit autologen DCs, die mit Tumor-assoziierten Antigenen stimuliert wurden, die schlechte Einwanderung in die Lymphknoten eines der Hauptprobleme darstellt. Zur Überwindung dieses Problems könnte Dasatinib ein sehr effektives Hilfsmittel darstellen und die Therapie-Effizienz deutlich verbessern. Da Dasatinib aber auch eine ganze Reihe weiterer, sehr vielfältiger Einflüsse auf alle Arten von Immunzellen ausübt, scheint eine Verwendung spezifischer blockierender α-Siglec-Antikörper auf Grund geringerer Nebenwirkungen im Vergleich zu Dasatinib möglicherweise sogar noch deutlich besser geeignet zu sein, das Migrationsverhaltens Dendritischer Zellen positiv zu beeinflussen. Die Verwendung gegen Siglec-Rezeptoren gerichteter Antikörper als Adjuvantien könnte somit zu einem erfolgreicheren Einsatz der Vakzination mit Dendritischen Zellen in der Tumor-Therapie führen.
Herstellung monoklonaler Antikörper gegen das von Aspergillus fumigatus produzierte Gift Gliotoxin
(2014)
Diese Arbeit befasst sich mit der Herstellung monoklonaler Antikörper gegen Gliotoxin und eine Charakterisierung der Eigenschaften dieser Antikörper sowie ihrer Fab-Fragmente im ELISA sowie in Zellkulturen. Insgesamt konnten fünf monoklonale Antikörper generiert werden, die spezifisch für das Mykotoxin Gliotoxin waren.
In Ratten und Mäusen aktiviert der superagonistische anti-CD28 monoklonale Antikörper (CD28SA) vorzugsweise regulatorische T-Zellen. In niedriger Dosierung führt CD28SA zu einer fast ausschließlichen Aktivierung von regulatorischen T-Zellen (Tregs). Diese Beobachtung konnte inzwischen auch für menschliche Zellen in Zellkultur bestätigt werden.
In gesunden und freiwilligen Testpersonen deutet die Zytokin-Antwort nach Applikationen von niedrigen CD28SA-Dosen darauf hin, dass sich diese Beobachtung auch in-vivo bewahrheitet. Eine Gabe von CD28SA in niedriger Dosierung, die zu einer exklusiven Aktivierung von regulatorischen T-Zellen führt, könnte somit in der Behandlung von Autoimmunkrankheiten oder von entzündlichen Erkrankungen eingesetzt werden.
Eine mechanistische Erklärung für dieses Phänomen blieb lange Zeit unklar. Die CD28SA-vermittelte T-Zell-Aktivierung ist abhängig von der Verstärkung von basalen tonischen Signalen, die T-Zellen über ihren T-Zell-Rezeptor erhalten. Diese Tatsache führte zu der Hypothese, dass die schwachen, tonischen Signale, die konventionelle CD4+ T-Zellen in Abwesenheit ihrer spezifischen Antigene über den T-Zell-Rezeptor erhalten, ein stärkeres CD28 Signal für ihre Aktivierung benötigen als die selbstreaktiven regulatorischen T-Zellen, die ein stärkeres Selbstpeptid-TCR Signal erhalten.
In dieser Arbeit konnte gezeigt werden, dass die Blockade von MHC-Klasse-II-Molekülen in Mäusen, in-vitro und in-vivo, den Vorteil der regulatorischen T-Zellen gegenüber den konventionellen T-Zellen bezüglich der Antwort auf niedrige CD28SA Dosierungen, aufhebt.
Die Implantation eines Medizinprodukts in den menschlichen Körper ruft eine Immunreaktion hervor, die zur fibrösen Einkapselung führen kann. Makrophagen in direktem Kontakt mit der Oberfläche des Implantats erfassen sensorisch den Fremdkörper und übersetzten das Signal in die Freisetzung zahlreicher löslicher Mediatoren. Das generierte Entzündungsmilieu moduliert die Heilungsreaktion und kann zur Anreicherung von Fibroblasten sowie zur Erhöhung der Matrixsyntheserate in der Wundumgebung führen. Eine dichte fibröse Kapsel um ein Medizinprodukt beeinträchtigt den Ersatz von Körperstrukturen, das Unterstützen physiologischer Körperfunktionen sowie die Effizienz einer medizinischen Therapie. Zur Identifizierung potenzieller Biomaterialkandidaten mit optimalen Eigenschaften ist jedoch eine evidenzbasierte Entscheidungsfindung notwendig und diese wiederum muss durch geeignete Testmethoden unterstützt werden.
Zur Erfassung lokaler Effekte nach Implantation eines Biomaterials begründet die Komplexi-tät der ablaufenden Fremdkörperreaktion die Anwendung von Tiermodellen als Goldstandard. Die Eingliederung von in vitro Modellsystemen in standardisierte Testverfahren scheitert oft an der Verfügbarkeit validierter, verlässlicher und reproduzierbarer Methoden. Demnach ist kein standardisiertes in vitro Testverfahren beschrieben, das die komplexen dreidimensionalen Gewebsstrukturen während einer Fremdkörperreaktion abbildet und sich zur Testung über längere Kontaktphasen zwischen Blutkomponenten und Biomaterialien eignet. Jedoch können in vitro Testungen kosten- und zeiteffizienter sein und durch die Anwendung humaner Zellen eine höhere Übertragbarkeit auf den Menschen aufweisen. Zusätzlich adressiert die Präferenz zu in vitro Testmethoden den Aspekt „Reduzierung“ der 3R-Prinzipien „Replacement, Reduction, Refinement“ (Ersatz, Reduzierung, Verbesserung) von Russel und Burch (1959) zu einer bewussten und begründeten Anwendung von Tiermodellen in der Wissenschaft. Ziel von diesem Forschungsvorhaben war die Entwicklung von humanen in vitro Modellsystemen, die den Kontakt zu Blutkomponenten sowie die Reaktion des umliegenden Bindegewebes bei lokaler Implantation eines Biomaterials abbilden. Referenzmaterialien, deren Gewebsantwort nach Implantation in Tiere oder den Menschen bekannt ist, dienten als Validierungskriterium für die entwickelten Modellsysteme. Die Anreicherung von Zellen sowie die Bildung extrazellulärer Matrix in der Wundumgebung stellen wichtige Teilprozesse während einer Fremdkörperreaktion dar. Für beide Teilprozesse konnte in einem indirekten zellbasierten Modellsystem der Einfluss einer zellvermittelten Konditionierung wie die Freisetzung von löslichen Mediatoren durch materialadhärente Makrophagen auf die gerichtete Wanderung von Fibroblasten sowie den Umbau eines dreidimensionalen Bindegewebsmodells aufgezeigt werden.
Des Weiteren ließ sich das Freisetzungsprofil von Zytokinen durch materialständige Makrophagen unter verschiedenen Testbedingungen wie der Kontamination mit LPS, der Oberflächenbehandlung mit humanem Blutplasma und der Gegenwart von IL-4 bestimmen. Die anschließende vergleichende statistische Modellierung der generierten komplexen multifaktoriellen Datenmatrix ermöglichte die Übersetzung in eine Biomaterialbewertung. Dieses entwickelte Testverfahren eignete sich einerseits zur Validierung von in vitro Testbedingungen sowie andererseits zur Bewertung von Biomaterialien. Darüber hinaus konnte in einem dreidimensionalen Fremdkörpermodell die komplexe dreidimensionale Struktur der extrazellulären Matrix in einer Wunde durch die Kombination unterschiedlicher Zell- und Matrixkomponenten biomimetisch nachgebaut werden. Diese neuartigen dreidimensionalen Fremdkörpermodelle ermöglichten die Testung von Biomaterialien über längere Testphasen und können in anschließenden Studien angewandt werden, um dynamische Prozesse zu untersuchen. Zusammenfassend konnten in dieser Arbeit drei unterschiedliche Teststrategien entwickelt werden, die (I) die Bewertung von Teilprozessen ermöglichen, (II) die Identifizierung verlässlicher Testbedingungen unterstützen und (III) biomimetisch ein Wundgewebe abbilden. Wesentlich ist, dass biomimetisch ein dreidimensionales Gewebemodell entwickelt werden konnte, das eine verlässliche Unterscheidungskapazität zwischen Biomaterialien aufweist.